Een snelle en efficiënte methode voor het beoordelen van pathogeniteit van Ustilago maydis op maïs- en teosintelijnen

Summary

Het gebruik van een naaldinjectiemethode om maïs- en teosinteplanten te enten met de biotrofe ziekteverwekker Ustilago maydis wordt beschreven. De inentingsmethode voor naaldinjectie vergemakkelijkt de gecontroleerde afgifte van de schimmelpathogenese tussen de bladeren van de plant waar de ziekteverwekker de plant binnenkomt door de vorming van appresoria. Deze methode is zeer efficiënt, waardoor reproduceerbare inentingen met U. maydis mogelijk zijn.

Abstract

Maïs is wereldwijd een belangrijk graangewas. Gevoeligheid voor biotrofe pathogenen is echter de primaire beperking om de productiviteit te verhogen. U. maydis is een biotrofe schimmelpathogene ziekteverwekker en het oorzakelijk agens van maïssmut op maïs. Deze ziekte is verantwoordelijk voor aanzienlijke opbrengstverliezen van ongeveer $ 1,0 miljard per jaar in de VS¹ Verschillende methoden, waaronder vruchtwisseling, fungicidetoepassing en zaadbehandelingen, worden momenteel gebruikt om maïssmut²te beheersen. Gastheerresistentie is echter de enige praktische methode voor het beheren van maïssmut. Identificatie van gewasgewassen, waaronder maïs, tarwe en rijst die resistent zijn tegen verschillende biotrofe pathogenen, heeft de opbrengstverliezen per jaar aanzienlijk verminderd^{met 3-5}. Daarom zou het gebruik van een pathogene inentingsmethode die de ziekteverwekker efficiënt en reproduceerbaar tussen de plantenbladeren levert, de snelle identificatie van maïslijnen die resistent zijn tegen U. maydisvergemakkelijken. Als, een eerste stap naar het identificeren van maïslijnen die resistent zijn tegen U. maydis, werd een naaldinjectie-inentingsmethode en een resistentiereactiescreeningsmethode gebruikt om maïs, teosinte en maïs x teosinte introgressielijnen te enten te selecteren met een U. maydis-stam en om resistente planten te selecteren.

Maïs, teosinte en maïs x teosinte introgressielijnen, bestaande uit ongeveer 700 planten, werden geplant, ingeënt met een stam van U. maydis, en gescreend op resistentie. De inentings - en screeningsmethoden identificeerden met succes drie teosintelijnen die resistent zijn tegen U. maydis. Hier wordt een gedetailleerd naaldinjectie-inentings- en resistentiereactiescreeningsprotocol voor maïs-, teosinte- en maïs x teosinte-introgressielijnen gepresenteerd. Deze studie toont aan dat naaldinjectie-inenting een onschatbaar hulpmiddel in de landbouw is dat U. maydis efficiënt tussen de plantenbladeren kan leveren en plantenlijnen heeft geleverd die resistent zijn tegen U. maydis die nu kunnen worden gecombineerd en getest in fokprogramma's voor verbeterde ziekteresistentie.

Introduction

Schimmelziekten van planten vormen een van de meest vooraanstaande bedreigingen voor de landbouw. De noodzaak om gewassen te ontwikkelen met een betere ziekteresistentie neemt toe als gevolg van de voedselbehoeften van een groeiende wereldbevolking. Plantenpathogenen infecteren van nature gewasplanten in het veld en veroorzaken ziekten die de gewasopbrengst negatief beïnvloeden⁶. Het is aangetoond dat het identificeren en gebruiken van resistente planten de weerstand kan verbeteren en het opbrengstverlies kan verminderen. Resistente cultivars zijn geïdentificeerd in veel plantensoorten, waaronder maïs, tarwe, rijst en sorghum door de planten te enten met een plantenpathogenen en te selecteren voor resistente lijnen⁷. Daarom zou de ontwikkeling en het gebruik van een efficiënte inentingsmethode het mogelijk maken om veel planten te enten en te screenen op resistentie. Verschillende inentingsmethoden zijn gebruikt, waaronder dip-inenting, het pipetten van de pathogene celsuspensiecultuur in de werveling van de plant en naaldinjectie-inenting^8-11. Bij elke methode moet de ziekteverwekker betrouwbaar worden geïntroduceerd tussen de bladeren van de plant waar de ziekteverwekker de plant binnenkomt door de vorming van appresoria om de ontwikkeling van pathogenen en planteninfectie te garanderen^12,13.

De dip-inentingsmethode omvat het onderdompelen van een plantenzaailingen in een pathogene celsuspensiecultuur, terwijl de pipetteermethode vereist dat de pathogene celsuspensiecultuur in de werveling van de plantenzaailingen wordt geplaatst. Er zijn echter problemen met beide methoden. Ten eerste zijn beide methoden afhankelijk van de natuurlijke beweging van de ziekteverwekker van het bladoppervlak naar het plantenweefsel, wat zeer variabel is. De meeste ziekteverwekkers komen van nature de plant binnen via stomatale openingen of wonden op het bladoppervlak van de plant. Er is echter een aanzienlijke variabiliteit in het vermogen van de pathogenen om het bladoppervlak van de plant door de huidmondjes en/of wonden op het bladoppervlak te penetreren. Daarom kan de penetratie van ziekteverwekkers niet worden gecontroleerd met een van beide inentingsmethodes die mogelijk leiden tot inconsistente gegevens. Ten tweede, bij het screenen van een groot aantal planten, kan het onderdompelen van de zaailingen in een pathogene celsuspensiecultuur tijdrovend zijn en het aantal planten beperken dat kan worden gescreend. Omgekeerd levert het hierin beschreven inentingsprotocol voor naaldinjectie de pathogene celsuspensiecultuur tussen de plantenbladeren die de vorming van appressoria^{vergemakkelijken 14}. De ziekteverwekker gebruikt vervolgens de nieuw ontwikkelde appressoria om de plant binnen te komen en het probleem van de penetratie van pathogenen te elimineren. Bovendien biedt het inentingsprotocol voor naaldinjectie een reeks fenotypes voor maïs- en teosinteplanten die zijn ingeënt met U. maydis en een goede infectie aantonen. De fenotypes kunnen worden gebruikt als een marker om de beste concentratie te bepalen voor de pathogene celsuspensiecultuur, wat resulteert in consistente plantenfenotypes binnen en tussen verschillende experimenten.

Na inenting van de plant met een pathogene celsuspensiecultuur worden planten meestal gescreend om een resistent of gevoelig fenotype^8-11,15te detecteren. Hoewel ziektebeoordelingsschalen op grote schaal worden gebruikt om plantenfenotypen te screenen en te classificeren, verschillen de beoordelingsschalen afhankelijk van de ziekteverwekker die wordt geanalyseerd. Daarom kan een protocol voor de beoordeling van ziekten voor U. maydis en maïsinteracties worden gebruikt voor vergelijkbare schimmelpathogenen¹⁶.

De huidige reeks protocollen beschrijft de inenting van naaldinjecties met een U. maydis celsuspensiecultuur en ziekteresistentiereactiescreening van maïs,teosinte en maïs x teosinte introgressielijnen. De huidige protocollen zijn niet beperkt tot naaldinjectie-inenting van U. maydis in maïsplanten, maar kunnen worden gebruikt voor relatief elke schimmelpathogene ziekteverwekker en plantensoort. Daarom zullen onderzoekers, door de details van beide methoden in hetzelfde protocol op te nemen, de protocollen voor inenting en screening direct kunnen gebruiken of de oorspronkelijke protocollen kunnen manipuleren om beter te passen bij de pathogene en plantensoorten van belang.

Protocol

1. Groei van plantaardig materiaal

1. Selecteer plantlijnen voor inenting en screening. Voor dit werk werden twee maïslijnen, vijf teosintelijnen en veertig maïs x teosintelijnen met een niet-gekarakteriseerde weerstand tegen U. maydis gebruikt (tabel 1).
2. Plant zaden voor experimentele(U. maydis injectie) en controle (water injectie) naald injectie inenting experimenten. Doe dit voor elke plantenlijn.
3. Plant vier zaden (repliceert) voor elke plantenlijn in kleine platten door de zaden ongeveer 1/2 inch met de vinger in de grond te duwen en lichtjes met aarde te bedekken (figuren 1A en 1B). Verpak de grond niet over het zaad. Het dieper planten van het zaad of het verpakken van de grond over het zaad kan problemen veroorzaken met het ontstaan van zaailingen.
4. Geef de zaden water in de grond. Zorg ervoor dat de grond doorweekt is en dat de zaden na het water geven onder de grond blijven.
5. Plaats planten na het water geven in een groeikamer met dag- en nachtomgevingen van respectievelijk 28/20 °C temperatuur en 14/10 uur fotoperiode en ongeveer 500 μmol/m² sec   fotosynthetisch actieve stralingen aan de bovenkant van de luifel. Houd de relatieve luchtvochtigheid overdag en 's nachts op respectievelijk ongeveer 70% en 90%.
6. Houd alle planten in dezelfde groeikamer om een groeiomgeving te behouden die congruent is tijdens het experiment.
7. Verwijder na 10 dagen de planten uit de groeikamer en enteculleer de planten met de U. maydis celsuspensiecultuur met behulp van een naaldinjectie-inentingsmethode. Opmerking: Maïsplanten kunnen 7 dagen na het planten^8-10worden ingeënt. De teosinteplanten zijn echter na 7 dagen te klein. Inenteer daarom zowel maïs- als teosinteplanten 10 dagen na het planten op consistentie binnen het experiment (zie stap 2.12).

2. Naald injectie inenting

1. Doe al het werk in een laminaire stromingskap. Verwijder U. maydis glycerolvoorraden uit de diepvriesopslag. Gebruik een steriele lus en streepglycerolbestanden van U. maydis wild-type stammen 1/2 (paringstype a1b1) en 2/9 (paringstype a2b2, bijna isogeen tot 1/2) op aardappel dextrose agar (PDA) platen. Houd stammen apart.
2. Plaats PDA-platen met U. maydis gedurende twee dagen in een incubator van 30 °C. Gebruik bij gebruik van een andere biotrofe ziekteverwekker de juiste stam-, media- en groeiomstandigheden. Controleer de groei van de ziekteverwekker gedurende de periode van twee dagen om ervoor te zorgen dat de U. maydis-stam goed groeit.
3. Verwijder de PDA-platen na twee dagen uit de incubator. De platen moeten een goede pathogene groei hebben en enkele kolonies bevatten (figuur 2A). Het is belangrijk om enkele kolonies te verkrijgen. Als er geen enkele kolonies aanwezig zijn, restreak de platen in een lagere concentratie.
4. Doe al het werk in een laminaire stromingskap. Gebruik een steriele tandenstoker om een enkele kolonie voor elke soort uit de PDA-platen te selecteren. Plaats de tandenstoker met een enkele kolonie in een aardappeldextrosebouillon (PDB) van 3 ml. Het wordt aangeraden om 2-3 culturen te hebben.
5. Plaats de 3 ml PDB-culturen gedurende twee dagen bij 200 tpm in een incubator/shaker van 30 °C. Monitor de groei van de cultuur over de periode van twee dagen om de groei van de cultuur te garanderen. De cultuur zou erg bewolkt moeten lijken.
6. Verwijder de vloeibare culturen uit de incubator/shaker en meet de concentratie op OD₆₀₀ om ervoor te zorgen dat de cellen werden gekweekt tot een OD van 1,0 (~1 x 10⁷ cellen/ml)¹⁷.
7. Breng de U. maydis celsuspensieculturen in een uiteindelijke concentratie van 1 x 10⁶ cellen/ml, met water in een laatste kweekvolume van 30 ml. Deze concentratie resulteert consequent in een goede infectie van de planten met de pathogene celsuspensiecultuur. ¹⁷

Opmerking: Verschillende celsuspensieconcentraties moeten worden getest bij het gebruik van verschillende pathogene stammen om de juiste celtiter te bepalen die nodig is voor inenting^18,19. De gegeven eindconcentratie voor de celsuspensiecultuur kan worden gebruikt als uitgangspunt voor tittering. De juiste concentratie van de pathogene celsuspensiecultuur moet worden geverifieerd door de fenotypen van de plant met een goede infectie te visualiseren (figuren 3A-E).

8. Meng gelijke volumes van de twee U. maydis stammen voorafgaand aan de inenting. Als u één ziekteverwekkerstam gebruikt, gaat u verder met stap 2.9. Bereid verse U. maydis celsuspensieculturen voor elk inentingsexperiment voor en gooi celsuspensieculturen na twee dagen weg.
9. Vul voor de experimentele naaldinjectie-inenting een spuit van 3 ml met de U. maydis-celsuspensiecultuur door de celsuspensiecultuur in de spuit te trekken.
10. Vul voor de injectie-inenting van de controlenaald een spuit van 3 ml met water¹⁷. Gebruik dezelfde procedure voor de experimentele naaldinjectie-inenting.
11. Bevestig een injectienaald van 0,457 mm x 1,3 cm aan het uiteinde van elke spuit van 3 ml. De geselecteerde naaldgrootte levert de celsuspensiecultuur tussen de plantenbladeren met minimale schade aan het plantenweefsel.
12. Verwijder de experimentele en controleplanten 10 dagen na het planten uit de groeikamer ter voorbereiding op naaldinjectie-inentingen (figuur 2B) (zie stap 1.7).
13. Steek voorzichtig de injectienaald met de U. maydis celsuspensiecultuur in de stengel van een experimentele plant onder een hoek van 90° net boven de grondlijn. Steek de naald in het midden van de steel. Duw de naald niet door de steel (figuur 2C).
14. Injecteer de experimentele plant met ongeveer 100 μl van de U. maydis cel suspensie cultuur^18,19. Dit zal enigszins variëren, afhankelijk van de hoogte van de zaailing. De celsuspensiecultuur duwt door de stengel en beweegt in de werveling van de plant. De celsuspensiecultuur zal zichtbaar zijn in de werveling van de plant. Blijf 100 μl van de celsuspensiekweek in elke afzonderlijke plant injecteren totdat de spuit van 3 ml leeg is.
15. Verwijder na de injectie voorzichtig de naald van de plantenstam. Verwijder de naald uit de nu lege spuit van 3 ml en vul met water. Bevestig de naald terug aan de spuit en duw het water door de naald om eventueel plantenweefsel te verwijderen dat in de naaldpunt kan worden gevangen.
16. Herhaal stap 2.9-2.15 voor elke experimentele installatie. Volg hetzelfde protocol voor de controle-installaties door water te injecteren.
17. Plaats de ingeënte experimentele en controleplanten terug in de groeikamer. Geef de planten dagelijks water door de grond nat te maken, niet het plantenweefsel.
18. Controleer de planten dagelijks om de ontwikkeling van ziekteverwekkers en resistentiereacties van planten te detecteren.

3. Screening van weerstandsreacties

1. Scoor en registreer de weerstandsreacties voor elke plant 7, 10, 14 en 21 dagen na inenting (dpi) met behulp van een 1 tot 5 weerstandsreactiebeoordelingsschaal. De ernst van de ziekte neemt toe naarmate de numerieke waarden op de beoordelingsschaal toenemen (tabel 2). Een weerstandsreactie van 1C (Bladchlorsis), 1A (Productie van anthocyanine van het blad) of 2 (kleine bladgalen) duidt op weerstand. Een weerstandsreactie van 3 (stengelgalen), 4 (basale gal) of 5 (plantensterfte) duidt op gevoeligheid (figuren 3A-E en tabel 2)^18,19.
2. Scoor zowel experimentele als controle-installaties en noteer weerstandsreacties.
3. Vergelijk de weerstandsreacties van de experimentele en controle-installaties. Selecteer experimentele planten met een weerstandsreactie van 1C, 1A of 2. Deze planten worden geacht resistent te zijn tegen U. maydis^18,19.
4. Herhaal het hele experiment om de fenotypes van de plant te verifiëren.

Results

Een succesvolle naaldinjectie-inenting kan worden bepaald door het fenotype van de met U. maydis ingeënte planten (experimenteel) te visualiseren. De meeste experimentele planten waren vatbaar voor U. maydis-infectie. De vatbare planten vertoonden een zeer ernstige ziekteontwikkeling die werd aangetoond door stam- en basale galvorming met zwarte teliosporen (figuren 3D en 3E, tabel 2). Verschillende planten waren dood na inenting vanwege de ernst van de...

Discussion

In deze studie was de naaldinjectie-inentingsmethode die werd gebruikt om een stam U. maydis in de stengel van 700 maïs- en teosinteplanten af te leveren succesvol. Bovendien werd een herziene ziekteresistentiebeoordelingsschaal gebruikt om de planten te screenen en de ontwikkeling van pathogenen te detecteren. Als gevolg van het gebruik van beide methoden werden plantenlijnen geïdentificeerd die resistent zijn tegen U. maydis onder 700 maïs- en teosinteplanten die nu kunnen worden gecombineerd en getes...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zaad voor planten			Verzameld uit originele kruisingen
Groeikamer	Conviron	PGR14 REACH-IN
Plantenbakken	Hummert International	14-3385-2
Grond (3 delen dennebast; 1 deel veenmos met perliet)	Hummert International	10-1059-2
Laminare stromingskast	Lab Conoco	70875372
Glycerol voorraad van pathogeen (U. maydis) of schimmelpathogeen van belang			Voorraden werden gekweekt uit originele cultuur
Steriele lus	Fisher Scientific	S17356A
Aardappeldextrose agar (PDA) platen	Fisher Scientific	R454311
Incubator ingesteld op 30 °C	Fisher Scientific	11-690-650F
Steriele tandenstokers	Walmart		Gekocht bij Walmart en gesteriliseerd door autoclaaf
Aardappeldextrose bouillon (PDB)	Fisher Scientific	ICN1008617
Incubator-schudler ingesteld op 30 °C	New Brunswick	14-278-179
Spectrofotometer	Fisher Scientific	4001000
U. maydis celsuspensiecultuur (1 x 106 cellen/ml)			Gegroeid uit glycerol voorraad zoals beschreven in de methoden
3 ml Spuiten	Becton Dickinson	309606
.457 mm x 1.3 cm Hypodermische naalden	Kendall Brands	8881250321