Identificatie van metabool actieve bacteriën in de darm van de Generalist Spodoptera littoralis Via DNA Stabiele Isotopen Onderzoek naar gebruik van 13 C-Glucose

Samenvatting

De actieve bacteriegemeenschappen geassocieerd met de darm van Spodoptera littoralis, werd bepaald door stabiele-isotoop probing (SIP) gekoppeld pyrosequencing. Met behulp van deze methodiek, de identificatie van de metabolisch actieve bacteriën soorten binnen de gemeenschap werd gedaan met een hoge resolutie en nauwkeurigheid.

Samenvatting

Ingewanden van de meeste insecten worden bewoond door complexe gemeenschappen van symbiotische pathogene bacteriën. Binnen deze microbiële gemeenschappen is het mogelijk om commensale of mutualistic bacteriesoorten identificeren. Deze laatste zijn waargenomen meerdere functies dienen om de insecten, dus helpen in insectencellen voortplanting ^1, stimuleren van de immuunrespons ^2, feromoonproductie ^3, alsmede voeding, waaronder de synthese van essentiële aminozuren ^4, onder anderen.

Vanwege het belang van deze associaties zijn veel pogingen gedaan om de gemeenschappen karakteriseren tot de afzonderlijke leden. De meeste van deze pogingen waren ofwel gebaseerd op teeltwijze of gebaseerd op de generatie van 16S rRNA genfragmenten die werden gesequenced voor definitieve identificatie. Helaas zijn deze benaderingen alleen die de bacteriële soorten in de darm en ontvangen geen information op de metabole activiteit van de micro-organismen.

Om de metabool actieve bacteriële species kenmerken in de darm van insecten, gebruikten we stabiele isotoop sonderen (SIP) in vivo toepassing van ^13C-glucose als universeel substraat. Dit is een veelbelovende-cultuur vrije techniek die de koppeling van microbiële fylogenieën maakt het mogelijk om hun specifieke metabole activiteit. Dit is mogelijk door het volgen van stabiele isotoop gemerkte atomen substraten in microbiële biomarkers, zoals DNA en RNA ^5. De opname van ^13C isotopen in DNA verhoogt de dichtheid van de gemerkte DNA vergeleken met het ongelabelde ⁽¹² C) een. Uiteindelijk wordt het ^{13C-gelabelde} DNA of RNA gescheiden door dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie van ¹² C-ongelabelde soortgelijk ^6. Daaropvolgende moleculaire analyse van de gescheiden nucleïnezuur isotopomeren zorgt voor de verbinding tussen metabole activiteit en identiteit van de soort.

Hier presenteren we het protocol dat wordt gebruikt om de metabolisch actieve bacteriën te karakteriseren in de darm van een generalist insect (ons model systeem), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). De fylogenetische analyse van het DNA werd gedaan met behulp pyrosequentiebepaling, waardoor hoge resolutie en nauwkeurigheid bij de identificatie van insectendarm bacteriegemeenschappen. Als voornaamste substraat werd ^{13C-gelabelde} glucose gebruikt in de experimenten. Het substraat werd toegevoerd aan de insecten met een kunstmatig dieet.

Inleiding

Insect-bacteriële symbiotische associaties staan ​​bekend om een groot aantal insectensoorten ^7. In deze symbiotische associaties, micro-organismen spelen een belangrijke rol bij de groei en ontwikkeling van insecten. Microben is aangetoond bijdragen aan insecten voortplanting ^1, feromoon biosynthese ^3, voeding, waaronder de synthese van essentiële aminozuren ⁴ en vertering van voedsel ontoegankelijk voor de gastheer. Ondanks de grote verscheidenheid van darm-bacteriële verenigingen, veel minder bekend over de functionele rol die zij spelen in het voordeel van het insect. Alleen bij de termieten, de symbiotische vertering van lignocellulose door prokaryoten, protozoa en fungi uitgevoerd uitgebreid bestudeerd werd ^8,9. In tegenstelling tot deze, is er weinig bekend over de symbiotische vereniging aanwezig in de darmen van generalist insecten, dwz de katoen leafworm, Spodoptera litteralis. Bovendien, omdat zij frequent verschuiving van plantaardige gastheren, algemeenist insecten en hun darm geassocieerde bacteriële gemeenschappen zijn permanent blootgesteld aan nieuwe uitdagingen in verband met hun voedingsgewoonten consumeren planten met een overvloed aan fytochemicaliën. Naast deze, de darm milieu lepidopterans, vormt op zich een ruwe omgeving voor de groei van bacteriën vanwege de hoge darm pH ^10. Vooral bij S. littoralis, varieert van 10,5 in de foregut, ca. 9 in de middendarm bijna 7 in de dikke darm ¹¹ pH. Anderzijds, de bacteriegemeenschappen verband met de darm van S. littoralis is eenvoudig. Tang, Freitak, et al.. ¹² rapporteerde maximaal 36 phylotypes behoren tot totaal 7 verschillende bacteriële species als de enige leden van de bacteriële gemeenschap waaraan deze insecten. Daarnaast is geen ingewikkelde fokken procedure vereist voor de groei insect in het laboratorium. Bovendien, deze en de korte levenscyclus van het insect te vergemakkelijken multi-generational studies, het draaien van deze soort tot een ideaal modelsysteem voor het bestuderen gut-microbe interacties.

Met de komst van PCR-gebaseerde sequencing technologie, is het aantal studies behandeling van darm biota van verscheidene organismen (bijvoorbeeld mensen, insecten of mariene organismen) verhoogd. Bovendien zal het resultaat zijn onafhankelijk van isolatie en kweek van de darm herbergden bacteriën in het verleden. Bijna 99% van de bacteriën zijn niet kweekbare en de simulatie van de milieu-omstandigheden in de darm is moeilijk ^12. Door PCR kan 16S rRNA genfragmenten (een veelgebruikt fylogenetische merkergen onder bacteriën) selectief worden geamplificeerd uit een gemengde DNA-matrijs van darm bacteriële, gesequenced en gekloneerd. Met deze informatie, de gebruiker kan de bacteriële species te identificeren dan de sequentie informatie ophalen uit openbare databanken ^13,14. Toch is de sequentie zal bacteriële beschrijvengemeenschappen onvoldoende blijven door gebrek aan informatie over de intrinsieke metabole bijdrage van de afzonderlijke soorten binnen de gemeenschap.

Stabiele isotoop sonderen (SIP) is een veelbelovende-cultuur free techniek. Het wordt vaak gebruikt in Environmental Microbiology microbiële fylogenie verband houden met bepaalde metabolische analyseert. Dit wordt bereikt door het volgen stabiele isotoop gemerkte atomen substraten in microbiële biomarkers, zoals fosfolipide afgeleide vetzuren, DNA en RNA ^5. Bij het ​​overwegen van nucleïnezuren, is de methode gebaseerd op de scheiding van ^{13C-gelabelde} DNA of RNA van het ongelabelde DNA door dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie ^6. Door deze directe verbinding tussen de DNA label en metabolische activiteit, een stroomafwaartse moleculaire analyse van de nucleïnezuren worden de soort en geeft informatie over metabolische activiteiten. Bovendien combinatie van DNA-SIP en pyrosequencing zoals toegepast doorPilloni, von Netzer, et al.. ^15, maakt een bijzonder eenvoudige en gevoelige identificatie van de bacteriële soorten in de zware ¹³ C-gelabelde DNA-fractie. Tot nu toe is deze techniek toegepast om de bacteriële gemeenschappen die betrokken zijn bij biogeochemische processen in de bodem onder aerobe en anaerobe omstandigheden ^{16,17 18,19} beschrijven. Naast het gebruik in milieukunde wordt de techniek toegepast in de medische wetenschappen zoals beschreven door Reichardt, et al.. ^5, die de metabolische activiteiten van verschillende fylogenetische groepen van de menselijke darmflora beschreven in reactie op een verteerbare koolhydraten.

Hier gebruiken we ^13C-glucose om "label" het DNA van de metabool actieve bacteriële soorten in de darm. Glucose is een suiker die door de meeste bacteriële species langs de brede Entner-Doudoroff (ED) route, hoewel uitzonderingen bekend ^20. Dezerechtvaardigt het gebruik van ¹³ C-glucose als een betrouwbare metabole sonde die een verband tussen metabolieten van belang en de bron koolstof langs gevestigde paden biedt. Afhankelijk van de wetenschappelijke vraag andere substraten, namelijk ¹³ C-methaan, ¹³ CO ₂ of planten onder een ¹³ _CO2 atmosfeer verhoogd, kan worden gebruikt voor metabolische activiteiten te pakken.

Op dit punt, presenteren wij het ​​protocol toegepast in de metabole karakterisering van de darm bacteriële gemeenschap van een generalist insect, namelijk S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Bovendien werd de techniek gekoppeld aan pyrosequencing, die op zijn beurt maakt de identificatie van insectendarm bacteriegemeenschappen met hoge resolutie en precisie. Als belangrijkste substraat werd ^{13C-gelabelde} glucose gebruikt tijdens de experimenten.

Protocol

1. Insect Steigerend

1. Kopen of er eieren klauwen van Spodoptera litteralis vanaf uw eigen opfok. Onderhoudsplicht in steriele Petrischalen bij kamertemperatuur (KT) tot uitkomen.
2. Bereid de kunstmatige voeding voor de insecten grootbrengen als volgt:
   1. Soak 500 g gemalen witte bonen een nacht in 100 ml water.
   2. Voeg 9,0 g ascorbinezuur en 75 g agar aan 1000 ml gedestilleerd _H2O en daarna kook het.
   3. Laat het mengsel afkoelen en wanneer het stolt (een witte wasachtige vaste stof mengsel) bewaard bij 4 ° C tot gebruik.
3. Breng de pas uitgekomen larven een schone plastic doos en achterste ze op de kunstmatige voeding bij 23-25 ​​° C onder een lange dag bestaand met 16 uur van verlichting en 8 uur duisternis. Verander het eten elke dag tot de larven gaan door alle zes larvale stadia.

2. ^13C-labeling van DNA in metabolisch actieve darmbacteriën

1. Los 186,1 mg volledig ^13C-gelabeld glucose met gedestilleerd en gedeïoniseerd water (DDH ₂ O) en goed mengen met 100 g kunstmatige voeding voor de SIP experiment. Zorgen definitieve ^13C-glucose concentratie van 10 mM in de kunstmatige voeding. Dit bootst de in situ glucoseconcentratie in de darm van S. littoralis larven voeden op katoenplanten volgens Shao et al.. (ingediend).
2. Transfer 9-15 larven gezond tweede instar uit de doos opfok tot steriele plastic petrischaaltjes (een larve per petrischaal) met vers ¹³ C-glucose spiked kunstmatige voeding. Gebruik kunstmatig dieet met dezelfde hoeveelheid natief glucose ⁽¹² C-glucose), zoals beschreven voor het voeden van de controlegroep.
3. Vernieuwen van de kunstmatige voeding vaak tijdens de incubatieperiode (1 dag). Gebruik kweekomstandigheden zoals in stap 1.3.
4. Verzamel negen larven van elke behandeling voor latere verwerking (DNA-extractie). Elkrepliceren wordt gevormd door drie personen; maken ten minste drie duplo's per behandeling.

3. Insect Dissection

1. Reinig en desinfecteer de dissectie instrumenten aan het begin van de werkzaamheden met ethanol 70% (Extra = Vannas schaar, pincet en scalpel met fijne wegwerp messen).
2. Neem de insecten met een zachte pincet en wassen hun huid oppervlakkig met gedestilleerd water. Plaats ze op ijs gedurende ten minste 30 minuten te verdoven.
3. Terwijl ze verdoofd plaats bij 0 ° C gedurende 1 uur om ze te doden. Ontsmet de dode insecten oppervlakkig door ze onder te dompelen in ethanol (70%) voor een paar minuten.
4. Voer het insect dissectie tot een volume van ongeveer 15 ml 1x PBS afgezet op een steriele petrischaal (1XPBS = 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na ₂ HPO _4, 1,47 mM KH _{2PO 4,} de pH op 7,4 , autoclaaf). Wees er zeker van dat het hele insect lichaam volledig ondergedompeld in de solution gedurende de hele periode ontleden.
5. Begin de dissectie door een incisie in de huid langs de rechter en linkerzijde van het insect, begint op de kop en eindigen op de anus. Verwijder de hele huid, buisjes van Malpighi, en vet lichaam. Ga verder met verse buffer voordat het opensnijden de darm. Sectie de darm in voor-, midden-, en hindgut indien nodig. Bewaar het weefsel in de vriezer (-80 tot -20 ° C) tot DNA-extractie

4. DNA-extractie en amplificatie

1. Plaats het insect weefsel in een 1,5 ml steriele centrifugebuis en droog alle monsters bij 45 ° C in een vacuüm concentrator inrichting. Crush gedroogd weefsel met een steriele plastic stamper.
2. Extraheer het genomische DNA met een geschikte kit bodem DNA-extractie. Breng de droge tissue de reactiebuis van de kit en de instructies zoals aangegeven door de fabrikant.
3. Bepaal de concentratie van de uiteindelijke geëlueerde DNA met een spectrofotometer.
4. Verifya succesvolle extractie van de microbiële metagenomic DNA van het insect darm door het opstellen van een diagnostische PCR-test met behulp eubacteriële algemene primers 27f (5 - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3) en 1492r (5 - GGTTACCTTGTTACGACTT -3). Stel de PCR-reactie als volgt:
   1. Plaats een 50 pl reactiemengsel dat 1x buffer, 1,5 mM _MgCl2, 10 mM vier deoxynucleoside trifosfaten (dNTPs), 2,5 U Taq DNA-polymerase, 0,5 mM van elke primer en 60 ng van het geëxtraheerde DNA als matrijs.
   2. Voer de PCR-reacties met behulp van een thermocycler als volgt: initiële denaturatie bij 94 ° C gedurende 3 min, gevolgd door 35 cycli: 94 ° C gedurende 45 seconden, hybridisatie bij 55 ° C gedurende 30 seconden en verlenging bij 72 ° C gedurende 1 min . Gebruik een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 10 minuten.
   3. Controleer de succesvolle PCR amplificatie in een 1% agarose elektroforese ethidiumbromide (EB) gekleurde gel (los 1 g agarose in 100 ml 1 x TAE buffer en vlek met 1 pi EB). Borg 5 ui the PCR product + 1 pi van 6x laden kleurstof in de gel zakken. (1x TAE = 40 mM Tris-base, 20 mM azijnzuur, 1 mM EDTA, op pH 8).
   4. Laat de gel met 1xTAE buffer bij 300 V, 115 mA gedurende ca.. 20 min in een elektroforese kamer. Door het gebruik van een gel documentatie kamer (UV transilluminator verbonden met een digitale camera en computer) observeer de gel en vergelijk de grootte van uw eindproduct met de ook geladen gen marker, de juiste maat van de amplicons moeten ongeveer 1,5 kb zijn.
5. Bewaar de PCR-producten onder diepe vrieskou, bij voorkeur -80 ° C tot gebruik.

5. DNA Scheiding-CsCl Gradient Ultracentrifugatie

1. Bereid de reagentia voor de gradiënten voor ultracentrifugeren als volgt:
   1. Bereid een 7,163 M cesiumchloride (CsCl) oplossing door het geleidelijk oplossen van 603,0 g CsCI in DDH ₂ O en vullen tot een eindvolume van 500 ml.
   2. Nauwkeurig Determine de dichtheid van de bereide CsCl oplossing wegen van een 1,0 ml aliquot van een evenwicht driecijferig door drievoud. Dit ligt meestal tussen 1,88 en 1,89 g / ml bij kamertemperatuur.
   3. Bereid de gradiënt buffer (100 mM Tris, 100 mM KCl en 1 mM EDTA) door het combineren van 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 8,0), 1 ml 0,5 M EDTA (pH 8) en 3,75 g KCl in een definitieve volume van 500 ml met behulp van DDH ₂ O. Filter (0,22 pm) steriliseren en autoclaaf deze oplossing.
2. DNA-scheiding
   1. Na te hebben vastgesteld de individuele DNA-concentratie van de behandelde insecten, gemeten als in punt 4.3, zwembad die insecten die overeenkomt met een repliceren elkaar en normaliseren van hun DNA-concentratie te zorgen dat een ieder, in gelijke mate bijdraagt ​​aan het samengevoegd monster. Een eindconcentratie van 500-5000 ng DNA (opnieuw meten de eindconcentratie) is geschikt voor het ultracentrifugatie proces ^21.
   2. Voor het instellen van het verloop medium, combineren de gekwantificeerde DNA, gradiëntbuffer eend 4.8 ml 7,163 M CsCl oplossing samen om een ​​gemengde volume van 6,0 ml in een steriele 15 ml schroefdop buis (vorming van een gradiënt medium-DNA-mengsel).
   3. Plaats het voorbereide gradiëntmedium-DNA mengsel in een 5,1 ml ultracentrifuge buis (vul in, totdat de onderkant van de buis nek) met een spuit en naald. Vermijd het pompen of vormen van eventuele luchtbellen. Ten minste een lege gradiënt (met behulp van DDH ₂ O in plaats van DNA) in iedere centrifuge run als referentie verloop.
   4. Balance buis paren om binnen 10 mg van het gewicht na elke gewenste gradiënt medium wordt gevuld in de respectieve ultracentrifuge buis. Dicht de buis met een "Tube Topper" en ervoor te zorgen dat de afdichting is lekvrij door het buisje en het toepassen van matige druk met de hand.
   5. Gebruik een bijna verticale rotor met acht putten voor het houden van 5,1 ml ultracentrifuge buizen voor de ultracentrifuge. Verzegelen voorzichtig de rotor putten en laden de rotor in de ultracentrifuge volgens de mainstructies brikant's. Stel de ultracentrifugatie voorwaarden: centrifugeren op 50.000 rpm (ongeveer 177.000 xg), temperatuur 20 ° C en ultracentrifugatie looptijd voor 40 uur met vacuum. Selecteer maximale versnelling en de vertraging zonder rem.
   6. Eenmaal klaar, voorzichtig de buizen uit de centrifuge rotor met behulp van een tang. Plaats ze in een rek zonder de gevormde gradiënten binnen de buizen. Verwerk de gradiënt fractionering monsters zo snel mogelijk om diffusie te minimaliseren.
3. Ophalen van DNA van isopycnische Gescheiden Verlopen door fractionering
   1. Gebruik een nauwkeurige HPLC-pomp systeem voor het uitvoeren van de gradiënt fractionering, die even scheidt de gevormde hellingen van de ultracentrifuge buis boven verplaatsing methode. Sluit de HPLC-pomp (100% stroomgradiënt) aan de fles gevuld met 1 liter cilinderinhoud DDH ₂ O en stevig hechten aan de open pomp buis met een 23 G 1 in naald van de spuit. Voeg voldoende bromophenol blauwe kleurstof om de DDH ₂ O om het een donkerblauwe kleur. Dit maakt de visualisatie van de interface tussen het verloop medium en de verplaatsing van DDH ₂ O.
   2. Zet de pomp aan een debiet van 850 pl / min en evenwicht het systeem tot een enkele druppel van de blauw gekleurde DDH ₂ O komt uit de naald van de spuit.
   3. Fix zorgvuldig de ultracentrifuge buis om een ​​klem staan ​​en prik de bodem van de buis met een spuit 23 G 1 in lange naald. Sluit de pomp aan de ultracentrifuge buis door de naald aan de pompslang in de bovenkant van de buis, en dalingen van de bodem te verzamelen rechtstreeks in steriele 1,5 ml microcentrifuge buizen. Verzamel een fractie elke 30 seconden, een bedrag van ongeveer 425 ul per fractie en een totaal van 12 fracties per verloop. Merk op dat de laatste fractie (fractie 12) bevat meestal de verplaatsing DDH ₂ O en moet worden weggegooid.
   4. Na fractionering, measure de dichtheid van alle gescheiden fracties met behulp van een analytische balans zoals vermeld in punt 5.1.2.
   5. Precipiteer het DNA uit elke fractie (ongeveer 425 pl) door eerst 1 ui glycogeen (20 ug / ul in DDH ₂ O, geautoclaveerd) als drager voor de precipitatie van lage hoeveelheid DNA. Meng het goed door.
   6. Twee volumes (850 pl) van polyethyleenglycol (PEG)-oplossing (opgelost 150 g polyethyleenglycol 6000 en 46,8 g NaCl in DDH ₂ O tot een totaal volume van 500 ml. Filter, steriliseren en autoclaaf. Het PEG oplossing 30 % PEG 6000 en 1,6 M NaCl) en meng opnieuw door het omkeren tien keer.
   7. Laat de buizen bij kamertemperatuur gedurende ten minste twee uur (eventueel 's nachts) om het DNA te precipiteren.
   8. Centrifugeer de precipitaten bij 13.000 xg gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Een zichtbare pellet moeten vormen.
   9. Verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet en was het pellet met 500 pi van 70% ethanol. Centrifugeer onder dezelfdevoorwaarden voor 10 min weer.
   10. Gooi voorzichtig de bovenstaande vloeistof en lucht-droog de pellet bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
   11. Los het gedroogde DNA pellet in 30 ul van DDH ₂ O en meng goed door de buis zachtjes tikken. Kwantificeren van de DNA in elk gradiënt fractie als in stap 4.3 Store de monsters onder -20 of -80 ° C of langdurige opslag is niet vereist.

6. DNA Karakterisering door Pyrosequencing

1. Controleer of de ongelabelde natieve ⁽¹² C) DNA neemt de dichtheid variëren van 1,705 g / ml tot 1,720 g / ml, terwijl ^{13C-gelabelde} DNA een dichtheid van ongeveer 1,720-1,735 g / ml. Merk op dat zowel de autochtone en ¹³ C-gelabeld DNA geëxtraheerd uit milieu monsters meerdere gradiënt fracties kunnen overspannen. Verwacht het licht DNA geassocieerd te worden met breuken 9-11 en de zware DNA geassocieerd te worden met breuken 4-6.
2. Combineer sleutel fracties om een ​​"samengesteld" representatief deel ac creërengens de specifieke piek verdeling van de dichtheid opgelost DNA. Alternatief kunnen andere middelen om de afgescheiden fracties onderzocht met de isotopenverhouding massaspectrometrie (IRMS) ²² of fingerprintingmethode zoals denaturerende gradiënt gelelektroforese (DGGE) ^23, helpen om passende fracties kiezen voor de sequencing.
3. Voer pyrosequencing van de PCR-versterkte bacteriële 16S rRNA genen van de gecompileerde zware, midden en lichte fracties van elk individueel verloop. Met deze methode, identificatie van het geslacht en relatieve abundantie van metabool actieve bacteriesoorten in de SIP geïncubeerde monsters mogelijk. Voer pyrosequencing als volgt:
   1. Voer amplicon pyrosequencing met behulp van een Roche 454 FLX instrument met Titanium reagentia.
   2. Bereid streepjescode amplicons voor het multiplexen met de fusie primer set Gray28F (5 - GAGTTTGATCNTGGCTCAG -3) en Gray519r (5 - GTNTTACNGCGGCKGCTG -3) ^24,25 verlengd met the respectievelijke primer Adaptor A / B en sample-specifieke multiplex identifiers (MID).
   3. Breng een een-staps PCR met 30 cycli, met behulp van een Hot Start Taq-polymerase, de sequencing bibliotheek te genereren.
   4. Sequentiëren de amplicons gebaseerd op de leverancier protocol, en uitbreiding van de leest van de voorwaartse richting (Gray28F) zoals beschreven in http://www.researchandtesting.com/ .

7. Pyrosequencing Data Analysis

1. Analyseer de ruwe volgorde leest gegenereerd door de 454 pyrosequencing met de "kwantitatieve inzichten in microbiële ecologie", QIIME software pijpleiding ^26. Voer de verwerking als volgt:
   1. Aanvankelijk zetten de 454-machine-gegenereerde sff bestand naar FASTA, QUAL en Flowgram bestanden met de process_sff.py script.
   2. Valideren van de mapping-bestand (gebaseerd op check_id_map.py) en wijs multiplex leest aan biologische samselen met de split_libraries.py script. Trim de lage kwaliteit eindigt met een schuifraam grootte van 50 en een gemiddelde kwaliteit cutoff parameter van 25, elimineren ook korte dubbelzinnig sequenties (de lengte <200 bp) uit de dataset.
   3. DeNoise de data 454 met behulp van de denoise_wrapper.py.
   4. Vervolgens cluster de hoge kwaliteit leest in operationele taxonomische eenheden (OTU's) met behulp van de meervoudige OTU plukken methode (pick_otus.py met 97% sequentie-overeenkomst cut-offs).
   5. Kies een representatieve reeks van elkaar OTU gebruik pick_rep_set.py.
   6. Taxonomie toewijzen aan de vertegenwoordiger opeenvolgingsgroep gebaseerd op assign_taxonomy.py. Gebruik de Ribosomaal Database Project (RDP) classifier met een minimum vertrouwen op te nemen opdracht ingesteld op 0.80.
   7. Lijn de vertegenwoordiger volgorde tegen de prealigned Greengenes kern 16S sequenties met behulp van het algoritme PyNast (align_seqs.pymet de minimale sequentie-identiteit procent ingesteld op 75).
   8. Bovendien, afbrekende hersenschimmen van verdere analyse door het uitvoeren identify_chimeric_seqs.py.
   9. Verwijder alle gap posities (niet handig voor fylogenetische gevolgtrekking) met de lanemask sjabloon (filter_alignment.py) voorafgaand aan de bouw van een fylogenetische boom (make_phylogeny.py).
   10. Tenslotte genereren OTU tafels met make_otu_table.py, beschrijven het optreden van bacteriële phylotypes binnen elk monster. Gebruik de OTU tabel om de heatmap te construeren voor het vergelijken van de bacteriële overvloed en activiteit.
   11. Indien nodig, berekenen de alfa-en bèta diversiteit binnen en tussen de monsters, respectievelijk. Op dezelfde wijze kan verdunning krommen (grafieken van diversiteit versus sequencing diepte) en Principal coördinaten Analysis (PCOA) percelen die de relaties tussen microbiële ook worden bereid.

Resultaten

Om voldoende etikettering van de metabolisch actieve bacteriën in de insectendarm bereiken, moet de insecten worden blootgesteld aan de ¹³ C-rijke substraat voor een eerder geoptimaliseerde voldoende tijd voor de scheiding van de gelabelde zwaardere fractie gemakkelijk mogelijk van ongelabelde lichtere. In ons geval werd ^13C-glucose aangevuld de kunstmatige voeding bij een uiteindelijke concentratie van 10 mM tot 1 dag (figuur 1A). Dezelfde hoeveelheid normale glucose (fig....

Discussie

De darm van de meeste insecten herbergt een rijke en complexe microbiële gemeenschap, meestal 10 ⁷ -10 ⁹ prokaryote cellen dienen er een verhouding eigen cellen van de gastheer in de meeste gevallen. Zo is de insectendarm is een "hot spot" voor diverse microbiële activiteiten, die meerdere aspecten van microbiële relaties, van pathogenese naar mutualisme ²⁷ obligaat. Hoewel veel studies een verbazingwekkende verscheidenheid aan insecten darm microbiële gemeenschappen, hebben be...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dumont #5 Mirror Finish Forceps	Fine Science Tools	11251-23
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-00
Speed Vacuum Concentrator 5301	Eppendorf Germany	5305 000.304
Plastic pestle	Carl Roth GmbH Co. Germany	P986.1
NanoVue spectrophotometer	GE HealthCare, UK	28-9569-58
Mastercycler pro/thermocycler	Eppendorf Germany	6321 000.515
Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber	Biometra	Discontinued
Ultracentrifuge (Optima L-90K)	Beckman	A20684
Ultracentrifuge rotor (NVT 90)	Beckman	362752
HPLC pump	Agilent	1100
Quick-Seal, Polyallomer tube	Beckman	342412
Transilluminator UVstar 15	Biometra