Vetweefsel (AT) is een site van intense immuun cel activatie en interactie. Vrijwel alle cellen van het immuunsysteem aanwezig zijn in AT en hun verhoudingen worden veranderd door obesitas. Goede isolatie, kwantificering en karakterisering van AT immuuncelpopulaties zijn van cruciaal belang voor het begrijpen van hun rol in immunometabolic ziekte.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De ontdekking van verhoogde macrofaag infiltratie in het vetweefsel (AT) zwaarlijvige knaagdieren en mensen heeft geleid tot een intensivering van belang immuuncel bijdrage aan de lokale en systemische insulineresistentie. Isolatie en kwantificering van verschillende immuuncelpopulaties in magere en zwaarlijvige AT is nu een algemeen gebruikte techniek immunometabolism laboratoria Nog uiterste voorzichtigheid geboden zowel in stromale vasculaire cel isolatie en in de flowcytometrie-analyse, zodat de verkregen gegevens betrouwbaar en interpreteerbaar . In deze video laten we zien hoe je gehakt, verteren, en isoleren van de immuun cel-verrijkte stromale vasculaire fractie. Vervolgens laten we zien hoe antilichaam label macrofagen en T-lymfocyten en hoe goed gate op hen in flowcytometrie experimenten. Vertegenwoordiger flowcytometrie percelen van vetarm gevoede mager en vetrijke gevoede zwaarlijvige muizen worden verstrekt. Een essentieel element van deze analyse is het gebruik van antilichamen die welniet fluoresceren in kanalen waar AT macrofagen van nature autofluorescent, alsmede het gebruik van de juiste compensatie controles.
Inleiding
Historisch gezien, heeft het vetweefsel (AT) is bekeken als een inerte orgaan van lipide opslag, die uit en krimpt in reactie op de energiebalans. We begrijpen nu dat AT staat voor een dynamische endocrien orgaan dat actief scheidt een aantal hormonen, die rechtstreeks van invloed eetgedrag en systemische glucose-homeostase. Bovendien, de afgelopen tien jaar is er een toenemende appreciatie voor vele populaties van immuuncellen die in de AT stromale vasculaire fractie (SVF), en hun bijdrage aan AT homeostase.
De mogelijkheid om het scheiden AT adipocyten en SVF met een collagenase digestie gevolgd door differentiële centrifugatie werd eerst beschreven door Rodbell in 1964 1. Collagenase II wordt het meest gebruikt voor adipocyten en SVF scheiding vanwege onderhoud van adipocyten insulinereceptoren 1. Vroeg op, enzymatische fractionering van AT werd voornamelijk gebruikt om adipo studerenCyte metabolisme en preadipocytes isoleren. Meer recent is deze techniek, in combinatie met de ruime beschikbaarheid van flowcytometers en de steeds toenemende aantal commercieel beschikbare fluorofoor-geconjugeerde antilichamen, vergemakkelijkt de karakterisering van AT immuuncellen.
Hoewel de aanwezigheid van immuuncellen in ontstoken AT eerder beschreven 2, de rudimentaire papers door Weisberg et al.. en Xu et al.. gepubliceerd in 2003 waren de eerste om de accumulatie van AT macrofagen (ATM) in obesitas, waarbij inflammatoire cytokines uitscheiden en correleren met AT-specifieke en systemische insulineresistentie 3,4 documenteren. Deze waarnemingen diende als basis van een nieuw gebied van onderzoek onlangs bedacht, "immunometabolism," 5 en werden opgevolgd door studies wat impliceert diverse immuuncelpopulaties, waaronder dendritische cellen 6, mestcellen 7, T-cellen 8 -10, B-cellen 11, NKT cellen 12, 13 eosinofielen en neutrofielen 14,15 in de ontwikkeling van obesitas geassocieerd insulineresistentie.
Het doel van dit artikel is een gedetailleerde beschrijving van de collagenase digestie techniek om cellen van het AT SVF isoleren en karakteriseren geldautomaten en AT T cellen via flowcytometrie verschaffen. Dit protocol is geoptimaliseerd voor muis AT, maar kunnen kijkers genieten van het lezen van een uitstekend artikel verstrekken van uitgebreide informatie over optimalisatie van deze techniek voor menselijke AT 16. De doelgroep van dit artikel bevat de onderzoekers met een beperkte ervaring in het werken met de muis AT en het uitvoeren van flowcytometrie. Een aantal praktische overwegingen voor het balanceren van cellulaire opbrengst en rentabiliteit, tijd en middelen worden verstrekt, alsmede een optimale flowcytometrie controles gepresenteerd voor het karakteriseren van AT immuuncelpopulaties. In aanvulling op ons protocol, lezers zijn referred een recent artikel van Jupiter Basu et al.. een goede bespreking van enkele van de technische aspecten van flowcytometrie passende controles en vergoedingen 17 omvatten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Reagentia en benodigdheden
Voorafgaand aan de behandeling van dit experimenteel protocol, de voorbereiding van de volgende reagentia:
- 70% ethanol
- 1X PBS
- 1X DPBS (zonder Ca en Mg) aangevuld met 0,5% BSA
- FACS buffer: 1X DPBS (zonder Ca en Mg), 2 mM EDTA en 1% FCS
- ACK buffer: 150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO3, en 0,1 mM Na 2 EDTA in water
2. Oogst en bereiding van Vetweefsel
- Euthanaseren muizen volgens IACUC-goedgekeurde procedures van elke instelling.
- Goed nat de vacht met 70% ethanol.
- Maak een insnijding op het niveau van het zwaardvormig proces (onderste deel van het borstbeen) en open de borstholte om het hart bloot te leggen, zorg ervoor dat u geen grote bloedvaten te verbreken.
Opmerking: Op dit punt is het ook nuttig om zoveel als het membraan intact te latenmogelijk en een inkeping snijden van de rechterkant van de ribbenkast om bloed te laten en perfusaat te stromen van de borstholte.
- Klem de rechterboezem om bloed te laten en perfusaat om de bloedsomloop te ontsnappen.
Opmerking: Bij de behandeling van obese muizen, overtollige pericardiale AT moet mogelijk worden verwijderd om toegang tot het hart mogelijk te maken.
- Pak het hart met een tang en steek voorzichtig een naald in de linker ventrikel via de apex. Langzaam perfuseren de muis met 15 ml steriele PBS.
Opmerking: Verminder de snelheid van de perfusie als de longen beginnen te vullen en uit te breiden.
- Open de buikholte en verwijder de perigonadal vetkussentjes met zorg aan elke gonadale weefsels te voorkomen.
- Plaats vetkussentjes in een weeg boot op het ijs met 2 ml 1X DPBS (zonder Mg of Ca) aangevuld met 0,5% BSA, en gehakt de AT in fijne stukjes.
NB: Beperk de hoeveelheid AT per weeg boot naar 1,2 g. Indien het bedrag van AT dan 1,2 g, verdeel het gelijkmatig tussen twee wegen boten.
- Houd AT monsters op ijs en bereiden 3 ml collagenase analyseoplossing per AT steekproef bestaande uit 1X DPBS aangevuld met 0,5% BSA, 10 mM CaCl2, en 4 mg / ml collagenase, type II.
3. Collagenase Spijsvertering
- Overdragen AT tot 50 ml conische buizen door het gieten van het homogenaat en spoelen de wegen boot met 1 ml DPBS (0,5% BSA) en 3 ml collagenase II analyseoplossing.
- Incubeer AT homogenaat in een roterende schudinrichting (200 opm) bij 37 ° C gedurende 20 minuten.
- Voeg 10 ml DPBS (0,5% BSA) om conische buizen en plaats op ijs.
- Vermaal gelijkmatig verdelen en vele malen met behulp van een 10 ml serologische pipet, en passeren celsuspensies door 100 urn filter in een nieuwe 50 ml conische buis.
- Centrifugeer celsuspensie bij 500 xg gedurende 10 min bij 4 & deg; C.
- Decanteer supernatant en resuspendeer SVF cel pellet in 3 ml ACK buffer te lyseren verontreinigende erytrocyten.
- Voeg 12 ml FACS buffer en centrifugeer celsuspensie bij 500 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Decanteer supernatant en resuspendeer SVF cel pellet in FACS-buffer.
Opmerking: Gebruik de omvang van de celpellet als leidraad voor hoeveel FACS buffer resuspenderen inch Als de celpellet omvat de bodem van de 50 ml conische buis, gebruikt 0,5-1 ml FACS buffer; anders resuspendeer in 0.25-0.5 ml.
- Leg monsters op ijs en bereiden 1:10 verdunning aliquots van elk monster voor tellen van cellen door het mengen 40 pi FACS-buffer, 50 pi trypan blauwe oplossing (0,2%) en 10 pi celsuspensie.
- Telling levensvatbare cellen op basis van trypan blauw exclusie en verdunde celsuspensies tot een eindconcentratie van 5-10 x 10 6 cellen / ml.
4. Kleuring van celoppervlak antigenen
- Voeg anti-muis CD16/CD32 antilichaam (Fc blok) tot een uiteindelijke concentratie van 0,5-1 ug/10 6 cellen en incubeer op ijs gedurende 10 minuten.
- Transfer monsters (≥ 10 6 cellen) tot 12 x 75 mm polystyreen ronde bodem buizen. Maak afzonderlijke buizen of analyseren geldautomaten en T-cellen, en combineer extra cellen om een voldoende aantal buizen bereiden op de vereiste compensatie gewijzigde fluorescentie min een (FMO) controles tegemoet.
Opmerking: Als voorbeeld, bij de berekening van het percentage geldautomaten basis F4/80 en CD11b, de volgende compensatie en FMO controles moeten worden bereid:
- Ongekleurde (cellen)
- DAPI of propidiumjodide (PI) enkele vlek (cellen; niet levensvatbaarheid kleurstof toe totdat punt 5.1)
- F4/80 APC enkele vlek (cellen of compensatie kralen)
- CD11b FITC enkele vlek (cellen ofcompensatie kralen)
- FMO 1 (cellen): Rat IgG2a κ isotypecontrole APC + CD11b FITC + levensvatbaarheid kleurstof (toegevoegd in stap 5.1)
- FMO 2 (cellen): F4/80 APC + Rat IgG2b κ isotype controle FITC + levensvatbaarheid kleurstof (toegevoegd in stap 5.1)
- Voeg fluorofoor geconjugeerde primaire antilichamen en / of isotype controles aan de geschikte concentratie (zie tabel van reagentia en materialen).
- Bescherm tegen licht monsters en incuberen bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
- Voeg 2 ml FACS buffer en centrifugeer celsuspensie bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Decanteer supernatant en resuspendeer SVF cel pellet in 2 ml FACS buffer.
- Centrifugeer celsuspensie 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en resuspendeer SVF celpellet in ≥ 400 ul FACS-buffer.
- Overdragen monsters tot 12 x 75 mm polystyreen ronde bodem buizen voorzien van een 35 um cel zeef buis tops.
- Beschermen tegen licht, en bewaar monsters bij 4 ° C tot FACS-analyse.
Opmerking: Voor optimale resultaten immeadiately cellen worden geanalyseerd, maar FACS analyse met dit protocol met succes uitgevoerd op gelabelde cellen opgeslagen in FACS buffer gedurende 1-2 uur bij 4 ° C. Als cellen moeten worden bevestigd aan opslagtijd verhogen, beschrijfbaar cellen met 2% paraformaldehyde bij 4 ° C worden vastgesteld voor 24 uur voorafgaand aan FACS-analyse. Antilichaam bedrijven suggereren dat gelabelde cellen kunnen worden bewaard gedurende een week, maar dit niet binnen het kader van deze procedure getest.
5. FACS analyse
- Voorafgaand aan FACS-analyse, voeg levensvatbaarheid kleurstof aan samples en adequate controles om te zorgen voor levende / dode discriminatie cel.
Opmerking: Tal levensvatbaarheid kleurstoffen zijn commercieel verkrijgbaar, maar DAPI en PI aanbevolen naargelang de excitatie / emissie profiles van het fluorofoor-geconjugeerde antilichamen gebruikt. DAPI en propidiumjodide toegevoegd aan elk monster bij een eindconcentratie van 0,2 mg / ml.
- Gebruik een ongekleurde negatieve controle monster, bij voorkeur cellen geïsoleerd uit hetzelfde weefsel als de experimentele monsters, om zijwaartse verstrooiing (SSC) en voorwaartse verstrooiing (FSC) aan te passen, zodat de cel populatie (s) van belang zijn op schaal.
Opmerking: Voor de analyse van AT SVF-cellen, is het aanbevolen dat SSC worden weergegeven in een log-schaal versus FSC in een lineaire schaal. Het gebruik van een log-schaal SSC is vooral belangrijk bij het analyseren geldautomaten, vaak zeer groot en korrelig.
- Teken een eerste lichtverstrooiing poort op basis van het type cel (s) wordt geanalyseerd, en pas de fotomultiplicatorbuis (PMT) winst, zodat de ongekleurde cellen zijn aan de linkerkant van een single-parameter histogram (ongeveer gecentreerd op 10 2) voor de juiste kanalen.
Opmerking: Het wordt aanbevolen om lymfocyten en macrofagen (of andere myeloïde cellen) afzonderlijk geanalyseerd door verschillen in autofluorescentie.
- Gebruik enkele gebrandschilderde controles of antilichaam-capture compensatie kralen om multi-color compensatie uit te voeren.
Opmerking: het gebruik van de compensatie korrels wordt aanbevolen, maar moet verenigbaar elk antilichaam worden gewaarborgd. Bijvoorbeeld compensatie korrels kunnen geen kruisreactie met konijn antilichamen, waarbij geïsoleerde cellen van een passend enkele vlek zeggenschap verkrijgen.
- Stel experimentele poorten op basis van gemodificeerde FMO controles.
- Stel de flowcytometer het juiste aantal gebeurtenissen gebaseerd op de prevalentie van de bevolking plaats verzamelt en registreert experimentele data.
- Export FCS gegevensbestanden voor offline analyse. Er zijn tal van programma's beschikbaar voor flow cytometry data-analyse. Wij raden Cytobank, een web-based platform waarmee investigatores opslaan en analyseren van gegevens en het genereren van afbeeldingen vanaf elke computer met toegang tot internet 18. Daarnaast Cytobank biedt de mogelijkheid om gegevens publiek toegankelijk te maken of toegang tot medewerkers te beperken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Collagenase digestie van AT gevolgd door differentiële centrifugering werd gebruikt om de SVF isoleren van epididymale vetkussentjes van mannelijke C57BL/6J muizen een laag vetgehalte (10% kcal vet) of hoog vetgehalte (60% kcal vet) dieet (LFD en HFD respectievelijk) gedurende 16 weken. Cellen van de SVF werden vervolgens gemerkt met fluorofoor geconjugeerde primaire antilichamen het percentage levensvatbare geldautomaten (figuur 1) en AT T-cellen (figuur 2) via FACS analyse kwantificer...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Toenemende interesse in de functie van het immuunsysteem in de metabole gevolgen van obesitas heeft geleid tot het wijdverbreide gebruik van flowcytometrie om immune cellen van de AT karakteriseren. Hoewel het exacte protocol zal variëren tussen laboratoria op basis van hun eigen ervaring en beschikbare apparatuur, de kritische stappen omvatten collagenase spijsvertering, differentiële centrifugatie, en celoppervlakantigeen etikettering. Het doel van dit artikel is om een gedetailleerd protocol en praktische gids voor...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Wij hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
JSO wordt ondersteund door een NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040), wordt AK ondersteund door een Postdoctoraal Fellowship van de American Diabetes Association (7-10-MI-05), en AHH wordt ondersteund door een American Heart Association Established Investigator Award (12EIA8270000). Flow cytometrie experimenten werden uitgevoerd in de VMC flowcytometrie gedeelde bronnen. De VMC flowcytometrie gedeelde middelen wordt ondersteund door de Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DPBS (geen Ca of Mg) 10 x 500 ml | Life Technologies | 14190-250 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| BSA | Sigma | A2153-100G | |
| collagenase | Sigma | C6885-5G | |
| propidium jodide oplossing | Sigma | P4864-10 ml | |
| stable stack 20 microliter | Rainin | SS-L10 | |
| 20 microliter filter tips | Rainin | SRL10F | |
| stable stack 250 microliter tips | Rainin | SS-L250 | |
| 1000 microliter tips | Rainin | GPS-L1000 | |
| 1000 microliter filter tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 250 microliter Filter Tips | Rainin | SR-L200F | |
| FC Block | BD Biosciences | 553142 | |
| fisher 100mn zeefjes | Fisherbrand | 22-363-549 | |
| medium weegschaal | Fisherbrand | 02-202B | |
| aluminiumfolie | Fisherbrand | 1213100 | |
| snijtang | Fisherbrand | 089531B | |
| Vortex | Fisherbrand | 2215365 | |
| 50 ml kegelbuisjes | BD Falcon | 14-959-49A | |
| filter top FACS buisjes | BD Falcon | 352235 | |
| 10 ml pipetdoos 200 | BD Falcon | 1367520 | |
| buisjes met ronde bodem | BD Falcon | 352058 | |
| 5 ml injectiespuit | BD Falcon | 309646 | |
| V Bodemplaten | Costar | 07-200-107 | |
| transfer bulb pipette | Thermo Scientific | 13-711-22 | |
| Shaker | Thermo Scientific | 11 676 071 | |
| Zelfklevende mat | Thermo Scientific | 1368750 | |
| Cell Cultuur Centrifuge | Sorvall | 75253839 | |
| Adapters | Sorvall | 75003723 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Concentratie: 0,5 - 1 µg/ 106 cellen |
| Rat anti-mouse F4/80 | eBioscience | 17-4801 | Fluorophore conjugaat: APC Concentratie: 0,2 µg/ 106 cellen Isotype control catalogusnummer: 17-4321 |
| Rat anti-mouse CD11b | eBioscience | 11-0112 | Fluorophore conjugaat: FITC Concentratie: 0,5 µg/ 106 cellen Isotype control catalogusnummer: 11/1/4031 |
| Armenian Hamster anti-mouse CD11c | eBioscience | 12-0114 | Fluorophore conjugaat: PE Concentratie: 0,8 µg/ 106 cellen Isotype control catalogusnummer: Dec-88 |
| Goat anti-mouse MGL1/2 | R&D Systems | FAB4297P | Fluorophore conjugaat: PE Concentratie: 0,1 µg/ 106 cellen Isotype control catalogusnummer: IC108P |
| Goat anti-mouse CD206 | R&D Systems | FAB2535P | Fluorophore conjugaat: PE Concentratie: 0,1 µg/ 106 cellen Isotype control catalogusnummer: IC108P |
| Rat anti-mouse CCR2 | R&D Systems | FAB5538P | Fluorophore conjugaat: PE Concentratie: 0,1 µg/ 106 cellen Isotype control catalogusnummer: IC013P |
| Armenian Hamster anti-mouse TCRα | BD Biosciences | 553174 | Fluorophore conjugaat: APC Concentratie: 0,2 µg/ 106 cellen Isotype control catalogusnummer: 553956 |
| Rat anti-mouse CD8a | BD Biosciences | 552877 | Fluorophore conjugaat: PE-Cy7 Concentratie: 0,8 µg/ 106 cellen Isotype control catalogusnummer: 552784 |
| Rat anti-mouse CD4 | BD Biosciences | 557956 | Fluorophore conjugaat: Alexa Fluor 700 Concentratie: 0,2 µg/ 106 cellen Isotype control catalogusnummer: 557963 |
Tabel 1. Lijst van materialen en reagentia. |
Referenties
- Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).
- Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue. Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).
- Weisberg, S. P., et al. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1796-1808 (2003).
- Xu, H., et al. Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1821-1830 (2003).
- Mathis, D., Shoelson, S. E. Immunometabolism: an emerging frontier. Nature Reviews. Immunology. 11, 81(2011).
- Stefanovic-Racic, M., et al. Dendritic cells promote macrophage infiltration and comprise a substantial proportion of obesity-associated increases in CD11c+ cells in adipose tissue and liver. Diabetes. 61, 2330-2339 (2012).
- Liu, J., et al. Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice. Nature Medicine. 15, 940-945 (2009).
- Feuerer, M., et al. Lean, but not obese, fat is enriched for a unique population of regulatory T cells that affect metabolic parameters. Nature Medicine. 15, 930-939 (2009).
- Nishimura, S., et al. CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity. Nature Medicine. 15, 914-920 (2009).
- Winer, S., et al. Normalization of obesity-associated insulin resistance through immunotherapy. Nature Medicine. 15, 921-929 (2009).
- Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610-617 (2011).
- Wu, L., et al. Activation of invariant natural killer T cells by lipid excess promotes tissue inflammation, insulin resistance, and hepatic steatosis in obese mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109. , 1143-1152 (2012).
- Wu, D., et al. Eosinophils sustain adipose alternatively activated macrophages associated with glucose homeostasis. Science. 332, 243-247 (2011).
- Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding. Journal of Lipid Research. 49, 1894-1903 (2008).
- Talukdar, S., et al. Neutrophils mediate insulin resistance in mice fed a high-fat diet through secreted elastase. Nature Medicine. 18, 1407-1412 (2012).
- Hagman, D. K., et al. Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing. Journal of Immunological Methods. 386, 50-59 (2012).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546(2010).
- Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Current Protocols in Cytometry. Chapter 10, Unit 10(2010).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100, e47-e57 (2007).
- Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45, 194-205 (2001).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
