Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Afleiden van de Time Cursus van Glutamaat Clearance met een Deconvolutie Analyse van astrocyten Transporter Currents

10.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50708

⸱

7 augustus 2013

 , 
1Synaptic Physiology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een analysemethode om de levensduur van glutamaat schatten op astrocytaire membranen van elektrofysiologische opnames van glutamaat transporter stromingen in astrocyten.

Samenvatting

De hoogste dichtheid van glutamaat transporters in de hersenen wordt gevonden in astrocyten. Glutmaattransporters paar de beweging van glutamaat door het membraan met de co-transport van 3 Na + en 1 H + en de contra-transport van 1 K +. De stoichiometrische huidige gegenereerd door het transport proces kan worden bewaakt met whole-cell patch-clamp opnamen van astrocyten. Het tijdsverloop van de opgenomen stroom wordt gevormd door het tijdsverloop van de glutamaatconcentratie profiel die astrocyten worden blootgesteld, de kinetiek van glutamaattransporters en de passieve eigenschappen van elektrotone astrocytaire membranen. Hier beschrijven we de experimentele en analytische methoden die kunnen worden gebruikt om glutamaattransporter stromen in astrocyten registreren en isoleren het tijdsverloop van glutamaat toestemming van alle andere factoren die de vorm van de golfvorm van astrocytaire transporter stromen. De hier beschreven methoden kunnen worden gebruikt om een ​​schatting van de levensduur of flash-Uncaged en synaptically-uitgebracht glutamaat bij astrocytaire membranen in elke regio van het centrale zenuwstelsel tijdens gezondheid en ziekte.

Inleiding

Astrocyten een van de meest voorkomende soorten cellen in de hersenen met stervormige morfologie en fijne membraan uitsteeksels die zich uitstrekken over de hele neuropil en bereiken naburige synaptische contacten 1,2. Celmembraan van de astrocyten 'is boordevol glutamaat transporter moleculen 3. Onder fysiologische omstandigheden glutmaattransporters snel glutamaat binden aan de extracellulaire zijde van het membraan en overbrengen naar het cel cytoplasma. Door dit te doen, de vervoerders te handhaven lage de basale concentratie van glutamaat in de extracellulaire ruimte 4. Glutamaat transporters in fine astrocytaire processen grenzend aan synapsen prikkelende zijn ideaal gepositioneerd om glutamaat vrijkomt tijdens synaptische gebeurtenissen als het verspreidt weg van de synaptische spleet te binden. Door dit te doen, de vervoerders beperken ook glutamaat spillover naar peri-en extra-synaptische regio's en op naburige synapsen, het verminderen van de ruimtelijke verspreiding van prikkelende signaals in de hersenen 5-7.

Glutamaat transport is een elektrogene proces stoichiometrisch gekoppeld met de beweging van 3 Na + en H + 1 langs hun elektrochemische gradiënt en de contra-transport van 1 K + 8. Glutamaat transport wordt geassocieerd met (maar niet stoichiometrisch gekoppeld aan) een anionisch geleidbaarheid permeabel voor SCN - (thiocyanaat)> NO 3 - (nitraat) ≈ ClO 4 - (perchloraat)> I -> Br -> Cl -> F -, niet tot CH 3 SO 3 - (methaansulfonaat) en C 6 H 11 O 7 - (gluconaat) 9-11. Beide stromingen (stoichiometrische en niet-stoichiometrische) kan worden opgenomen door het verkrijgen van whole-cell patch-clamp opnamen van astrocyten, visueel geïdentificeerd onder Dodt verlichting of voor infrarode differentieel interferentie contrast (IR-DIC) in acute hersenplakjes 12. De stoichiometrische component van de huidige in verband met glutamaat transport over het membraan kan worden geïsoleerd door CH 3 SO 3 -, of C 6 H 11 O 7 - gebaseerde intracellulaire oplossingen en kunnen worden opgeroepen door flash-uncaging glutamaat op astrocyten 13,14, of door het activeren van glutamaat afgifte van naburige synapsen, die elektrisch 12 of met een gerichte optogenetic controle.

Het tijdsverloop van de stoichiometrische component van de huidige transporteur wordt gevormd door de levensduur van de glutamaatconcentratie profiel op astrocyten membranen (bijvoorbeeld glutamaat klaring), de kinetiek van glutmaattransporters, passief membraan eigenschappen van astrocyten en tijdens synaptische stimulaties de synchroniciteit van de afgifte van glutamaat in de geactiveerde synapsen 13. Hier beschrijven we in detail: (1) een experimentele approach de stoichiometrische component van glutamaattransporter stromen van whole-cell patch-clamp van astrocyten in acute muis hippocampale plakken als voorbeeld experimenteel isolaat preparaat, (2) een benadering tot de tijdsduur van glutamaat klaring ontlenen deze opnamen 13, 14. Deze werkwijzen kunnen worden gebruikt voor het opnemen en analyseren glutamaattransporter stromen van astrocyten in gebieden van het centrale zenuwstelsel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Slice Voorbereiding

  1. Bereid 500 ml snijden / storage oplossing die (in mM): 119 NaCl, 2,5 KCI, 0,5 CaCl2, 1,3 MgSO4 · 7H 2 O, 4 MgCl2, 26.2 NaHCO3 1 NaH 2 PO 4 en 22 glucose, 320 mOsm, pH 7,4
  2. Gebruik een bekerglas van 250 ml een onderdompeling kamer voor te bereiden op de schijfjes, vul het met 200 ml slicing / storage-oplossing, opwarmen in een waterbad bij 34 ° C en bel het met 95% O 2, 5% CO 2.
  3. Houd de resterende slicing / storage oplossing in een glazen fles bij 4 ° C.
  4. Gebruik een cyanoacrylaat lijm op een klein agar blok (6%, bereid in ACSF) bevestigen op de vibratome monsterhouder en bewaard bij 4 ° C.
  5. 30 min voor aanvang van snijden, plaatst u de glazen flacon met het snijden / storage-oplossing in een emmer gevuld met ijs en bel het met 95% O 2, 5% CO 2.

Let op: snelheid en precisie zijn van essentieel belang voor de dissectie stappen hieronder beschreven.

  1. Verdoven van de muis (P14-21, C57BL / 6) met halothaan / isofluraan (isofluraan is gemeld aan astrocytaire opname glutamaat verbeteren 15), onthoofden, en dompel de kop in een bekerglas van 50 ml bevat zuurstofrijk, koude slicing / storage-oplossing.
  2. Voer de dissectie van de hersenen op ijs omwikkeld met papieren handdoeken en opgeslagen bij -20 ° C.
  3. Gebruik een scalpel om een ​​mid-sagittale incisie in de huid aan de dorsale zijde van het hoofd te maken, van de frontale aan het caudale einde, en bloot de schedel.
  4. Plaats de onderste schaarblad van een klein paar van chirurgische schaar in de occipitale opening en maak twee sneden, naar links en aan de rechterkant (hoek van 45 °).
  5. Snijd de schedel langs de mid-sagittale lijn, van de staartwervels tot de frontale einde.
  6. Verwijder de hersenen met een spatel en dompel het in zuurstofrijk, koude slicing / opslag solutiop.
  7. Met een scalpel, maken vijf bezuinigingen op: (1) Verwijder de olfactorische bollen en de frontale cortex, (2) verwijder de kleine hersenen, (3) verwijder de linker-en (4) rechter temporale kwabben; (5) scheiden de twee hersenhelften met een mid-sagittale snede.
  8. Dep de twee delen van de hersenen met papieren handdoeken om alle overmaat oplossing te verwijderen.
  9. Lijm het mantelvlak van elke sectie hersenen naar de koude vibratome voetplaat de dorsale kant van de hersenen moet naar de vibratome blade, de ventrale kant van de hersenen moet in contact met de agar blok verwijderd van de vibratome mes.
    Opmerking: de hoogste kwaliteit segmenten verkrijgen, is het belangrijk dat de twee delen van de hersenen stevig vastgelijmd aan de vibratome basisplaat. Om dit te doen, gebruik dan een cyanoacrylaat lijm die is niet te vloeibaar en die niet droogt te snel uit.
  10. Beveilig de vibratome bodemplaat om het ontleden kamer, zet de slice steickness tot 250 urn en aanpassen van de breedte van het blad run. Ga verder met snijden.
    Opmerking: Als alles goed georiënteerd is, dient de vibratome te snijden parasagittal segmenten van de dorsale en ventrale richting van de mediale naar de zijkant van de hersenen.
  11. Als het mes door de cortex en de hippocampus is gepasseerd, gebruik een scalpel aan de cortex / hippocampus van de middenhersenen gesneden en leg elke plak in de onderdompeling kamer bij 34 ° C.
  12. Gooi de eerste paar plakjes. Meestal kan 12 plakjes (250 micrometer dik) worden verkregen uit een P14-21 hersenen van muizen.
  13. Houd de schijfjes bij 34 ° C gedurende 30 minuten en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur gedurende 30 minuten voordat ze voor de elektrofysiologie opnames.

2. Astrocyten Identificatie en Recordings

  1. Bereid een interne oplossing die (in mM): 120 KCH 3 SO 3, 10 EGTA, 20 HEPES, 2 MgATP, 0,2 NaGTP,5 QX-314Br en 5 NaCl, 290 mOsm, pH 7,2.
  2. Bereid een extracellulaire oplossing die (in mM): 119 NaCl, 2,5 KCI, 2,5 CaCl2, 1,3 MgSO4 · 7H 2 O, 1 MgCl2, 26.2 NaHCO3 1 NaHPO 4 en 22 glucose, 300 mOsm, pH 7,4 , verzadigd met 95% O2, 5% CO2.
  3. Voeg de volgende geneesmiddelen de extracellulaire oplossing, tot activering van gluA, Glun, mGluRII, mGluRIII, GABA A GABA B en A1 adenosine receptoren (in uM) blokkeert: 10 2,3-dioxo-6-nitro-1, 2,3,4-tetrahydrobenzo [ƒ] chinoxaline-7-sulfonamide dinatriumzout (NBQX), 10 (RS) -3 - (2-carboxypiperazin-4-yl)-propyl-1-fosfonzuur (CPP), (2S )-2-Amino-2-[(1S, 2S)-2-carboxycycloprop-1-yl] -3 - (Xanth-9-yl) propaanzuur-natriumzout (LY341495), 100 (R, S)-α- methylserine-O-fosfaat (SOIC), 100 picrotoxine, 5 3 - [[(3,4-dichloorfenyl) methyl] amino] propyl] diethoxymethyl) fosfinzuur (CGP52432), 18-cyclopentyl-1 ,3-dipropylxanthine (DPCPX).
  4. Stel de temperatuur van de oplossing in de extracellulaire opname kamer, typisch temperaturen tussen 34 - 36 ° C.
  5. Bereid patch-clamp elektroden van borosilicaatglas haarvaten (R ≈ 2,5 MQ) met een dual-stage, glazen micro-pipet trekker.
  6. Neem een ​​van de plakjes en leg deze in de opname kamer. Houd deze ingedrukt met een metalen harp gemaakt met platina draad en nylon snaren.
  7. Inspecteer de sneetjes onder Dodt verlichting of IR-DIC. Astrocyten kunnen worden geïdentificeerd door hun kleine cellichaam (Ø = 10 urn) en prominente nucleus (Figuur 1).
  8. Voor synaptische stimulaties, plaats een bipolaire RVS electrode, ~ 100 micrometer uit de buurt van de astrocyten die u van plan bent om te patchen.
  9. Patchen van de astrocyten en breken in het whole-cell configuratie door het toepassen van een zeer zachte zuigkracht.
    Opmerking: Astrocytes hebben meestal een lage input resistance (~ 10 MQ), hyperpolarized rustmembraanpotentiaal (~ -90 mV), en geen vuren activiteit. De astrocyten worden bewaard in de rust membraanpotentiaal gedurende de experimenten in de voltage-clamp-modus (dwz de houdstroom moeten lezen 0 pA). Vóór elke stimulatie, wordt een 10 ms hyperpolarizing spanning stap (-3 mV) gebruikt om de serie en input weerstand van de astrocyten te controleren.
  10. Gooi de opnamen als de serieweerstand veranderingen> 20% of indien de membraanpotentiaal van de astrocyt wordt gedepolariseerd. De membraanpotentiaal van de astrocyt direct worden gemeten door het overschakelen van voltage-clamp bij lopende-clamp modus. Alternatief, terwijl in voltage-clamp mode, de membraanpotentiaal kan worden gevolgd door het lezen van de waarde van de met potentieel resulteert in 0 pA houdstroom.
  11. Als synaptische stimulaties in dienst zijn, afwisselend enkele en gekoppelde stimuli (bv. 100 msec uit elkaar), elke 10 - 20 sec.
  12. Voor UV fotolyse experimouders, sluit u een uncaging Xe lamp aan de epifluorescente poort van de microscoop en voeg de gekooide verbinding aan de extracellulaire oplossing. Transporter stromingen van ~ 100 pA amplitude kan worden verkregen bij het ​​flash-uncaging 100 uM MNI-L-glutamaat in het hele gezichtsveld (Ø = 662,5 urn bij het ​​gebruik van een 40x doelstelling 14). Alternate stimulaties met het lichtpad open en geblokkeerde, elke 10 - 20 sec.
  13. Roepen glutamaat transiënten en opnemen transporter stromen onder controle condities en in aanwezigheid van een sub-verzadigende concentratie van de breed-spectrum glutamaattransporter antagonist D, L-threo-β-Benzyloxyaspartic acid (TBOA, 10 uM) aan de transporteur stroomamplitude verminderen ten minste 30% van de controlewaarde (zie hoofdstukken 4, 5) of in de aanwezigheid van een hoge concentratie TBOA (50 - 100 uM) aan transporter stromen volledig te blokkeren en te isoleren +-stroom de aanhoudende K (zie sectie 3) .

3. Pharmacsche Isolatie van de Sustained K +-stroom

  1. Noteer astrocytaire stromen onder controle condities en in aanwezigheid van een hoge, verzadigende concentratie TBOA (50 - 100 uM).
  2. Gemiddeld ten minste 20 veegt TBOA (50 - 100 uM).
  3. Breng de gemiddelde sporen verkregen in 3.2 met de functie:
    figure-protocol-1
    Opmerking: de TBOA-ongevoelige component (dwz degene die is opgenomen in de aanwezigheid van TBOA (50 - 100 uM)) vertegenwoordigt +-stroom de aanhoudende K. Het tijdsverloop hiervan wordt benaderd door de mono-exponentiële functie hierboven beschreven.
  4. Herhaal deze fit over verschillende astrocyten en ontlenen een gemiddelde waarde van Τ stijging (dwz de gemiddelde stijgtijd van de aanhoudende K +-stroom (zie paragraaf 5)).

4. Ikvertroosting van het vereenvoudigde Gedeelte van synaptically-Activated Transporter Currents (fSTCs)

  1. Gemiddeld ten minste 20 sweeps verkregen met gepaarde stimulaties, in controle omstandigheden en in TBOA (10 uM) (Figuur 2a links).
  2. Gemiddeld een identiek aantal sweeps verkregen met enkele stimulaties, in controle omstandigheden en in TBOA (10 uM) (Figuur 2a midden).
  3. Vergelijk de amplitude van de gemiddelde stroom reactie op de -3 mV spanning stap in de vier sporen gemiddelde (control pulslengte control gepaarde pulsen TBOA pulslengte TBOA gepaarde pulsen).
  4. Als de amplitude van de huidige reactie is hetzelfde in alle vier de sporen, gaat u naar stap 4.7.
  5. Indien de amplitude van de gemiddelde stroom respons verschillend in elk van de vier sporen of alle afzonderlijke sporen dient te worden opgenomen in het gemiddelde.
  6. Indien de amplitude van de gemiddelde stroom verschilt in elk van de vier sporen, maar individu sporen geschikt worden opgenomen in de gemiddelde, toe dat op elk spoor van de grootte van de FSTC schalen lineair met de grootte van de huidige reactie op de testspanning stap. Als dit het geval is, schalen alle sporen ten opzichte van elkaar zodat de stroom reacties op de testspanning stap allemaal gelijk in amplitude.
    Opmerking: In de opname-omstandigheden hier beschreven (dwz intracellulair CH 3 SO 3 - of C 6 H 11 O 7 -), synaptische stimulatie van prikkelende axonen genereren astrocytaire stromingen met complexe golfvormen bestaande uit een snel stijgende voorbijgaande innerlijke stoichiometrische stroom en een langzame -stijgende, opgelopen naar binnen K +-stroom reflecterende K + re-evenwicht in de extracellulaire ruimte na actiepotentiaal voortplanting langs naburige axonen. Het is cruciaal om deze aanhoudende K verwijderen +-stroom, als elke reststroom zou leiden tot eenoverschatten van glutamaat leven.
  7. Trek de gemiddelde trace verkregen met enkele prikkeling van de gemiddelde trace verkregen met gepaarde prikkeling (Figuur 2a rechts). Deze stap maakt het isoleren van de stoichiometrische en de aanhoudende K +-stroom opgewekt door de tweede stimulus.
  8. Verschuiving van de gemiddelde trace met enkele stimulaties verkregen door een tijdsinterval dat overeenkomt met het interval tussen pulsen gebruikt om gepaarde-pulsen (dwz 100 msec) (Figuur 2b) te leveren.
  9. Trek de tijd verschoven gemiddelde respons verkregen met enkele prikkeling van de gemiddelde respons op de tweede stimulus verkregen in 4.7 (figuur 2c). Deze stap isoleert het vergemakkelijkt gedeelte van de vervoerder huidige opgeroepen door de tweede stimulus (de FSTC).
  10. In de meeste gevallen, de vorige stap verwijdert volledig de aanhoudende K +-stroom. Als dit het geval is, de isolatie van de FSTC is voltooid en u kunt proceed met de deconvolution analyse en ontlenen het tijdsverloop van glutamaat klaring van astrocyten. In sommige gevallen echter, een kleine aanhoudende K +-stroom is nog steeds aanwezig is (figuur 2d) en verdere analyse nodig is (zie hoofdstuk 5).
    Opmerking: vergeet niet dat het in 4,7-4,10 beschreven analyses moeten worden uitgevoerd op de gemiddelde sporen verkregen in controle omstandigheden en in TBOA (10 uM).

5. Aftrekken van de resterende zdustained K +-stroom van fSTCs

  1. Meet de amplitude van de aanhoudende K +-stroom overblijft na het uitvoeren van de in hoofdstuk 4 beschreven analyse.
  2. Schaal de amplitude van de mono-exponentiële functie 3.3 de amplitude van de resterende aanhoudende K +-stroom gemeten in 5.1 (figuur 2d links en midden). Om dit te doen, in vergelijking 3.3, stelt de term A is gelijk aan de amplitude van de aanhoudende K +-stroom measured in 5.1 en de term Τ stijging is gelijk aan de gemiddelde waarde van Τ stijging geraamd in 3.4.
  3. Trek de resulterende mono-exponentiële functie van de FSTC en aanhoudende K +-stroom verkregen in 4.10 (figuur 2d rechts). Deze stap voltooit het isolement van de FSTC.

6. Isolatie van Flash-geactiveerde Transporter Currents (FTCs)

  1. Gemiddeld ten minste 20 sweeps verkregen met het licht pad geopend, in controle omstandigheden en in TBOA (10 uM).
  2. Gemiddeld een identiek aantal sweeps verkregen met het lichtpad gesloten, in controle omstandigheden en in TBOA (10 uM).
  3. Vergelijk de amplitude van de stroom reactie op de -3 mV spanning stap in de vier sporen gemiddelde (control pulslengte control gepaarde pulsen TBOA pulslengte TBOA gepaarde pulsen).
  4. Als de amplitude van de huidige reactie is hetzelfde in alle vier de sporen, gaat u naar stap 6.7.
  5. Als de amplitude van de gemiddelde stroom respons verschillend in elk van de vier sporen of alle afzonderlijke sporen dient te worden opgenomen in het gemiddelde.
  6. Indien de amplitude van de gemiddelde stroom verschilt in elk van de vier sporen, maar alle individuele sporen geschikt worden opgenomen in de gemiddelde, toe dat op elk spoor van de lichtbundel lineair opent de grootte van de FTC schalen met de grootte van de huidige reactie op de testspanning stap. Als dit het geval is, schalen alle sporen ten opzichte van elkaar zodat de stroom reacties op de testspanning stap allemaal gelijk in amplitude.
    Opmerking: in de opnameomstandigheden hier beschreven (dwz intracellulair CH 3 SO 3 - of C 6 H 11 O 7 -), flash stimuli genereren astrocytaire stromingen alleen bestaat uit het snel stijgende voorbijgaande stoichiometrische innerlijke stroom.
  7. Trek de gemiddelde trace verkregen met het licht path geblokkeerd uit de gemiddelde trace verkregen met het lichtpad geopend. Deze stap maakt het verwijderen van de stimulus artefact en het isoleren van de FTCs.
    Opmerking: de in 6.7 beschreven analyses moeten worden uitgevoerd op de gemiddelde sporen verkregen in controle omstandigheden en in TBOA (10 uM).

7. Deconvolution analyse

  1. Breng de transporteur huidige (FSTC of FTC) opgenomen in controle omstandigheden (figuur 3a links) en in TBOA (10 uM) (Figuur 3a rechts) en geïsoleerde zoals beschreven in paragraaf 4 - 6, met de multi-exponentiële functie:
    figure-protocol-2
  2. Maak een ogenblikkelijk stijgende functie die vergaat mono-exponentieel afhankelijk van de functie:
    figure-protocol-3
    endie het beste de rottende fase van de vervoerder huidige opgenomen in TBOA (10 uM) (Figuur 3b).
    Opmerking: de functie 7,2 (ie H (t)) beschreven geeft het tijdsverloop van glutamaat klaring van astrocyten in aanwezigheid van TBOA (10 uM).
  3. Deconvolve de mono-exponentiële functie verkregen 7,2 (figuur 3b en 3c midden) van de fit van de huidige transporteur opgenomen TBOA (10 uM) verkregen 7,1 (fig. 3a rechts, links c).
    Opmerking: deconvolutie is een wiskundige bewerking opgenomen in vele analyse software pakketten zoals (bv. Matlab, Python). In IgorPro, de programmeercode die we doorgaans gebruiken om dergelijke analyses uit te voeren, de deconvolutie bewerking efficiënt worden berekend zoals hieronder beschreven, door discrete Fourier transformaties. Gebruik eerst de FFT operatie om de di berekenenscrete snelle Fourier-transformatie van het mono-exponentiële functie verkregen in 7.2 en de pasvorm van de huidige transporteur opgenomen in TBOA verkregen 7.1. Vervolgens gebruikt de IFFT operatie om de inverse discrete snelle Fourier transformatie van de verhouding van de twee functies FFT berekenen. De resulterende functie I (t) kan als volgt worden omschreven:
    figure-protocol-4
    De in stap 7.3 beschreven kan afleiden van de filter van de huidige transporteur in TBOA (10 uM) (figuur 3c rechts). Het filter vertegenwoordigt de vervorming factoren die de levensduur van glutamaat te converteren in astrocytic membranen in de transporter huidige geïsoleerd in secties 4-6 (dwz de FSTC of FTC).
  4. Deconvolve het filter (figuur 3c rechts, figuur 3d midden) van de fit van de transporter stroom in controle omstandigheden (figuur 3a links, figuur 3d links).
    Opmerking: deze stap kan afleiden van het tijdsverloop van glutamaat klaring van astrocyten in controle omstandigheden (figuur 3d rechts). De veronderstelling achter deze deconvolution stap is dat het tijdelijke profiel van het filter ongewijzigd blijft in controle omstandigheden en in TBOA (10 uM).
  5. Een kwantitatieve schatting van de totale tijdsverloop van glutamaat verklaring te verkrijgen, berekent het zwaartepunt () van de golfvorm verkregen in stap 7.4. Dit wordt gedaan door berekening als:
    figure-protocol-5
    waarin G (t) is de golfvorm verkregen in stap 7.1. In de hierboven beschreven vergelijking, de term t is de tijdspanne waarover het raam integraal berekend.
    Opmerking: wanneer de methode voor het eerst werd vastgesteld, werd berekend over tijdvensters die overgebleven waren ongedwongen 13. Deze benadering kan worden gebruikt zolang als het venster integratie wordt ingesteld groter dan de duur van glutamaat en de goedkeuring golfvorm vervalt weer helemaal baseline. Indien dit niet het geval is, deze wijze van schatten ontmoet enkele beperkingen. Als bijvoorbeeld de golfvorm speling niet precies terug wegsterft basislijn, dan toeneemt met de breedte van het venster integratie. Om potentiële bron van onnauwkeurigheid van de schatting van voorkomen, berekenen we nu het over een tijdsinterval dat overeenkomt met 10% van de piek van de huidige transporteur, vóór en na het begin 14. De laatste benadering verbetert de consistentie waarmee wordt gemeten over cellen. Dit is handig vooral bij de analyse van kleine effecten van farmacologische behandelingen op het tijdsverloop van klaring.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het succes van de analytische benadering hier beschreven kritisch is afhankelijk van het verkrijgen van hoge kwaliteit elektrofysiologische opnames van transporter stromen van astrocyten in elke regio van het centrale zenuwstelsel. In acute muis hippocampale plakken, kan astrocyten gemakkelijk worden geïdentificeerd onder Dodt verlichting of IR-DIC vanwege hun kleine cellichaam (Ø = 10 micrometer) en prominente nucleus (Figuur 1). De onderscheidende stervormige morfologie worden gesteld met epifluoresce...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Een experimentele benadering voor elektrofysiologische opnames te verkrijgen van astrocyten Hier beschrijven wij, een analytisch protocol om glutamaattransporter stromingen isoleren in astrocyten en een wiskundige methode voor het afleiden van het tijdsverloop van glutamaat klaring van astrocytische transporter stromingen.

Het succes van de analyse is gebaseerd op de mogelijkheid om hoge-kwaliteit patch clamp verkrijgen van astrocyten en de nauwkeurigheid van de fitting algoritme gebruikt om...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke Intramurale Research Program (NS002986). AS schreef het manuscript en geïmplementeerd de deconvolutie analyse. JSD ontwikkelde de eerste versie van de deconvolutie analyse en commentaar op de tekst.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CGP52432Tocris1246
(R,S)-CPPTocris173
DPCPXTocris439
LY341495 disodium zoutTocris4062
MSOPTocris803
NBQX disodium zoutTocris1044
D,L-TBOATocis1223
PicrotoxinSigmaP1675
MNI-L-glutamaatTocris1490
Alexa 594Life TechnologiesA10438Optioneel
Matrix elektrodenFrederick Haer CompanyMX21AES(JD3)
Borosilicaatglas capillairenWorld Precision InstrumentsPG10165-4
Dubbele glazen micro-pipet trekkerNarishigePC-10
Loctite 404 instant kleefstofTed Pella46551
Xe lampRapp OptoElectronicFlashMic
Igor Pro 6Wavemetrics

Referenties

  1. Ventura, R., Harris, K. M. Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes. J. Neurosci. 19, 6897-6906 (1999).
  2. Witcher, M. R., Kirov, S. A., Harris, K. M. Plasticity of perisynaptic astroglia during synaptogenesis in the mature rat hippocampus. Glia. 55, 13-23 (2007).
  3. Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
  4. Herman, M. A., Jahr, C. E. Extracellular glutamate concentration in hippocampal slice. J. Neurosci. 27, 9736-9741 (2007).
  5. Arnth-Jensen, N., Jabaudon, D., Scanziani, M. Cooperation between independent hippocampal synapses is controlled by glutamate uptake. Nat. Neurosci. 5, 325-331 (2002).
  6. Barbour, B. An evaluation of synapse independence. J. Neurosci. 21, 7969-7984 (2001).
  7. Rusakov, D. A., Kullmann, D. M. Extrasynaptic glutamate diffusion in the hippocampus: ultrastructural constraints, uptake, and receptor activation. J. Neurosci. 18, 3158-3170 (1998).
  8. Zerangue, N., Kavanaugh, M. P. Flux coupling in a neuronal glutamate transporter. Nature. 383, 634-637 (1038).
  9. Eliasof, S., Jahr, C. E. Retinal glial cell glutamate transporter is coupled to an anionic conductance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4153-4158 (1996).
  10. Wadiche, J. I., Amara, S. G., Kavanaugh, M. P. Ion fluxes associated with excitatory amino acid transport. Neuron. 15, 721-728 (1995).
  11. Wadiche, J. I., Kavanaugh, M. P. Macroscopic and microscopic properties of a cloned glutamate transporter/chloride channel. J. Neurosci. 18, 7650-7661 (1998).
  12. Bergles, D. E., Jahr, C. E. Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes. Neuron. 19, 1297-1308 (1997).
  13. Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J. Neurosci. 25, 2906-2916 (2005).
  14. Scimemi, A., Tian, H. Neuronal transporters regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus. J. Neurosci. 29, 14581-14595 (2009).
  15. Zuo, Z. Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells. Neuroreport. 12, 1077-1080 (2001).
  16. Barbour, B., Brew, H., Attwell, D. Electrogenic uptake of glutamate and aspartate into glial cells isolated from the salamander (Ambystoma) retina. J. Physiol. 436, 169-193 (1991).
  17. Bergles, D. E., Tzingounis, A. V., Jahr, C. E. Comparison of coupled and uncoupled currents during glutamate uptake by GLT-1 transporters. J. Neurosci. 22, 10153-10162 (2002).
  18. Diamond, J. S., Jahr, C. E. Synaptically released glutamate does not overwhelm transporters on hippocampal astrocytes during high-frequency stimulation. J. Neurophysiol. 83, 2835-2843 (2000).
  19. Benediktsson, A. M., et al. Neuronal activity regulates glutamate transporter dynamics in developing astrocytes. Glia. 60, 175-188 (2012).
  20. Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4411-4416 (2008).
  21. Scimemi, A., Meabon, J., Woltjer, R. L., Sullivan, J. M., Diamond, J. S., Cook, D. G. Amyloidβ1-42 slows clearance of synaptically-released glutamate by mislocalizing astrocytic GLT-1. J. Neurosci. 33, 5312-5318 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Whole-cell patch-clampTBOA-antagonistsynaptische stimulatiepreparatie van hersensnijplatenelektrofysiologische registratiesisolatie van transporterstroomflash-uncaged glutamaat
Afleiden van de Time Cursus van Glutamaat Clearance met een Deconvolutie Analyse van astrocyten Transporter Currents
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.