Afleiden van de Time Cursus van Glutamaat Clearance met een Deconvolutie Analyse van astrocyten Transporter Currents

Summary

We beschrijven een analysemethode om de levensduur van glutamaat schatten op astrocytaire membranen van elektrofysiologische opnames van glutamaat transporter stromingen in astrocyten.

Abstract

De hoogste dichtheid van glutamaat transporters in de hersenen wordt gevonden in astrocyten. Glutmaattransporters paar de beweging van glutamaat door het membraan met de co-transport van 3 Na ⁺ en 1 H ⁺ en de contra-transport van 1 K ^+. De stoichiometrische huidige gegenereerd door het transport proces kan worden bewaakt met whole-cell patch-clamp opnamen van astrocyten. Het tijdsverloop van de opgenomen stroom wordt gevormd door het tijdsverloop van de glutamaatconcentratie profiel die astrocyten worden blootgesteld, de kinetiek van glutamaattransporters en de passieve eigenschappen van elektrotone astrocytaire membranen. Hier beschrijven we de experimentele en analytische methoden die kunnen worden gebruikt om glutamaattransporter stromen in astrocyten registreren en isoleren het tijdsverloop van glutamaat toestemming van alle andere factoren die de vorm van de golfvorm van astrocytaire transporter stromen. De hier beschreven methoden kunnen worden gebruikt om een ​​schatting van de levensduur of flash-Uncaged en synaptically-uitgebracht glutamaat bij astrocytaire membranen in elke regio van het centrale zenuwstelsel tijdens gezondheid en ziekte.

Introduction

Astrocyten een van de meest voorkomende soorten cellen in de hersenen met stervormige morfologie en fijne membraan uitsteeksels die zich uitstrekken over de hele neuropil en bereiken naburige synaptische contacten ^1,2. Celmembraan van de astrocyten 'is boordevol glutamaat transporter moleculen ^3. Onder fysiologische omstandigheden glutmaattransporters snel glutamaat binden aan de extracellulaire zijde van het membraan en overbrengen naar het cel cytoplasma. Door dit te doen, de vervoerders te handhaven lage de basale concentratie van glutamaat in de extracellulaire ruimte ^4. Glutamaat transporters in fine astrocytaire processen gr....

Protocol

1. Slice Voorbereiding

1. Bereid 500 ml snijden / storage oplossing die (in mM): 119 NaCl, 2,5 KCI, 0,5 _CaCl2, 1,3 _MgSO4 · 7H ₂ O, 4 _MgCl2, 26.2 _NaHCO3 1 NaH ₂ PO ₄ en 22 glucose, 320 mOsm, pH 7,4
2. Gebruik een bekerglas van 250 ml een onderdompeling kamer voor te bereiden op de schijfjes, vul het met 200 ml slicing / storage-oplossing, opwarmen in een waterbad bij 34 ° C en bel het met 95% O _2, 5% CO _2.
3. Houd de resterende slicing / storage oplossing in een glazen fles bij 4 ° C.
4. Gebruik een cyanoacrylaat lijm op een klein agar blok (....

Results

Het succes van de analytische benadering hier beschreven kritisch is afhankelijk van het verkrijgen van hoge kwaliteit elektrofysiologische opnames van transporter stromen van astrocyten in elke regio van het centrale zenuwstelsel. In acute muis hippocampale plakken, kan astrocyten gemakkelijk worden geïdentificeerd onder Dodt verlichting of IR-DIC vanwege hun kleine cellichaam (Ø = 10 micrometer) en prominente nucleus (Figuur 1). De onderscheidende stervormige morfologie worden gesteld met epifluoresce.......

Discussion

Een experimentele benadering voor elektrofysiologische opnames te verkrijgen van astrocyten Hier beschrijven wij, een analytisch protocol om glutamaattransporter stromingen isoleren in astrocyten en een wiskundige methode voor het afleiden van het tijdsverloop van glutamaat klaring van astrocytische transporter stromingen.

Het succes van de analyse is gebaseerd op de mogelijkheid om hoge-kwaliteit patch clamp verkrijgen van astrocyten en de nauwkeurigheid van de fitting algoritme gebruikt om.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CGP52432	Tocris	1246
(R,S)-CPP	Tocris	173
DPCPX	Tocris	439
LY341495 disodium salt	Tocris	4062
MSOP	Tocris	803
NBQX disodium salt	Tocris	1044
D,L-TBOA	Tocis	1223
Picrotoxin	Sigma	P1675
MNI-L-glutamate	Tocris	1490
Alexa 594	Life Technologies	A10438	Optional
Matrix electrodes	Frederick Haer Company	MX21AES(JD3)
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	PG10165-4
Dual-stage glass micro-pipette puller	Narishige	PC-10
Loctite 404 instant adhesive	Ted Pella	46551
Xe lamp	Rapp OptoElectronic	FlashMic
Igor Pro 6	Wavemetrics