Method Article

Fluorescentiemicroscopiemethodes voor het bepalen van de levensvatbaarheid van bacteriën in Associatie met zoogdiercellen

DOI:

10.3791/50729

⸱

September 5th, 2013

 , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Cancer Biology, University of Virginia Health Sciences Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Centraal in het gebied van bacteriële pathogenese is de mogelijkheid om te bepalen of en hoe microben overleven na blootstelling aan eukaryotische cellen. Dit artikel beschrijft protocollen voor het gebruik van fluorescerende kleurstoffen die de levensvatbaarheid van individuele bacteriën in en gekoppeld aan gastheercellen onthullen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Centraal in het gebied van bacteriële pathogenese is de mogelijkheid om te bepalen of en hoe microben overleven na blootstelling aan eukaryotische cellen. Huidige protocollen om deze vragen te beantwoorden zijn onder kolonietelling assays, gentamicine protection assays en elektronenmicroscopie. Kiemgetal en bescherming gentamicine assays alleen de levensvatbaarheid van de totale bacteriële populatie te beoordelen en in staat zijn om individuele bacteriële levensvatbaarheid te bepalen. Elektronenmicroscopie kan worden gebruikt om de levensvatbaarheid van individuele bacteriën bepalen en informatie over hun lokalisatie in gastheercellen. Echter, bacteriën vertonen vaak een aantal elektron dichtheden, waardoor de beoordeling van de levensvatbaarheid moeilijk. Dit artikel beschrijft protocollen voor het gebruik van fluorescerende kleurstoffen die de levensvatbaarheid van individuele bacteriën in en gekoppeld aan gastheercellen onthullen. Deze testen werden oorspronkelijk ontwikkeld om de overleving van Neisseria gonorrhoeae beoordelen in primaire humane neutrofielen, maar moet eenpplicable aan een bacterie-gastheercel interactie. Deze protocollen gecombineerd membraan-permeabele fluorescente kleurstoffen (SYTO9 en 4 ',6-diamidino-2-fenylindool [DAPI]), die alle bacteriën kleuren met membraan-ondoorlaatbare fluorescerende kleurstoffen (propidiumjodide en SYTOX Green), die alleen toegankelijk zijn levensvatbaar bacteriën. Vóór eukaryotische cel permeabilisatie, wordt een antilichaam of fluorescerend reagens extracellulaire bacteriën te identificeren. Dus deze assays discrimineren de levensvatbaarheid van bacteriën aanhanger en in eukaryotische cellen. Een protocol is ook voorzien voor gebruik van de levensvatbaarheid kleurstoffen in combinatie met fluorescente antilichamen tegen eukaryote cel markers om de subcellulaire lokalisatie van individuele bacteriën te bepalen. De bacteriële levensvatbaarheid kleurstoffen besproken in dit artikel zijn een gevoelig aanvulling en / of alternatief voor de traditionele microbiologie technieken om de levensvatbaarheid van de individuele bacteriën evalueren en informatie verstrekken over waar bacteriën overleven in gastheercels.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er is een dynamische interactie en co-evolutie tussen bacteriën en de gastheren waar zij wonen. Bacteriën hechting organellen, secretie systemen, en / of de mogelijkheid om toxines die hun productieve infectie van gastheer fagocytische en niet-fagocytische cellen inschakelen produceren geëvolueerd. De bacteriën moet maken met herkenning en antimicrobiële activiteiten van het gastheerimmuunsysteem. De gastheer immuunsysteem bestaat uit aangeboren en adaptieve componenten, waaronder fysische en chemische barrières, immuuncellen, het complementsysteem, en andere onderdelen van humorale immuniteit. Hoewel veel bacteriën gevoelig voor doden en goedkeuring door het meerlagige immuunrespons hebben sommige pathogene en opportunistische bacteriën mechanismen van verschillende gastheercellen infecteren en ontwrichting goedkeuring door de immuunrespons 1 ontwikkeld. Neisseria gonorrhoeae is een voorbeeld van een bacterieel pathogeen dat is zeer geschikt om te volharden in zijn menselijke gastheer. N. gonorrhoeae koloniseert gemakkelijk de luminale oppervlakken van mucosale epitheliale cellen van het urogenitale kanaal, keelholte, conjunctiva en rectum. Kolonisatie leidt tot de overvloedige rekrutering van neutrofielen bij mucosale sites. Neutrofielen zijn professionele fagocyten die diverse antimicrobiële processen micro-organismen doden bezitten, maar N. gonorrhoeae kan overleven in de aanwezigheid van neutrofielen 2-5. Begrijpen hoe bacteriële pathogenen zoals N. gonorrhoeae ondermijnen, onderdrukken en kapen de immuunrespons uiteindelijk overleven in normaal vijandige hostomgevingen is cruciaal voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor de bestrijding van infectieziekten.

Experimentele protocollen vaak gebruikt om bacteriële overleving onderzoeken gastheercellen omvatten kolonietelling assays, gentamicine protection assays en elektronenmicroscopie. In kiemgetal assays wordt een populatie van geïnfecteerde cellen gelyseerd (bijvoorbeeld met een wasmiddel which de bacteriën resistent) om de bacteriën te bevrijden. De lysaten verdund en uitgeplaat op agar media en kolonievormende eenheden in de lysaten worden geteld voor elk tijdstip en / of experimentele conditie. Deze benadering meldt de levensvatbaarheid van de totale bacteriële populatie, maar is niet in staat onderscheid te maken tussen de intracellulaire en extracellulaire overleving. Een variatie op het kiemgetal assay bescherming gentamicine assay specifiek meet intracellulaire bacteriële overleving, gebaseerd op het onvermogen van de antibiotica gentamicine de eukaryote plasmamembraan 6 steken. Echter, deze test is afhankelijk van de bacteriën gevoelig voor doding door gentamicine (of een ander antibioticum dat eveneens eukaryote membraan-impermeant) en het onvermogen van het antibioticum toegang tot interne bacteriën. Daarom kan een bescherming gentamicine assay niet effectief zijn voor de behandeling van bacteriële soort of bij de behandeling van bacteriële overleving in sterkpinocytose cellen zoals neutrofielen. Geen van deze benaderingen onthult de subcellulaire lokalisatie of ander gedrag van individuele bacteriën (bijvoorbeeld als de bacteriën vormen aggregaten of microkolonies die anders individuele bacteriële cellen zich gedragen). Een andere vaak gebruikte benadering om de levensvatbaarheid van individuele externe en interne bacteriën worden onderzocht dunne plaat transmissie elektronenmicroscopie (TEM). Deze benadering heeft het voordeel dat het kan informatie over de locatie van de bacteriën in gastheercellen (bijvoorbeeld fagosoom, cytoplasma, autophagosome), die verder kunnen worden onderzocht door immuno-elektronenmicroscopie met goud gekoppelde antilichamen tegen subcellulaire markers. Echter, elektronenmicroscopie is niet bijzonder gevoelig op het beoordelen van bacteriële levensvatbaarheid. Wanneer ingebedde secties worden gekleurd met uranylacetaat, loodcitraat of andere elektron-dichte reagentia en afgebeeld door elektronenmicroscopie worden elektron-dichte levensvatbare bacteriën en elektronische beschouwdtron-Lucent nonviable 7,8. Echter, deze veronderstelling overschat bacteriële levensvatbaarheid, omdat alleen die dode bacteriën met ernstig verstoord membranen en verstoken van cytoplasma verschijnen elektron-Lucent. Bovendien kunnen sommige bacteriesoorten verschillende elektronendichtheden beeldscherm afhankelijk van het stadium van de groei, waardoor het moeilijk levensvatbaar bepalen.

Als alternatief of in aanvulling op deze gebruikte methoden, hier bieden wij protocollen en redenen voor het gebruik van fluorescente kleurstoffen die bacteriële levensvatbaarheid aan om de overleving van bacteriën bevestigd aan en geïnternaliseerd door gastheercellen te beoordelen. Om extracellulaire bacteriën te identificeren, worden geïnfecteerde cellen eerst blootgesteld aan een fluorescerend reagens, zoals een lectine of bacterie-specifiek antilichaam. De geïnfecteerde cellen worden vervolgens permeabel en blootgesteld aan DNA-specifieke kleurstoffen die differentieel toegankelijk bacteriën met intacte versus gedegradeerde membranen als een surrogaat voor bacteriële levensvatbaarheid. In de eerste pROTOCOL, het membraan permeabel kleurstof SYTO9 identificeert de totale bacteriële populatie, terwijl propidiumjodide is alleen toegankelijk voor de bacteriën die membranen hebben gecompromitteerd en worden dus beschouwd als niet-levensvatbaar. Propidiumjodide en SYTO9 zijn gebruikt om bacteriële levensvatbaarheid evalueren biofilms, onderscheiden van pathogene pathogene bacteriën en opsommen levensvatbare watergedragen bacteriën 9-12. In het tweede protocol, 4 ', 6'-diamidino-2-fenylindool (DAPI) identificeert totale bacteriën, terwijl SYTOX Groen is alleen toegankelijk voor de niet-levensvatbaar bevolking. De levensvatbaarheid kleurstof paren te combineren met immunofluorescentie op locatie elke bacterie bepalen met betrekking tot een eiwit van belang, bijvoorbeeld bacteriële subcellulaire lokalisatie definiëren. Het gebruik van deze assays biedt belangrijke inzicht in de interacties die resulteren in bacteriële doden of overleving tijdens infectie van gastheercellen. De in dit artikel protocollen werden gebruikt om de levensvatbaarheid van beoordelenN. gonorrhoeae die van en in primaire humane neutrofielen, ook in verschillende populaties van neutrofielen phagosomes 5,13,14 bevestigd. Echter, deze protocollen worden toegepast om de levensvatbaarheid van gram-positieve en gram-negatieve bacteriën beoordelen professionele fagocyten, niet-professionele fagocyten en protozoa 15-24.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Het beoordelen van Bacteriële levensvatbaarheid met propidiumjodide en SYTO9

  1. Infect cellen die aanhanger 12 mm ronde glazen dekglaasjes in 24-well platen met bacteriën van belang. Laat de cellen met aldehyden of organische oplosmiddelen NIET op te lossen.
  2. Spoel cellen eenmaal voorzichtig in 0,1 M 3 - (N-morfolino) propaansulfonzuur (MOPS), pH 7,2, bevattende 1 mM MgCl2 (MOPS / MgCl2).
  3. Incubeer cellen gedurende 10 min in het donker bij kamertemperatuur met Alexa Fluor 647-gekoppelde antilichaam of lectine dat bindt aan de bacteriële species van belang in MOPS / MgCl2, externe bacteriën detecteren.

OPMERKING: Gedrag controles met levende en dode bacteriën, in afwezigheid van gastheercellen aan te tonen dat het lectine of antilichaam van belang bindt alle bacteriën ongeacht levensvatbaarheid (figuur 1).

  1. Spoel cellen twee keer met MOPS / MgCl2.
  2. Aspireren media uit cellen en voeg 0,5 ml Levend / Dead Kleuroplossing. Levend / Dead Kleuroplossing is 5uM SYTO9, 30 uM propidiumjodide, en 0,1% saponine (uiteindelijke concentraties) in MOPS / MgCl2.
  3. Incubeer cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
  4. Spoel de cellen tweemaal in MOPS / MgCl2.
  5. Omkeren coverslips gezicht naar beneden op glasplaatjes en afdichting met duidelijke nagellak. Heeft montage media niet gebruiken.
  6. Acquire beelden binnen 30 minuten, met behulp van een fluorescentiemicroscoop met filter sets compatibel met groen, rood en ver-rood afbeelding acquisitie.

OPMERKING: Beide conventionele fluorescentiemicroscopie en confocale laser scanning microscopie worden gebruikt. Na 30 min de fluorescente kleurstoffen beginnen te lekken uit de bacteriën en de verkregen gegevens niet langer juist zijn. De afbeeldingen in dit artikel zijn verkregen op een Nikon Eclipse E800 rechtop fluorescentiemicroscoop met Hamamatsu Orca-ER digitale camera met Openlab software. Fluorescentie van Alexa Fluor 647 werd gedetecteerd met een filter met een excitatie golflengte van 590-650 nm en een emissie-filter van 663-735 nm en vals-kleur blauw. Fluorescentie van propidiumjodide werd gedetecteerd met een filter met een excitatie golflengte van 540-580 nm en een emissie-filter van 600-660 nm. Fluorescentie van SYTO9 werd gedetecteerd met een filter met een excitatie golflengte van 465-495 nm en een emissie-filter van 515-555 nm.

  1. Dit protocol zal resulteren in beelden waar externe levensvatbare bacteriën verschijnen blauw + rood, interne niet-levensvatbare bacteriën verschijnen alleen rood, externe levensvatbare bacteriën verschijnen blauw + groen, en de interne levensvatbare bacteriën verschijnen alleen groen. Tellen door het oog van de aantallen bacteriën die externe levensvatbaar, interne niet-levensvatbare, externe levensvatbaar, en interne levensvatbaar zijn.
  2. Bereken het percentage externe levensvatbare bacteriën door het aantal externe levensvatbare bacteriën door het totale aantal externe bacteriën (levensvatbare plus nonvistaat). Bereken het percentage interne levensvatbare bacteriën door het aantal interne levensvatbare bacteriën door het totale aantal interne bacteriën (levensvatbare plus levensvatbaar) (Figuur 4).
  3. Er zijn twee essentiële controles uit te voeren met dit protocol. Eerste, valideren dat alle levensvatbare bacteriën propidiumiodide-positieve en alle levende bacteriën zijn SYTO9-positief. Een mid-logaritmische kweek van bacteriën (in de afwezigheid van gastheercellen) moet> 95% SYTO9-positief zijn. Weergegeven in figuur 2 is een half-logaritmische kweek van N. gonorrhoeae (at 10 8 kolonievormende eenheden per ml) geïncubeerd met Live / Dead Kleuroplossing. Ten tweede, valideren dat zowel propidiumiodide en SYTO9 gepermeabiliseerd, geïnfecteerde gastheercellen kunt invoeren.
    1. Een populatie van dode bacteriën genereren, verzamelen 2 x 10 8 bacteriële kolonievormende eenheden in een 1,5 ml microcentrifugebuis, voeg 70% isopropanol en 10 minuten zitten. Pellet de bacteriën in een microcentrifuge eennd tweemaal spoelen de bacteriën in PBS resterende isopropanol te verwijderen. Volg dan de stappen protocol 1,5-1,7. Voeg 5 ul van bacteriële suspensie aan een glasplaatje en overlay met een dekglaasje. Afbeelding monsters zoals in protocol stap 1.9. Onder deze omstandigheden moet 100% van de bevolking propidiumjodide-positieve (Figuur 2) zijn. In sommige bacteriesoorten kunnen propidiumjodide niet volledig overweldigen SYTO9 kleuring, en niet-levensvatbare bacteriën kan geel of oranje verschijnen.
    2. Voor fagocytische cellen zoals neutrofielen, blootstellen van de cellen te doden bacteriën en isopropanol toe dat 100% van de intracellulaire bacteriën propidiumjodide-positieve (figuur 3). Voor nonphagocytic cellen die geen dode bacteriën kunnen internaliseren, kan het voldoende zijn om geïnfecteerde cellen behandeld met natriumazide of andere cel-permeant antimicrobiële middelen voorafgaand aan het toevoegen Levend / Dead Kleuroplossing zijn.

2. Het beoordelen van Bacteriële rentabiliteit SYTOX Green en DAPI

  1. Etiket bacteriën van belang met 10 ug / ml DAPI in Morse's Defined Medium 25 gedurende 20 min bij kamertemperatuur in het donker.
  2. Infect cellen die aanhanger 12 mm ronde glazen dekglaasjes in 24-well platen met DAPI-gemerkte bacteriën. Laat de cellen met aldehyden of organische oplosmiddelen NIET op te lossen.
  3. Spoel cellen eenmaal met MOPS / MgCl2.
  4. Incubeer cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker met Alexa Fluor 647-gekoppelde antilichaam of lectine dat bindt aan de bacteriële species van belang in MOPS / MgCl2, externe bacteriën detecteren. Zie opmerking in protocol stap 1.3 voor aanbevolen controles.
  5. Zuig media uit cellen en voeg 0,5 ml 0,4 uM SYTOX Green in MOPS / MgCl2.
  6. Incubeer cellen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
  7. Spoel de cellen tweemaal in MOPS / MgCl2.
  8. Was de cellen eenmaal in MOPS / MgCl2 gedurende 5 minuten.
  9. Acquire beelden binnen 30 minuten met een fluorescentiemicroscoop. Zie protocol stap 1.9 voor een beschrijving van de microscoop, digitale camera, en acquisitie software.

OPMERKING: Fluorescentie van Alexa Fluor 647 werd gedetecteerd met een filter met excitatie golflengte van 590-650 nm en een emissie-filter van 663-735 nm en vals-rood. Fluorescentie van SYTOX Green werd gedetecteerd met een filter met een excitatie golflengte van 465-495 nm en een emissie-filter van 515-555 nm. Fluorescentie van DAPI werd gedetecteerd met een filter met excitatie golflengte van 355-375 nm en barrière-filter van 400 nm.

  1. Dit protocol zal resulteren in beelden waar externe levensvatbare bacteriën verschijnen rood + groen, interne niet-levensvatbare bacteriën verschijnen groen + blauw, externe levensvatbare bacteriën verschijnen rood + blauw, en de interne levensvatbare bacteriën verschijnen blauw alleen (figuur 4). Kwantificeren van de procent van de externe en interne bacteriën zoals beschreven in het protocol step 1.11.
  2. De in protocol stap 1.12 beschreven controles moeten worden uitgevoerd met de DAPI / SYTOX groene kleurstof combinatie (fig. 2 en 3).

3. Het beoordelen van Bacteriële Leefbaarheid Naast subcellulaire lokalisatie

  1. Etiket bacteriën van belang met 10 ug / ml DAPI in Morse's beschreven medium gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
  2. Infect cellen die aanhanger 12 mm ronde glazen dekglaasjes in 24-well platen met DAPI-gemerkte bacteriën. Laat de cellen met aldehyden of organische oplosmiddelen NIET op te lossen.
  3. Spoel cellen eenmaal met MOPS / MgCl2.
  4. Incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker met Alexa Fluor 647-gekoppelde antilichaam of lectine dat bindt aan de bacteriële species van belang in MOPS / MgCl2, externe bacteriën detecteren. Zie opmerking in protocol stap 1.3 voor aanbevolen controles.
  5. Zuig media uit cellen en spoel cellen twee times in MOPS / MgCl2.
  6. Incubeer cellen met Alexa Fluor 555-gekoppeld antilichaam tegen subcellulaire marker van belang zijn voor 20 min, in MOPS / MgCl2 met 0,2% saponine.
  7. Spoel de cellen tweemaal in MOPS / MgCl2.
  8. Was de cellen eenmaal in MOPS / MgCl2 gedurende 5 minuten.
  9. Zuig media uit cellen en voeg 0,4 uM SYTOX Green in MOPS / MgCl2.
  10. Incubeer de cellen 5 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
  11. Spoel de cellen tweemaal in MOPS / MgCl2.
  12. Was de cellen eenmaal in MOPS / MgCl2 gedurende 5 minuten.
  13. Acquire beelden van dia's binnen 30 min op fluorescentiemicroscoop. Zie protocol stap 1.9 voor een beschrijving van de microscoop, digitale camera, en acquisitie software.

OPMERKING: Fluorescentie van Alexa Fluor 647 werd gedetecteerd met behulp van een filter met een golflengte van 590-650 nm en emissie filter van 663-735 nm, en vals-gekleurde paars. Fluorescentie from Alexa Fluor 555 werd gedetecteerd met een filter met een excitatie golflengte van 540-580 nm en een emissie-filter van 600-660 nm. Fluorescentie van SYTOX Green werd gedetecteerd met een filter met een excitatie golflengte van 465-495 nm en een emissie-filter van 515-555 nm. Fluorescentie van DAPI werd gedetecteerd met een filter met excitatie golflengte van 355-375 nm en barrière-filter van 400 nm.

  1. Dit protocol zal resulteren in beelden waar externe levensvatbare bacteriën verschijnen paars + groen, interne niet-levensvatbare bacteriën verschijnen groen + blauw, externe levensvatbare bacteriën verschijnen paars + blauw, interne levensvatbare bacteriën verschijnen blauw alleen, en subcellulaire eiwit lijkt rood (figuur 4). Kwantificeren van de perecent van externe en interne levende bacteriën, zoals beschreven in het protocol stappen 1.11.
  2. De in protocol stap 1.12 beschreven controles moeten worden uitgevoerd met de DAPI / SYTOX groene kleurstof combinatie (fig. 2 en 3).
  3. InNaast het tellen van levensvatbare en niet-levensvatbare bacteriën, classificeren elk bacteriën als positief of negatief voor colocalization met de subcellulaire marker van belang.
  4. Bereken het percentage van levensvatbare bacteriën colocalized de subcellulaire markering door deling van het aantal levensvatbare bacteriën colocalized door het totaal aantal levensvatbare bacteriën. Bereken het percentage levensvatbare bacteriën colocalized de subcellulaire markering door deling van het aantal niet-levensvatbaar colocalized bacteriën door het totaal aantal levensvatbare bacteriën.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De geschetste protocollen werden gebruikt om overleving van N. onderzoeken gonorrhoeae na blootstelling aan primaire humane neutrofielen 5,26. Neutrofielen werden geïnfecteerd met N. gonorrhoeae en verwerkt met protocol 1, met behulp van de groene fluorescerende kleurstof SYTO9 levensvatbaarheid en de rood-fluorescerende propidiumiodide (Figuur 4A). De kleurstoffen werden toegevoegd in aanwezigheid van saponine, die cholesterol sequesters preferentieel permeabilize ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier voorgesteld zijn twee protocollen die gebruik maken DNA binding en levensvatbaarheid kleurstoffen in combinatie met een fluorescerend lectine om levende en dode bacteriën bevestigd aan en in menselijke cellen te identificeren. Aangezien beide protocollen effectief discrimineren live vanuit dode bacteriën, de keuze van welk protocol te gebruiken hangt af van het doel van het experiment. Het eerste protocol gebruikt propidiumjodide om levensvatbaar bacteriën en SYTO9 om intacte bacteriën detecteren detecteren. Weerge...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Asya Smirnov en Laura Gonyar voor kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies NIH R00 TW008042 en R01 AI097312 om AKCMBJ werd mede ondersteund door NIH T32 AI007046.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
21 G 3/4 butterfly needles for blood collectionBecton Dickinson367251 
Bloedopnamebuizen met Natrium Heparien 10 mlBecton Dickinson366480 
Steriele water voor irrigatieBaxter07-09-64-070 
Dextran 500Sigma31392 
Natrium ChlorideFisher ScientificS641 
DextroseRicca Chemical CompanyRDCD0200 
Dulbecco's PBS zonder Ca2+ of Mg2+Thermo ScientificSH3002802 
Ficoll oplossingGE Healthcare17-1440-03 
AzijnzuurFisher ScientificBP2401 
12 mm ronde glazen dekvlakkenFisher Scientific12-545-80 12CIR-1 
24-well platenCorning Incorporated3524 
Gepoold menselijk serumSigmaS7023 
RPMIMediatech15-040-CV 
Foetaal bovien serumThermo ScientificSH3007103 
Menselijke interleukine-8R&D Systems208-IL/CF 
MOPSSigmaM3183 
MgCl2Fisher ScientificBP214 
Propidium JodideLife TechnologiesL7007 of L7012 
SYTO9Life TechnologiesL7007 of L7012 
SaponineFluka Analytical47036 
Alexa Fluor 647-gekoppelde sojabonenlectinLife TechnologiesL-32463 
DAPISigmaD8417 
SYTOX GreenLife TechnologiesS7020 
Muis anti-CD63Developmental Studies Hybridoma BankH5C6 
Alexa Fluor 555 Antilichaam Labeling KitLife TechnologiesA20187 
Hemacytometer Bright LineHausser Scientific1492 
PincetEMS78320 
Sorvall Legend RT + CentrifugeThermo Scientific75004377 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).
  2. Johnson, M. B., Criss, A. K. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils. Front Microbiol. 2, 77(2011).
  3. Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes. Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).
  4. Seib, K. L., et al. Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay. Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).
  5. Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes. Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).
  6. Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. J. Vis. Exp. (49), e2693(2011).
  7. Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).
  8. Dorward, D. W. Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions. Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).
  9. Yang, L., et al. Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer. Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).
  10. Mueller, R. S., et al. Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization. J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).
  11. Shen, C., et al. Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions. Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).
  12. Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. P. Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques. J Microbiol Methods. 55, 585-597 (2003).
  13. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp.. (17), e745(2008).
  14. Allen, L. A. Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils. Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).
  15. Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications. Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).
  16. Chow, O. A., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).
  17. Thulin, P., et al. Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection. PLoS Med. 3, e53(2006).
  18. Kubica, M., et al. A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages. PLoS One. 3, (2008).
  19. Swords, W. E., et al. Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro. Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).
  20. Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells. Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).
  21. Martinez, A. N., et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR. J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).
  22. Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).
  23. Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages. J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).
  24. Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp. FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).
  25. Morse, S. A., Bartenstein, L. Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine. Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).
  26. Johnson, M. B., Criss, A. K. Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils. Cell Microbiol. , (2013).
  27. Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain. BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence MicroscopyBacterial ViabilityHost Cell AssociationMembrane PermeabilityPropidium IodideSYTO9 DyeSubcellular LocalizationExtracellular BacteriaIntracellular BacteriaViability Dyes

Related Articles