Method Article

Microarray-gebaseerde identificatie van individuele herv Loci Expression: Toepassing op Biomarker Discovery bij prostaatkanker

DOI:

10.3791/50713

⸱

November 2nd, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Joint Unit Hospices de Lyon-bioMérieux, 2Medical Diagnostic Discovery Department, BioMérieux, 3Department of Pathology and Cytology, Centre Hospitalier Lyon Sud, Hospices Civils de Lyon, 4Medical Faculty, Lyon 1 University, 5Data and Knowledge Laboratory, BioMérieux, 6Department of Biochemistry and Molecular Biology, Centre Hospitalier Lyon Sud, Hospices Civils de Lyon, 7Department of Urology, Centre Hospitalier Lyon Sud, Hospices Civils de Lyon

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke endogene retrovirussen (HERV), die 8% van het menselijk genoom bezet, behoudt schaarse coderende capaciteit maar honderdduizend lange terminale herhalingen (LTR). Een aangepaste Affymetrix microarray werd ontworpen om individuele herv locus expressie te identificeren en werd gebruikt op prostaatkanker weefsels als een proof of concept voor toekomstige klinische studies.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De prostaat-specifiek antigeen (PSA) is de belangrijkste diagnostische biomarker voor prostaatkanker gebruikt, maar het mist specificiteit en gevoeligheid, vooral bij weinig doseringswaarden 1. 'Hoe PSA gebruiken' blijft een actueel onderwerp, hetzij voor diagnose als een grijze zone overeenkomt met een concentratie in serum van 2,5-10 ng / ml die niet toelaat een duidelijk onderscheid worden gemaakt tussen kanker en noncancer 2 of patiëntfollow -up als analyse van post-operatieve PSA kinetische parameters kunnen aanzienlijke uitdagingen met zich meebrengen voor de praktische toepassing 3,4. Als alternatief, niet-coderende RNA's (ncRNAs) zijn in opkomst als de belangrijkste moleculen in kanker bij de mens, met de potentie om als nieuwe markers van de ziekte te dienen, bijvoorbeeld PCA3 bij prostaatkanker 5,6 en ongekarakteriseerde aspecten van de tumor biologie onthullen. Bovendien zijn de gegevens van het project CODEREN gepubliceerd in 2012 aangetoond dat verschillende RNA omvatten ongeveer 62% van het genome. Verder blijkt dat de hoeveelheid transcriptionele regelende motieven ten minste 4,5 x hoger dan hetgene voor eiwit coderende exons. Aldus, lange eindstandige herhalingen (LTR's) van humaan endogene retrovirussen (HERVs) vormen een groot aantal vermeende / kandidaat transcriptionele regulerende sequenties, omdat het de primaire functie van infectieuze retrovirussen. HERVs, die verspreid liggen over het menselijk genoom, afkomstig van voorouderlijke en onafhankelijke infecties in de kiem lijn, gevolgd door een copy-paste vermeerdering worden geïntegreerd en waarbij MultiCopy families bezetten 8% van het menselijk genoom (merk op dat exons overspannen 2% van ons genoom ). Sommige HERV loci uiting voor eiwitten die zijn geassocieerd met verschillende pathologieën waaronder kanker 7-10. We ontwierpen een hoge dichtheid microarray, in Affymetrix formaat doel optimaal karakteriseren individuele HERV loci expressie, om beter begrijpen of ze actief kunnen zijn, als ze rijden ncRNA transcriptie of modulate codering genexpressie. Deze methodologie werd toegepast prostaatkanker veld (figuur 1).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Human endogene retrovirussen (ook wel HERVs) liggen verspreid over ons genoom. Ze zijn afkomstig van voorouderlijke en onafhankelijke infecties in de kiem lijn, gevolgd door een copy-paste propagatie processen en leidt tot multicopy families. Vandaag zijn ze niet meer besmettelijk maar bezetten 8% van het menselijk genoom, als vergelijkingspunt, exons omvatten 2% van het menselijk genoom. Gegevens van het ENCODE project gepubliceerd in 2012 aangetoond dat verschillende RNA omvatten ongeveer 62% van het genoom, waarvan een derde intergene gebieden. Bovendien blijkt dat de hoeveelheid transcriptionele regelende motieven ten minste 4,5 x hoger dan hetgene voor eiwit coderende exons. HERVs long terminal repeats (LTR) vertegenwoordigen een breed scala van mogelijke transcriptionele regulerende elementen, zoals hun gebruikelijke functie infectieuze retrovirussen. Historisch, afgezien van enkele loci uitgedrukt in de placenta en testis, werd algemeen aangenomen dat HERV zwijgen door epigenetic regelgeving. Daarom hebben we een hoge dichtheid microarray, in Affymetrix formaat doel optimaal karakteriseren individuele HERV loci expressie, om beter te begrijpen of zij actief zijn, wanneer zij aandrijving lncRNA transcriptie of moduleren coderende genexpressie. Deze tool nagesynchroniseerde herv-V2 GeneChip integreert 23.583 herv probesets en kan 5573 verschillende herv elementen bestaat uit solo LTRs evenals volledige en gedeeltelijke provirussen (figuur 2) discrimineren.

Diagnose, Assessment, en Plan:

Diagnose van prostaatkanker gebaseerd op dosering van de prostaat specifiek antigeen (PSA) biomarker in klinisch laboratorium, een digitaal rectaal onderzoek morfologische verandering van de prostaat en tenslotte prostaatbiopsieën waargenomen door de patholoog evalueren. Het ontbreken van voldoende specificiteit en sensitiviteit tussen conventionele kanker biomarkers, zoals PSA voor prostaatkanker, is algemeen erkend after tientallen jaren van klinische implicaties 1. Aanvankelijk werd PSA voorgesteld voor de diagnose en behandeling van adenocarcinoom van de prostaat 11. Het laatste was voorgesteld kankeronderzoek en bewaken van de ontwikkeling van de ziekte 12. Er blijft echter een vraag die regelmatig wordt gesteld: 'hoe PSA gebruiken'. (I) Een grijze zone overeenkomt met een concentratie in serum van 2,5-10 ng / ml niet mogelijk een duidelijk onderscheid te maken tussen kanker en noncancer 2, (ii) twee grote cohort studies inschrijven honderdduizenden mensen in Europa USA geen duidelijke conclusie over het nut van screening qua ziektespecifieke mortaliteit 13,14 komen, (iii) analyse van postoperatieve PSA kinetische parameters zoals klaring PSA, PSA snelheid en verdubbelingstijd, hoewel eenvoudig in theorie, kan aanzienlijke uitdagingen in de praktische toepassing 3,4 opleveren. We kunnen verwachten dat in de komende jaren, biomarker appcaties zal een klinische keuze tussen een afwachtend beleid en meer of minder agressieve behandelingen, afhankelijk van de tumor fenotype ondersteunen. Met betrekking tot de diagnose gemaakt door de patholoog, een eerste beperkende factor is afkomstig van een 20% vals negatieve diagnose binnen prostaatbiopsieën (vele kankers worden gemist door bemonstering). Een tweede probleem heeft betrekking op de noodzaak voor een extra biopsie procedure na een negatieve, nadelige effecten kunnen presenteren.

Radicale prostatectomie is momenteel een van de standaard behandelingen voor prostaatkanker. Voorgesteld bij gezonde patiënten ouder 45-65 jaar, vooral bij agressieve patronen (Gleason 7 tot 10), multifocale tumor of voelbare tumor. Het wordt nu gedaan in onze afdeling met behulp van robot geassisteerde chirurgie. Vanwege het groeiende bewijs dat de moleculaire markers het grootste belang zal hebben in de komende jaren, hebben we besloten om aan al onze patiënten de mogelijkheid om deel te nemen aan een programma voor prostaatweefselbanken. Meer precies, het uitbreiden van moleculaire onderzoeksprogramma's op prostaatkanker hebben geleid tot een toenemende behoefte aan toegang tot hoogwaardige verse tumorweefsel na prostatectomie. Dit onderzoek, in het bijzonder de genomische benaderingen, vereist grote steekproeven van hoge DNA / RNA kwaliteit. Tumorale en naastgelegen niet tumorale 'weefsel van dezelfde patiënt nodig. Aanbevelingen voor het omgaan met en het verwerken van radicale prostatectomies zijn ontworpen om pathologische kenmerken die fase en marge status en daardoor mogelijk verdere behandeling en de prognose bepalen behouden. Geen vers weefsel bemonsteringsmethode, daarom niet latere pathologische evaluaties compromissen om tot de diagnose aanvaardbaar zijn. Macroscopische dissectie van de prostaat is moeilijk en moet veel aandacht worden besteed aan de marge weefsels en kapsel-invasie: elke dissectie voor prostaat bank moet altijd worden uitgevoerd door een getrainde uropathologist volgens een overeenkomstd protocol. De ethische commissie van de medische faculteit en de staat medische raad ingestemd met deze onderzoeken en geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle patiënten die in de prostaat weefsels bankieren.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Chirurgie

Na verwijdering van de chirurg, houdt de prostaat op ijs gehouden totdat belast door een patholoog.

2. Behandeling van prostaatweefsels

  1. Om de vertraging van perioperatieve ischemie respecteren, overdragen radicale prostatectomie monsters op ijs naar het laboratorium door het toegewijde personeel binnen 30 minuten na chirurgische ablatie. De vertraging van invriezen moet minder dan 20-30 min (figuur 3A) zijn.
  2. Weeg en vlekken op de prostaat volgens het gebruikelijke protocol (bijv. groen aan de rechterkant, zwart aan de linkerkant, zie figuren 3B en 3C).
  3. Voer een grote dwarsdoorsnede van de klier aan de posterieure zijde (Figuur 3D). Richt de prostaat en zet het op de voorste zijde. Voer een grote dwarsdoorsnede van de schroefdop op de achterste zijde een steriel chirurgisch mes.
  4. Ontleden stukjes weefsel van de overgangszone,links en rechts randgebieden, waarbij de marges intact (figuur 3E).
  5. Zet de kernen van weefsel in een Eppendorf buis, snap bevriezen en op te slaan in vloeibare stikstof (Figuur 3F). Als u niet het maken van biobank direct doorgaan met stap 2.7.
  6. Voer prostaat banking indien de totale lengte van kanker op biopten superieur is aan 10 mm. Gebruik een hechtdraad om de prostaat te sluiten en klier vervorming en minimale verstoring van de chirurgische marge (Figuur 3G) te voorkomen. Bevestig vervolgens de radicale prostatectomie specimen met formaline en embed in paraffine volgens de gebruikelijke procedure voor histologische analyse.
  7. Monteer bevroren weefsel kernen verticaal op een kleine heuvel van oktober en maak secties in een cryostaat. Neem een ​​eerste single 5 micrometer vriescoupe en vlekken met blauwe toluidine.
  8. Voer een snelle histologisch onderzoek naar de aard van het weefsel te analyseren (dwz. Goedaardig of kwaadaardig). Voor tumoraleweefsel, schat de hoeveelheden tumorcellen en selecteer alleen kernen met meer dan 80% van de tumorcellen.
  9. Vervolgens voert u een nieuwe single 5 micrometer vriescoupe en vlekken op het met hematoxyline, eosine en Safran. Snij vervolgens 15 secties x 30 micrometer en plaats deze in een RNAse vrij Eppendorf buis.
  10. Neem een ​​laatste 5 micrometer vriescoupe voor hematoxyline, eosine en Safran en vlekken op het aan de hoeveelheid tumorcellen beheersen aan het einde van de procedure.
  11. Zet de Eppendorf buis in droogijs en stuur het monster naar de moleculaire biologie laboratorium.

3. RNA-extractie, zuivering en kwaliteitscontrole

  1. Homogenisering. Voer homogenisering bij aanwezigheid van 1 ml Trizol/100 mg weefsel totdat het weefsel volledig wordt opgelost in oplossing. Voeg Trizol oplossing geleidelijk aan verder te gaan met zorg op het ijs met behulp van een hand-held molen. Eenmaal gehomogeniseerd, aliquot de oplossing voor Eppendorf buizen en laat in Trizol bij kamertemperatuur voorvijf minuten.
  2. Fasenscheiding. Voeg 300 ul chloroform (of 150 ul BCP/1.5 ml Trizol). Vortex 15 sec dan laat bij kamertemperatuur gedurende 2-3 minuten. Centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 15 min bij 2-8 ° C.
  3. RNA neerslag. Transfer voorzichtig de bovenste waterige fase naar een nieuwe buis. Voeg 750 ul isopropanol. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten (Schud door omkering). Incubeer 2 uur bij -19 ° C/-31 ° C. Centrifugeer de monsters bij 12.000 xg gedurende 30 min bij 2-8 ° C.
  4. RNA wassen en ophanging. Na het centrifugeren, verwijder het supernatant. Wassen RNA pellet met 1 ml 80% EtOH (voorzichtig achteruit de buizen). Centrifugeer monsters bij 7500 xg gedurende 10 minuten bij 2-8 ° C. Verwijder supernatant met behulp van P1000 en P10. Laat resterende EtOH aan de lucht drogen voor 2-3 minuten. Voeg 100 ul-RNase vrij water, overdracht buizen tot 70 ° C warmte-blok en laat zitten voor 2-3 minuten tot de pellet te ontbinden. Zet dan op ijs. Bewaren bij -19 ° C/-31 ° C voor de korte termijn opslag en -80 ° C voor lange termijn opslag.
  5. RNA zuivering. Zuiveren RNA met de RNeasy Mini Kit (Qiagen). In het kort, beginnen met het toevoegen van 350 ul buffer RLT aan de 100 pl RNA-monster en meng goed, volg de Qiagen procedure. Tot slot, neem een ​​3 ui (van 50 pl) hoeveelheid van het gezuiverde product voor kwaliteitscontroles (stap 3.6). Store RNA bij -19 ° C/-31 ° C gedurende korte termijn of bij -80 ° C voor een lange termijn opslag.
  6. RNA QC (Figuur 4A). Controleer de kwaliteit van RNA en RNA integriteit met een Bioanalyzer (Agilent) en een Nanodrop (Thermo), volgens de instructies van de fabrikant. Het RNA integriteit Number (RIN) wordt gebruikt om het RNA kwaliteit te beoordelen. In het bijzonder, slagen in de opsporing van 18S en 28S pieken wordt sterk aanbevolen om de monsters in verdere stappen te gebruiken.

4. WT-ovatie RNA Amplification

Aanbevelingen aan de versterking stappen met de WT-Ov voerenatie versterking kit in optimale omstandigheden:

  • Ren niet minder dan acht versterking monsters tegelijk te pipetteren nauwkeurigheid te garanderen. Dan, goed voor 1 hoeveelheid afval bij het opstellen mastermengsels dat een splitsing van de kit verlangen dat deze 3 partijen van 8 reacties.
  • Altijd ontdooide reagentia en reageerbuisjes op ijs, tenzij anders geïnstrueerd.
  • Gebruik alleen vers 80% ethanoloplossing voor zuivering.
  • Stop niet in elk stadium van het protocol.

  1. Verdun totaal RNA tot een concentratie van 25 ng / ul krijgen. Proces 2 pi van het verdunde monster.
  2. Bereid de Poly-A RNA spike-controle oplossing door een seriële verdunning van de Poly-A RNA De met poly-A controle Dilution Buffer (Affymetrix), een 1:25.000 verdunning mogelijk.

    Stap 1: First Strand cDNA Synthesis 4,3-4,8. De genoemde reagentia worden aangeduid door de leverancier als volgt: A1 (First Strand Primer Mix), A2 (First Strand Buffer Mix), A3 (First Strand Enzyme Mix).

  3. Ontdooi A1 en A2 bij kamertemperatuur. Meng met behulp van een vortex-mixer voor 2 seconden en draai gedurende 2 sec. Dan kunnen plaatsen op ijs. Plaats A3 op ijs.
  4. Zet 2 pi totaal RNA (50 ng) in een 0,2 ml PCR-buis en voeg 2 pl A1 (eindvolume: 4 pi). Kap en draai de buis voor 2 sec.
  5. Incubeer bij 65 ° C gedurende 5 minuten plaats de buis op ijs.
  6. Bereid de First Strand cDNA Master Mix als volgt (gegeven voor een enkele reactie). Meng door pipetteren en spin down de Master Mix kort. Onmiddellijk, plaats op het ijs.
    Reagens Volume
    First Strand Buffer Mix (A2) 5 pi
    Poly-A RNA Controle (1:25.000) 0,5 pl
    First Strand Enzyme Mix (A3) 0,5 pl
  7. 6 & # toevoegen181, l van de Master Mix aan het RNA /-Primer bevattende buis. Meng door de knop van de buis, draai 2 seconden en snel te plaatsen op ijs (eindvolume: 10 pl).
  8. Incubeer bij 4 ° C gedurende 1 min, vervolgens 25 ° C gedurende 10 min, vervolgens 42 ° C gedurende 10 minuten en vervolgens 70 ° C gedurende 15 minuten. Koel bewaren bij 4 ° C. Verwijder de reactie buis van PCR-apparaat, draai kort en blijf op ijs. Onmiddellijk verder met de tweede streng cDNA Synthesis stap.

    Stap 2: tweede streng cDNA Synthesis 4,8-4,12. De genoemde reagentia worden aangeduid door de leverancier als volgt: B1 (Tweede Strand Buffer Mix) en B2 (Second Strand Enzyme Mix).

  9. Spin down B2 en B3 2 sec en snel te plaatsen op ijs. Dooi B1 bij kamertemperatuur. Meng met behulp van een vortex-mixer voor 2 seconden, draai 2 seconden en snel te plaatsen op ijs.
  10. Bereid een tweede streng Master Mix als volgt (gegeven voor een enkele reactie). Meng door pipetteren en spin down de Master Mix brievliegen. Onmiddellijk, plaats op het ijs.
    Reagens Volume
    Tweede Strand Buffer Mix (B1) 9.75 pi
    Second Strand Enzyme Mix (B2) 0.25 pl
  11. Voeg 10 ul van de Master Mix elk First Strand reactiebuis. Meng door pipetteren 3x, rotatie 2 seconden en leg ze op ijs (eindvolume: 20 pi).
  12. Incubeer bij 4 ° C gedurende 1 min, vervolgens 25 ° C gedurende 10 min, vervolgens 50 ° C gedurende 30 minuten en vervolgens 70 ° C gedurende 5 minuten. Koel bewaren bij 4 ° C. Verwijder de reactie buis van PCR-apparaat, draai kort en blijf op ijs. Onmiddellijk verder met de Post-Tweede Strand Enhancement stap.

    Stap 3: Post-Tweede Strand Enhancement 4,13-4,15. De genoemde reagentia worden aangeduid door de leverancier als volgt: B1 (Tweede Strand Buffer Mix), B3 (Reaction Enhancement Enzym Mix).

  13. Bereid een Master Mix door het combineren van B1 en B3 Mix als volgt (gegeven voor een enkele reactie). Meng door pipetteren en spin down de Master Mix kort. Onmiddellijk, plaats op het ijs.
    Reagens Volume
    Tweede Strand Buffer Mix (B1) 1.9 pl
    Reactie Enhancement Enzym Mix (B3) 0,1 pl
  14. Voeg 2 pi van de Master Mix elke tweede streng reactiebuis. Meng door pipetteren 3x, rotatie 2 seconden en leg ze op ijs (eindvolume: 22 pl).
  15. Incubeer bij 4 ° C gedurende 1 min, vervolgens 37 ° C gedurende 15 minuten en vervolgens 80 ° C gedurende 20 minuten. Koel bewaren bij 4 ° C. Verwijder de reactie buis van PCR-apparaat, draai kort en plaats op ijs. Onmiddellijk verder met de SPIA Amplification stap.

    Stap 4: Enkele streng cDNA (sscDNA) synthese door SPIA procedure van 4.16 -4.19. De genoemde reagentia worden aangeduid door de leverancier als volgt: C1 (SPIA Primer Mix), C2 (SPIA Buffer Mix), C3 (SPIA Enzym Mix).

  16. Ontdooi de C1 en C2 bij kamertemperatuur. Meng met behulp van een vortex-mixer, spin-2 seconden en snel te plaatsen op ijs. Ontdooi C3 op ijs. Meng de inhoud door voorzichtig omkeren 5x. Zorg ervoor dat luchtbellen in te voeren. Dan draaien 2 seconden en leg ze op ijs.
  17. Bereid een SPIA-Master Mix, goed voor een volume van 0,5 afval, als volgt. Meng door pipetteren en spin down de Master Mix kort. Onmiddellijk, plaats op het ijs.
    Reagens Volume
    SPIA-Buffer Mix (C2) 5 pi
    SPIA-Primer Mix (C1) 5 pi
    SPIA-Enzym Mix (C3) 10 gl
  18. Voeg 20 ul van de SPIA Master Mix aan de Enhanced Tweede Strand Reaction tube. Meng door pipetteren 6-8x, spin en snel (uiteindelijk volume: 42 pi) te plaatsen op ijs.
  19. Incubeer bij 4 ° C gedurende 1 min, vervolgens 47 ° C gedurende 60 minuten en vervolgens 95 ° C gedurende 5 minuten. Koel bewaren bij 4 ° C. Haal de buis uit PCR-apparaat, draai kort en plaats op ijs.

5. sscDNA zuivering en kwaliteitscontrole

  1. sscDNA zuivering. Zuiveren sscDNA met de QIAquik PCR zuivering kit (Qiagen). In het kort, beginnen met het toevoegen van 200 ul buffer PB aan de 42 ul van versterkte cDNA product, mix en de belasting op de kolom. Volg dan de Qiagen procedure. Tot slot, neem een ​​3 ui (van de 30 pl) monster van de sscDNA gezuiverde product voor kwaliteitscontroles (stap 5.2).
  2. sscDNA opbrengst en de grootteverdeling verificatie (Figuur 4B). Controleer sscDNA opbrengst en grootteverdeling met een Bioanalyzer en Nanodrop, volgens de instructies van de fabrikant. De grootte van de verdeling van geamplificeerde cDNA moet be typisch uit tussen 100 en 1500 basen lang met een piek rond 600 basen.

6. sscDNA Fragmentatie

  1. Bereid 2 ug van cDNA in 30 pi, het aanpassen van het volume met Nuclease gratis water.
  2. Bereid 1x One-Phor-All Buffer PLUS (OPA), uitgaande van een 10x OPA buffer PLUS oplossing.
  3. Bereid 0,2 U / ul DNase I (5-voudige verdunning van 1 U / ul DNase I).
  4. Bereid een Fragmentatie Master Mix als volgt (gegeven voor een enkele reactie):
    Reagens Volume
    10X One-Phor-All Buffer PLUS 3,6 pl
    DNase I (0,2 U / pl) 3 ui
  5. Voeg 6,6 ul van Fragmentatie Mix aan de 30 ul van sscDNA.
  6. Spin en incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten, vervolgens inactivatie van het DNase I bij 95 ° C gedurende 10 min en blijf op ijs. Aliquot 1 &# 181; l van de gefragmenteerde cDNA voor Agilent basis-grootteverdeling verificatie.
  7. sscDNA grootteverdeling verificatie (Figuur 4C). Controleer sscDNA grootteverdeling met een Bioanalyzer (Agilent). De grootteverdeling van gefragmenteerde cDNA moet typisch liggen tussen 35 en 200 basen.

7. Etikettering van gefragmenteerde sscDNA

  1. Verdun het DLR-1a 7,5 mM tot 5 mM in DEPC-water.
  2. Bereid een etikettering Master Mix als volgt (gegeven voor een enkele reactie):
    Reagens Volume
    5x TdT Reaction Buffer 14 pl
    CoCl2 (25 mM) 14 pl
    DLR-1a (5 mm) 1 pi
    Terminal transferase (400 U / pl) 4.4 pl
  3. Voeg 33,4 ul van de etikettering mixelke gefragmenteerde cDNA monster.
  4. Meng door de knop van de buis, draai kort en incubeer bij 37 ° C gedurende 60 minuten, dan blijven op ijs.

8. Hybridisatie met de herv Chip Microarray

  1. Voorbevochtigd de HERV GeneChip met 200 ui prehybridisatie Mix (Affymetrix) en incubeer bij 50 ° C, 60 rpm gedurende 10 minuten.
  2. Bereid de hybridisatie mix als volgt (gegeven een reactie):
    Reagens Volume
    Controle Oligo B2 (3 nM) 3.3 pl
    20x Eukaryotic Hybridisatie Controle 10 gl
    2x hybridisatiemengsel 100 pl
    99.9% DMSO 17.7 pi
  3. Voeg 131 ul van hybridisatie Mix de 69 gl versnipperd en gelabelde cDNA bij kamertemperatuur tot een uiteindelijke vo makenlume van 200 pi.
  4. Meng en denaturatie gedurende 2 min bij 95 ° C, daarna incuberen bij 50 ° C gedurende 5 minuten en centrifugeer bij maximale snelheid gedurende 5 minuten.
  5. Leeg de voorbevochtigd herv GeneChip en laad de 200 ul doel voorbereiding. Solliciteer taai-vlekken op de twee septa.
  6. Hybridiseren bij 50 ° C, 60 rpm, 18 uur.
  7. Na 18 uur, leeg de HERV GeneChip en bewaar de verzamelde hybridisatie-oplossing bij 4 ° C. Vul de probe array met 250 ul wasbuffer A. Als de chips niet direct lopen het fluïdica, bewaard bij 4 ° C.

9. Wassen en kleuren

  1. Voer het Fluidics van het GCOS menubalk. In het dialoogvenster Fluidics selecteert u het station van belang (1-4), selecteer vervolgens Shutdown_450 voor alle modules, dan lopen. Dompel de 3 Fluidics aspiratie lijnen in Milli-Q water. Volg de instructies op het LCD-scherm.
  2. Breng de Prime_450 programma voor alle modules. Plaats de buizen voor Wash Buffer A ineen fles met 400 ml Wash Buffer A, en de een voor Wash Buffer B in een fles met 200 ml Wash Buffer B. Dan weer, volg de instructies LCD-scherm.
  3. Til de naalden en plaats 600 ul vlek cocktail 1 (SAPE Solution Mix) en 600 ul vlek cocktail 2 (Antibody Solution Mix) bevattende microcentrifugebuizen op posities # 1 en # 2, en 800 ul array dat bufferoplossing op positie # 3 .
  4. Wijs de juiste chip voor elke module, selecteert u de FS450-004 protocol en lopen elke module, volgens de instructies op het scherm.

10. Het scannen

  1. Warm de GS3000 scanner. Het is om te scannen wanneer het licht groen wordt.
  2. Solliciteer taai-vlekken op de septa om te voorkomen dat lekkende laad dan de chip in de autoloader of anders direct in de scanner. Start het scannen.
  3. Na scannen van de chip. Cel bestanden gegenereerd. Controleer het beeld en lijn de grid naar de plek om de sonde cellen (identificeren Figuren 4D-F).

11. Data Analysis

  1. Kwaliteitscontrole. Raadpleeg de standaard Affymetrix controles om na te gaan of de herv-V2 chips voldoen aan de QC-criteria. Voor dit doel de volgende voorstellingen kunnen worden gebruikt: de log intensiteit waarde distributie (plots dichtheid en staafdiagrammen), de mediane absolute afwijking (MAD) versus de intensiteit mediaan (MAD-Med) percelen, de achtergrond percelen, de genormaliseerde ongeschaalde standaardfout (Nuse) percelen en de relatieve log uitdrukking (RLE) percelen.
  2. Normalisatie. Bovendien moet de dataset worden onderzocht om onverwachte batch effecten te benadrukken en te corrigeren voor statistische analyse. De gegevens voorbewerking omvat dus een achtergrondcorrectie (bijv.. Gebaseerd op tryptofaan sonde basissignaalstructuur), gevolgd door RMA normalisatie en samenvatting 15.
  3. Data mining en zoeken naar differentiële expressie gebrachte genen. Normaliseren van de chips en een hiërarchische clusteri toepassenng benadering van de dataset (figuur 6A) te verkennen. Voer vervolgens een zoektocht naar differentieel tot expressie genen (DEG) met behulp van een klassieke significante analyse van microarray (SAM) procedure 16, gevolgd door een valse ontdekking tarief (FDR) correctie 17. Merk op dat deze stappen volledig geïntegreerd zijn in een aantal software-analyse suites zoals Partek GS, maar kan ook worden uitgevoerd met behulp van de R statistische software 18 met pakketten van de Bioconductor project 19. Na statistische analyse, filtreer de dataset de probesets waarvoor expressiewaarden minder dan 2 6 sluiten.
  4. Visualisatie en interpretatie. Interpretatie van de resultaten van de HERV-V2 microarray in een speciale interface met annotatie databases.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De waarde van transcriptoom studies ligt vooral in de kwaliteit van het uitgangsmateriaal biologisch materiaal. Wanneer de RNA-extractie wordt uitgevoerd in optimale omstandigheden, de RNA integriteit Number (RIN) is typisch 7 of hoger (Figuur 4A). De noodzaak om te hybridiseren 2 ug cDNA op de Affymetrix HERV-V2 chip impliceert het gebruik van een amplificatieproces. Een succesvolle amplificatie stap leidt tot een klokvormige verdeling (figuur 4B). Vervolgens wordt DNAse1 fragmentatie uitgevoerd om de cDNA grootteverdeling homogeniseren ongeveer 100 nucleotiden voor hybridisatie (Figuur 4C). Na hybridisatie en scannen (figuur 4D), een visueel onderzoek van de afbeelding maakt het mogelijk om te controleren of het net goed afgestemd op de vlekken (figuur 4E) en als hybridisatie controles consistent (Figuur 4F). Deze stap is ook nuttig om microarrays sluiten waarin luchtbellen of fouten opgetreden tijdens het experiment.

Zodra de chips QC (figuur 5) zijn verstreken en na normalisatie, de statistische analyse van 5 match-pair tumor en normale prostaat RNA-monsters van de Lyon-Sud ziekenhuis leidde tot de identificatie van 207 herv probesets met differentiële expressie waarden (p.val <0,05) (Figuur 6A). Om deze gegevens te ondersteunen en prostaatspecifiek informatie te verkrijgen, werden 35 bijkomende match pair monsters (colon, eierstok, testis, borst-, long-en prostaatkanker) toegevoegd aan de analyse en de SAM-FDR procedure (FDR = 20%) uiteindelijk geïdentificeerd 44 prostaat specifiek herv probesets. Onder hen zijn de meest relevante 10 HERV structuren beschreven (figuur 6B). Verdere klinische studies nodig zijn om de waarden van gevoeligheid en specificiteit van deze kandidaatbiomarkers beoordelen.

pload/50713/50713fig1.jpg "width =" 500px "/>
. Figuur 1 Schema van de algemene procedure van de kliniek (1: prostatectomie door de arts en de voorbereiding weefsel door de patholoog) naar de bank (2-6: monstervoorbereiding, doel voorbereiding, microarray verwerking) die leiden tot de identificatie van kandidaat biomerkers (7: bio-analyse van de herv microarrays). Nucleïnezuren afgeleid van normaal weefsel zijn weergegeven in oranje, nucleïnezuren afgeleid van tumorale gebied bestaan ​​uit een mix van normale (oranje) en tumorspecifieke (zwart) nucleïnezuren. Klik hier voor grotere afbeelding .

figure-results-1
. Figuur 2 Conception en de inhoud van de herv-V2 chip: herv sequentiesopgehaald uit het menselijke genoom worden opgeslagen in een database genaamd HERV-gDB3 vervolgens de 25-meer kandidaat probes doorheen een specifieke hybridisatie modeling procedure (EDA +) alvorens uiteindelijk gesynthetiseerd op de matrix (de resulterende beoogde deelgebieden zijn weergegeven voor elk familie). Klik hier voor grotere afbeelding .

figure-results-2
Figuur 3. Prostate behandeling door de patholoog. (A) Vers radicale prostatectomie monster wordt overgebracht naar het laboratorium. (BC) De prostaat is gekleurd (groen aan de rechterkant, zwart aan de linkerkant). (D) Grote dwarsdoorsnede van de klier aan de posterieure zijde. (E) Het verlaten van de marge intact, pieces van weefsels worden ontleed uit verschillende gebieden van de prostaat. (F) Cores weefsel wordt geplaatst in een Eppendorf buis. (G) hechtdraad gebruikt om de prostaat te sluiten en klier vervorming en minimale verstoring van de chirurgische marge voorkomen. Dan, de radicale prostatectomie specimen is klaar voor bevestiging in formaline volgens de gebruikelijke procedure voor histologische analyse. Klik hier voor grotere afbeelding .

figure-results-3
Figuur 4. Kwaliteitscontroles van nucleïnezuur voorbereiding en hybridisatie efficiëntie. (A) RNA integriteit, (B) cDNA versterkt doelstellingen en (C) gefragmenteerde die gebruikt zijn bij de hybridisatie podium. These drie kwaliteitscontroles werden verkregen met de Bioanalyzer behulp van RNA-nano-chips en de Eukaryoot Nano Serie II test. (D) In het algemeen beeld van de herv-V2 microarray hybridisatie gebied na het scannen, (E) uitbreiding van de linker bovenhoek vertoning rasteruitlijning controles en (F) uitbreiding van het centrumgebied tonen spotten hybridisatie controles. Klik hier voor grotere afbeelding .

figure-results-4
Figuur 5. Verwerking van signalen. (A) Affymetrix polyA spike-amplificatie controles. De polyA controleert Dap, Thr, Phe en Lys transcripties van B. subtilis genen worden verrijkt in de RNA-monster en dienen om het succes te beoordelen van de doelgroep voorbereiding stappen. Intensiteit moeten worden gedetecteerd op afnemende waarden onder deze piek in controles om ervoor te zorgen dat er geen bias bij de WT-Ovation versterking tussen hoog-en laag-uitgedrukte genen. (B) Affymetrix spike-in hybridisatie controles. Deze doelstellingen geïsoleerd uit E. coli en P1 bacteriofaag spiked zijn voor de etikettering procedure. Toenemende waarden van BioB, BioC, Biod en Cre geven het algehele succes van de hybridisatie. (C) Intensiteit verdeling van de chip signalen na RMA normalisering. Het merendeel van de probesets tentoonstelling signalen met lagere waarden dan 2 6 (achtergrond), met vermelding van een algemene aanduiding voornamelijk beperkt tot een aantal specifieke herv loci. Klik hier voor grotere afbeelding .

ftp_upload/50713/50713fig6.jpg "width =" 500px "/>
Figuur 6. Gegevensanalyse. (A) Hiërarchische clustering analyse van normale en tumorale monsters. Partitionering clustering werd toegepast op de genormaliseerde expressie waarden met behulp van een Euclidische afstand functie algoritme, groeperen probesets in maximaal (rood) - en omlaag (blauw)-regulering tussen normale en tumorale monsters. (B) Selectie van de top 10 herv structuren geïdentificeerd als kandidaat biomarker van prostaatkanker. Voor elke HERV element, de bijbehorende herv familie, de genomische coördinaten (NCBI 36/hg18) en een korte beschrijving van de herv structuur gegeven. Klik hier voor grotere afbeelding .

figure-results-5
Figuur 7. De HERV repertoire. (A) Sequentie van het humane genoom openbaarde 25.000 eiwit-coderende genen (exons, 2%) en een grote hoeveelheid transposons waaronder 200.000 lange terminale herhaling (LTR) retrotransposons (HERV, 8%). (B) Extrapolatie van herv-V2 chip content en bijbehorende expressie data (79 monsters afkomstig van 8 normale versus tumorale soorten weefsel) suggereren dat een derde van de herv repertoire is transcriptioneel actief. Klik hier voor grotere afbeelding .

figure-results-6
Figuur 8. Functionele interpretatie van signalen van de chip. (A) identificatie Promotor en epigenetische controle: U3 negatief signaal (rood sonde, 5'LTR) Versus R-U5 positief signaal (blauw sonde, 5'LTR) suggereren-U3 gedreven transcriptie, ondersteund door de verschillende CpG methylering (stevige zwarte cirkels) inhoud van U3 in peritumorale normale versus tumorale weefsels. (B) Splicing strategie: het vermeende 3,1 kb mRNA codeert envelop exclusief tot expressie in de tumor wordt geïdentificeerd middels SD1/SA2 splitsings overlappende probe. * Afgeleid door de vergelijking met andere niet-placenta weefsels. Klik hier voor grotere afbeelding .

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De afgelopen 10 jaar zijn de meeste pogingen voor HERV expressie meting zijn RT-PCR-technieken gebruikt worden om op een specifiek locus 20-24 of gebaseerd op de relatieve behoud van de pol genen algemene trends evalueren binnen HERV genera 25,26 . Bovendien PCR amplificaties met behulp van zeer gedegenereerde primers bij een laag microarrays dichtheid bedoeld om de expressie van HERV families 27,28 detecteren en kwantificeren. Om binnen een familie de uitdrukking van individuele locus traceren, benaderingen op basis van de PCR-amplificatie van geconserveerde gebieden in combinatie met de daaropvolgende klonering en sequencing ingeschakeld transcriptioneel actieve verschillende elementen van de HML-2 29,30 of herv-E4.1 31 gezinnen worden geïdentificeerd. Ook eindigt door klonen en sequencing stappen, het genoom herhaling uitdrukking meettechniek gericht om initiatiefnemers te identificeren tussen herhalingen geïdentificeerd actief HML-2 specifieke menselijke eenzame LTR 32,33. We achtereenvolgens ontwikkelde twee generaties van high-density microarrays gewijd aan de analyse van de herv transcriptome, de invoering van methoden voor herhaald element sonde ontwerp om kruisreacties tussen paraloge elementen binnen een gezin 34,35 minimaliseren. De HERV-V2 chip, die 2690 verschillende provirussen en 2883 solo LTRs van de HERV-W, herv-H, herv-E 4.1, herv-FRD, herv-K HML-2 en herv-K HML-5 gezinnen richt, onthulde de expressie van 1.718 herv loci (figuren 7A en B) in een breed scala van weefsels 35, geïllustreerd in dit document door de identificatie van mogelijke prostaatkanker biomarkers. Bovendien, het gebruik van meerdere probesets op een bepaalde locus informatief over de transcriptionele regulatie. Eerst een U3 negatief signaal in combinatie met een U5 positieve classificeert de LTR als een promotor, en omgekeerd U3 positieve en negatieve signalen U5 kan polyadenylatie rol geven. We i dusdentified 326 promotor LTRs in een brede waaier van weefsels 35 en, op basis van deze U3-U5 dichotome informatie die door de array, we voorgesteld en experimenteel bevestigd voor een aantal geselecteerde gevallen dat een dergelijke autonome transcriptie werd bestuurd door een methylatie afhankelijke epigenetische proces 34 (Figuur 8). Ten tweede, de detectie van signalen van bijvoorbeeld LTR, gag en env onafhankelijke probesets of uitgegeven vanaf probes gericht op specifieke splitsings is informatief over de provirale splicing strategie, zoals wordt geïllustreerd door de ERVWE1/Syncytin1 expressie profiel in placenta of in tumorale testis 34. Dit geeft aan dat het proces van HERV specifieke selectie probe robuust genoeg is om de identificatie van weefsel-geassocieerde splicing strategie zo efficiënt als conventionele genen 36 (figuur 8).

Deze methode is de eerste poging om individueel herv locus expressie te identificerenmet behulp van een aangepaste hoge dichtheid microarray gebaseerd op Affymetrix technologie. Het duidelijk voordeel van de microarray formaat HERV transcriptoom bestaande uit (i) het ontcijferen van de gecoördineerde uitwerking van diverse HERV families en (ii) de gelijktijdige en onafhankelijke analyse van de verschillende regio's voor elke locus, bijvoorbeeld. U3 en U5 domeinen voor solo en proviraal LTR, prop of env regio's en mogelijk gesplitst kruispunten in verband met proviraal structuren, zonder a priori op de functionaliteit van de herv element. Vooruitzichten vertrouwen op een verbetering van annotaties in de microarray bijbehorende bio-gereedschappen. Dit moet het mogelijk maken een tot chip signalen in biologische hypothesen zoals de vraag of bewezen actieve HERVs rijden lncRNA transcriptie of moduleren min of meer proximale codering genexpressie. Inderdaad, is een dergelijke veronderstelling wordt ondersteund door recente studies dat prostate kanker-geassocieerde ncRNA transcripten die bestanddelen van v geïdentificeerdIral ORF van HERV-K endogene retrovirus familie of delen van een virale LTR promoter gebied 37, evenals twee genfusie gebeurtenissen namelijk HERV-K22q11-ETV1 en HERV-K17-ETV 38,39. Samen genomen, kan dit hele transcriptome aanpak gecombineerd met LTR-functie en splicing strategie identificaties helpen om de marker te ontcijferen ten opzichte van de trekker onderdelen van herv expressie bij chronische 40,41 en infectieziekten 42,43.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door bioMerieux SA, de Hospices Civils de Lyon en de Franse overheidsinstantie OSEO (Advanced Diagnostics voor nieuwe therapeutische benaderingen, een Franse overheid gefinancierde programma gewijd aan gepersonaliseerde geneeskunde). PP, VC, GO, NM, en FM zijn medewerkers van bioMerieux SA. PP, NM en FM hebben octrooiaanvragen met betrekking tot de bevindingen van dit document ingediend.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Cecile Montgiraud, Juliette Gimenez, Magali Jaillard en Bertrand Bonnaud voor hun bijdrage aan de initiële ontwikkeling en optimalisatie van de herv-V2-protocol. We willen ook Hader Haidous bedanken voor zijn begeleiding bij ethische overwegingen.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
TrizolInvitrogen15596-026
RNA poly-A control stockAffymetrix900433
DNAse 1PromegaM61011,000 U (1 U/µl)
Terminal transferaseRoche3333574001400 U. Including enzyme and coenzyme (CoCl2).
DLR-1aAffymetrix900542
Hybridization internal controls B2 and 20x Eukaryotic Hybridization ControlAffymetrix900454
GeneChip Hybridization, Wash and stainingAffymetrix900720Including PreHybridization Mix and 2x Hybridization Mix for 30 reactions
10x One-Phor-All Buffer PLUSComposition in DEPC-treated water: 100 mM Tris-acetate pH 7.5; 100 mM magnesium acetate; 500 mM potassium acetate.
RNeasy Mini kitQiagen74104RNA cleanup protocol
WT-Ovation RNA amplification systemNugen2210-24
QIAquik PCR purification kitQiagen28104
EQUIPMENT
Material NameCompanyCatalogue NumberComments
Nanodrop 1000Thermo Scientific
GeneChip Scanner 3000 7GAffymetrixGS30007GOptional: autoloader
GeneChip Fluidics Station 450AffymetrixFS450
GeneChip Hybridization 640 OvenAffymetrix640Includes 4 GeneChip Probe array carriers
Workstation loaded with GeneChip Operating Software (GCOS) including the GeneChip Scanner 3000 High-Resolution Scanning Patch
HERV-V2 chipAffymetrixCustom array.
For microarray availability (for research use only), please contact:
François Mallet
Laboratoire Commun de Recherche Hospices Civils de Lyon-bioMérieux
Medical Diagnostic Discovery Department
Centre Hospitalier Lyon Sud, Bâtiment 3F
69495, Pierre Bénite cedex France
Phone: 33 (0)4 72 67 87 85
Email: francois.mallet@biomerieux.com
HERV-V2 conception
Dedicated database and annotations

The construction of a dedicated database, grouping genomic HERV sequences belonging to 6 HERV families, has been achieved by the following procedure: (i) the most complete and representative sequence of each HERV family was selected from the literature and defined as a prototype sequence (Figure 2). (ii) The 6 prototypes were functionally annotated with reference to their LTR (U3/R/U5) and internal parts (gag/pol/env). (iii) RepeatMasker 44 was then applied using these functional sequences as input libraries. A genome-wide search of all related sequences was performed over the human genome on the basis of a minimum 80% homology (NCBI 36/hg18). (iv) Finally, the functional sequences retrieved by this process were assembled into distinct loci on the basis of their genomic location and eventually implemented in a dedicated HERV database. This database, called HERV-gDB3, contains 10,035 individual HERV loci35.

Locus-specific probes design
Starting from HERV-gDB3, overlapping tracks of 25-mer candidate probes were firstly generated. Each candidate probe was then aligned against the human genome using KASH 45 in order to assess the cross-hybridization potentialities. This latter estimation was performed by a model developed specifically for this purpose and referred to as EDA+. Briefly, the principle of EDA+ is to take into account the instability brought by mismatches and gaps in a 25-mer target/probe hybridization complex. Candidate probes exhibiting low cross-hybridization risks (i.e. a low number of non-specific genomic targets) are selected and lastly assembled into probesets.

Custom HERV GeneChip microarray
The custom HERV GeneChip integrates 23,583 HERV probesets and can discriminate 5,573 distinct HERV elements, composed of solo LTRs, complete and partial proviruses (Figure 2). The standard Affymetrix control probes for unbiased amplification and hybridization were also included in the microarray.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Landmarks in prostate cancer diagnosis: the biomarkers. BJU Int. 110, Suppl 1. 8-13 (2012).">Artibani, W. Landmarks in prostate cancer diagnosis: the biomarkers. BJU Int. 110, Suppl 1. 8-13 (2012).
  2. Negative predictive value for cancer in patients with "gray-zone" PSA level and prior negative biopsy: preliminary results with multiparametric 3.0 Tesla MR. J. Magn. Reson. Imaging. 36, 943-950 (2012).">Girometti, R., et al. Negative predictive value for cancer in patients with "gray-zone" PSA level and prior negative biopsy: preliminary results with multiparametric 3.0 Tesla MR. J. Magn. Reson. Imaging. 36, 943-950 (2012).
  3. Prognostic value of modeled PSA clearance on biochemical relapse free survival after radical prostatectomy. Prostate. 69, 1325-1333 (2009).">You, B., et al. Prognostic value of modeled PSA clearance on biochemical relapse free survival after radical prostatectomy. Prostate. 69, 1325-1333 (2009).
  4. PSA Velocity and Doubling Time in Diagnosis and Prognosis of Prostate Cancer. Br. J. Med. Surg. Urol. 5, 162-168 (2012).">Vickers, A. J., Brewster, S. F. PSA Velocity and Doubling Time in Diagnosis and Prognosis of Prostate Cancer. Br. J. Med. Surg. Urol. 5, 162-168 (2012).
  5. DD3: a new prostate-specific gene, highly overexpressed in prostate cancer. Cancer Res. 59, 5975-5979 (1999).">Bussemakers, M. J., et al. DD3: a new prostate-specific gene, highly overexpressed in prostate cancer. Cancer Res. 59, 5975-5979 (1999).
  6. Urinary prostate cancer 3 test: toward the age of reason. Urology. 75, 447-453 (2010).">Vlaeminck-Guillem, V., Ruffion, A., Andre, J., Devonec, M., Paparel, P. Urinary prostate cancer 3 test: toward the age of reason. Urology. 75, 447-453 (2010).
  7. Expression of the human endogenous retrovirus-K transmembrane envelope, Rec and Np9 proteins in melanomas and melanoma cell lines. Melanoma Res. 16, 223-234 (2006).">Buscher, K., et al. Expression of the human endogenous retrovirus-K transmembrane envelope, Rec and Np9 proteins in melanomas and melanoma cell lines. Melanoma Res. 16, 223-234 (2006).
  8. Identification of the HERV-K gag antigen in prostate cancer by SEREX using autologous patient serum and its immunogenicity. Cancer Immun. 8, 15(2008).">Ishida, T., et al. Identification of the HERV-K gag antigen in prostate cancer by SEREX using autologous patient serum and its immunogenicity. Cancer Immun. 8, 15(2008).
  9. Human endogenous retrovirus K10: expression of Gag protein and detection of antibodies in patients with seminomas. J. Virol. 69, 414-421 (1995).">Sauter, M., et al. Human endogenous retrovirus K10: expression of Gag protein and detection of antibodies in patients with seminomas. J. Virol. 69, 414-421 (1995).
  10. Viruses: Essential Agents of Life. Witzany, G. , Springer-Verlag. 325-361 (2012).">Pérot, P., Bolze, P. A., Mallet, F. Viruses: Essential Agents of Life. Witzany, G. , Springer-Verlag. 325-361 (2012).
  11. Prostate specific antigen in the diagnosis and treatment of adenocarcinoma of the prostate. I. Untreated patients. Untreated patients. J. Urol. 141, 1070-1075 (1989).">Stamey, T. A., Kabalin, J. N. Prostate specific antigen in the diagnosis and treatment of adenocarcinoma of the prostate. I. Untreated patients. Untreated patients. J. Urol. 141, 1070-1075 (1989).
  12. Measurement of prostate-specific antigen in serum as a screening test for prostate cancer. New Engl. J. Med. 324, 1156-1161 (1991).">Catalona, W. J., et al. Measurement of prostate-specific antigen in serum as a screening test for prostate cancer. New Engl. J. Med. 324, 1156-1161 (1991).
  13. Prostate cancer around the world. An overview. Urol. Oncol. 28, 663-667 (2010).">Schroder, F. H. Prostate cancer around the world. An overview. Urol. Oncol. 28, 663-667 (2010).
  14. Active surveillance for favorable-risk prostate cancer: background, patient selection, triggers for intervention, and outcomes. Curr. Urol. Rep. 13, 153-159 (2012).">Klotz, L. Active surveillance for favorable-risk prostate cancer: background, patient selection, triggers for intervention, and outcomes. Curr. Urol. Rep. 13, 153-159 (2012).
  15. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics. 4, 249-264 (2003).">Irizarry, R. A., et al. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics. 4, 249-264 (2003).
  16. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).">Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).
  17. Statistical significance for genomewide studies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 9440-9445 (2003).">Storey, J. D., Tibshirani, R. Statistical significance for genomewide studies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 9440-9445 (2003).
  18. Team, R. D. C. R: A language and environment for statistical computing. , (2008).
  19. Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics. Genome Biol. 5, R80(2004).">Gentleman, R. C., et al. Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics. Genome Biol. 5, R80(2004).
  20. Survey of human genes of retroviral origin: identification and transcriptome of the genes with coding capacity for complete envelope proteins. J. Virol. 77, 10414-10422 (2003).">de Parseval, N., Lazar, V., Casella, J. F., Benit, L., Heidmann, T. Survey of human genes of retroviral origin: identification and transcriptome of the genes with coding capacity for complete envelope proteins. J. Virol. 77, 10414-10422 (2003).
  21. Detecting the expression of human endogenous retrovirus E envelope transcripts in human prostate adenocarcinoma. Cancer. 98, 187-197 (2003).">Wang-Johanning, F., et al. Detecting the expression of human endogenous retrovirus E envelope transcripts in human prostate adenocarcinoma. Cancer. 98, 187-197 (2003).
  22. Temporal regulation of the expression of syncytin (HERV-W), maternally imprinted PEG10, and SGCE in human placenta. Biol. Reprod. 69, 286-293 (2003).">Smallwood, A., et al. Temporal regulation of the expression of syncytin (HERV-W), maternally imprinted PEG10, and SGCE in human placenta. Biol. Reprod. 69, 286-293 (2003).
  23. Expression analyses of human endogenous retroviruses (HERVs): tissue-specific and developmental stage-dependent expression of HERVs. Genomics. 84, 982-990 (2004).">Okahara, G., et al. Expression analyses of human endogenous retroviruses (HERVs): tissue-specific and developmental stage-dependent expression of HERVs. Genomics. 84, 982-990 (2004).
  24. Expression of human endogenous retrovirus K in melanomas and melanoma cell lines. Cancer Res. 65, 4172-4180 (2005).">Buscher, K., et al. Expression of human endogenous retrovirus K in melanomas and melanoma cell lines. Cancer Res. 65, 4172-4180 (2005).
  25. Development of broadly targeted human endogenous gammaretroviral pol-based real time PCRs Quantitation of RNA expression in human tissues. J. Virol. Methods. 129, 16-30 (2005).">Forsman, A., et al. Development of broadly targeted human endogenous gammaretroviral pol-based real time PCRs Quantitation of RNA expression in human tissues. J. Virol. Methods. 129, 16-30 (2005).
  26. Development of real-time PCRs for detection and quantitation of human MMTV-like (HML) sequences HML expression in human tissues. J. Virol. Methods. 136, 83-92 (2006).">Muradrasoli, S., Forsman, A., Hu, L., Blikstad, V., Blomberg, J. Development of real-time PCRs for detection and quantitation of human MMTV-like (HML) sequences HML expression in human tissues. J. Virol. Methods. 136, 83-92 (2006).
  27. Comprehensive analysis of human endogenous retrovirus transcriptional activity in human tissues with a retrovirus-specific microarray. J. Virol. 79, 341-352 (2005).">Seifarth, W., et al. Comprehensive analysis of human endogenous retrovirus transcriptional activity in human tissues with a retrovirus-specific microarray. J. Virol. 79, 341-352 (2005).
  28. Quantitative multiplex degenerate PCR for human endogenous retrovirus expression profiling. Nat. Protoc. 1, 2831-2838 (2006).">Pichon, J. P., Bonnaud, B., Mallet, F. Quantitative multiplex degenerate PCR for human endogenous retrovirus expression profiling. Nat. Protoc. 1, 2831-2838 (2006).
  29. Expression pattern analysis of transcribed HERV sequences is complicated by ex vivo recombination. Retrovirology. 4, 39(2007).">Flockerzi, A., et al. Expression pattern analysis of transcribed HERV sequences is complicated by ex vivo recombination. Retrovirology. 4, 39(2007).
  30. Expression patterns of transcribed human endogenous retrovirus HERV-K(HML-2) loci in human tissues and the need for a HERV Transcriptome Project. BMC Genomics. 9, 354(2008).">Flockerzi, A., et al. Expression patterns of transcribed human endogenous retrovirus HERV-K(HML-2) loci in human tissues and the need for a HERV Transcriptome Project. BMC Genomics. 9, 354(2008).
  31. HERV-E-Mediated Modulation of PLA2G4A Transcription in Urothelial Carcinoma. PLoS ONE. 7, e49341(2012).">Gosenca, D., et al. HERV-E-Mediated Modulation of PLA2G4A Transcription in Urothelial Carcinoma. PLoS ONE. 7, e49341(2012).
  32. GREM, a technique for genome-wide isolation and quantitative analysis of promoter active repeats. Nucleic Acids Res. 34, e67(2006).">Buzdin, A., Kovalskaya-Alexandrova, E., Gogvadze, E., Sverdlov, E. GREM, a technique for genome-wide isolation and quantitative analysis of promoter active repeats. Nucleic Acids Res. 34, e67(2006).
  33. At least 50% of human-specific HERV-K (HML-2) long terminal repeats serve in vivo as active promoters for host nonrepetitive DNA transcription. J. Virol. 80, 10752-10762 (2006).">Buzdin, A., Kovalskaya-Alexandrova, E., Gogvadze, E., Sverdlov, E. At least 50% of human-specific HERV-K (HML-2) long terminal repeats serve in vivo as active promoters for host nonrepetitive DNA transcription. J. Virol. 80, 10752-10762 (2006).
  34. Custom human endogenous retroviruses dedicated microarray identifies self-induced HERV-W family elements reactivated in testicular cancer upon methylation control. Nucleic Acids Res. 38, 2229-2246 (2010).">Gimenez, J., et al. Custom human endogenous retroviruses dedicated microarray identifies self-induced HERV-W family elements reactivated in testicular cancer upon methylation control. Nucleic Acids Res. 38, 2229-2246 (2010).
  35. Microarray-based sketches of the HERV transcriptome landscape. PLoS ONE. 7, e40194(2012).">Pérot, P., et al. Microarray-based sketches of the HERV transcriptome landscape. PLoS ONE. 7, e40194(2012).
  36. A microarray configuration to quantify expression levels and relative abundance of splice variants. Nucleic Acids Res. 33, e47(2005).">Fehlbaum, P., Guihal, C., Bracco, L., Cochet, O. A microarray configuration to quantify expression levels and relative abundance of splice variants. Nucleic Acids Res. 33, e47(2005).
  37. Transcriptome sequencing across a prostate cancer cohort identifies PCAT-1, an unannotated lincRNA implicated in disease progression. Nat. Biotechnol. 29, 742-749 (2011).">Prensner, J. R., et al. Transcriptome sequencing across a prostate cancer cohort identifies PCAT-1, an unannotated lincRNA implicated in disease progression. Nat. Biotechnol. 29, 742-749 (2011).
  38. Distinct classes of chromosomal rearrangements create oncogenic ETS gene fusions in prostate cancer. Nature. 448, 595-599 (2007).">Tomlins, S. A., et al. Distinct classes of chromosomal rearrangements create oncogenic ETS gene fusions in prostate cancer. Nature. 448, 595-599 (2007).
  39. Truncated ETV1, fused to novel tissue-specific genes, and full-length ETV1 in prostate cancer. Cancer Res. 68, 7541-7549 (2008).">Hermans, K. G., et al. Truncated ETV1, fused to novel tissue-specific genes, and full-length ETV1 in prostate cancer. Cancer Res. 68, 7541-7549 (2008).
  40. The role of human endogenous retroviruses in the pathogenesis of autoimmune diseases. Med. Sci. Monit. 18, RA80-RA88 (2012).">Brodziak, A., et al. The role of human endogenous retroviruses in the pathogenesis of autoimmune diseases. Med. Sci. Monit. 18, RA80-RA88 (2012).
  41. Human endogenous retroviruses and cancer: Causality and therapeutic possibilities. World J. Gastroenterol. 18, 6027-6035 (2012).">Mullins, C. S., Linnebacher, M. Human endogenous retroviruses and cancer: Causality and therapeutic possibilities. World J. Gastroenterol. 18, 6027-6035 (2012).
  42. Resurrection of endogenous retroviruses in antibody-deficient mice. Nature. 491, 774-778 (2012).">Young, G. R., et al. Resurrection of endogenous retroviruses in antibody-deficient mice. Nature. 491, 774-778 (2012).
  43. HIV infection and HERV expression: a review. Retrovirology. 9, 6(2012).">Vander Kuyl, A. C. HIV infection and HERV expression: a review. Retrovirology. 9, 6(2012).
  44. RepeatMasker Open-3.0. , (1996).">Smit, A. F. A., Hubley, R. RepeatMasker Open-3.0. , (1996).
  45. Flexible Pattern Matching in Strings: Practical On-Line Search Algorithms for Texts and Biological Sequences. , Cambridge University Press. (2002).">Navarro, G., Raffinot, M. Flexible Pattern Matching in Strings: Practical On-Line Search Algorithms for Texts and Biological Sequences. , Cambridge University Press. (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

HERV Loci ExpressionMicroarray AnalysisProstate Cancer BiomarkersRNA ExtractionWhole Transcriptome AmplificationHERV Gene ChipHybridization ProtocolDifferential Expression AnalysisFunctional ValidationBiomarker Discovery

Related Articles