Een procedure die een demonstratie van robuuste vergroting van op zoek naar drugs in voedsel beperkt ratten laat wordt beschreven. Na heroïne zelftoediening training, ratten gaan door een periode van onthouding, in een drugsvrije omgeving, waarin ze zijn mild eten beperkt. Op zoek naar drugs wordt dan getest in de drugs-geassocieerde omgeving.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een procedure om het effect van langdurig Eten Beperking Heroïne zoek naar in Abstinent Ratten Studie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In menselijke drugsverslaafden, kan blootstelling aan drugs-geassocieerde signalen of omgevingen die eerder werden geassocieerd met drugsgebruik leiden recidief tijdens onthouding. Bovendien kunnen diverse milieu-uitdagingen van dit effect, evenals het verhogen van de lopende inname van het geneesmiddel verergeren.
De procedure die we hier beschrijven wijst op de gevolgen van een gemeenschappelijk milieu-uitdaging, voedsel beperking, voor de drugs verlangen dat wordt uitgedrukt als een vergroting van op zoek naar drugs in abstinent ratten.
Ratten worden geïmplanteerd met chronische intraveneuze katheters iv, en vervolgens getraind om op een hefboom voor iv heroïne over een periode van 10-12 dagen. Na de heroïne zelf toedienen fase de ratten worden verwijderd uit de operante conditionering kamers en is gevestigd in het dier zorginstelling voor een periode van ten minste 14 dagen. Terwijl de ene groep wordt gehandhaafd onbeperkte toegang tot voedsel (verzadigd groep), wordt een tweede groep (FDR groep) blootgesteld aan een mild voedselrestrictie regime dat resulteert in hun lichaamsgewicht gehandhaafd op 90% van hun nonrestricted lichaamsgewicht. Op dag 14 van voedsel beperking de ratten terug naar de drug-training omgeving overgebracht, en een zoek naar drugs-test wordt uitgevoerd onder uitsterven omstandigheden (dwz. Hefboompersen niet leiden tot heroïne levering).
De hier gepresenteerde procedure resulteert in een zeer robuust vergroting van heroïne zoekende op testdag in het voedsel beperkt ratten. In vergelijking met de acute voedseltekorten manipulaties we eerder hebben gebruikt, de huidige procedure is een meer klinisch relevant model voor de impact van de calorische restrictie op zoek naar drugs. Bovendien zou het dichter bij de menselijke conditie als de ratten niet verplicht om te gaan door middel van een extinctie-training fase voordat de zoek naar drugs-test, die is een integraal onderdeel van de populaire herstel procedure.
Inleiding
Een van de grootste problemen bij de behandeling van drugsverslaving is de hoge mate van terugval, ook na een langere periode van onthouding 1,2. Studies bij de mens verslaafden hebben een kritische bijdrage van milieu-uitdagingen, zoals de blootstelling aan drugs geassocieerd discrete signalen of omgevingen 3 en stressvolle gebeurtenissen in het leven 4, tot terugval geïdentificeerd. Een gemeenschappelijke milieu-uitdaging die werd gevonden om een effect op drugsgebruik en verlangen hebben is chronische voedselonzekerheid beperking. Bijvoorbeeld is gerapporteerd dat chronische warmtebeperking is geassocieerd met verhoogde roken van sigaretten 5. Bovendien is op dieet ernst (calorische restrictie) positief gecorreleerd met een verhoogde prevalentie van drugsgebruik bij jonge vrouwen 6. Echter, de onderliggende mechanismen in de hersenen niet volledig begrepen.
Vanwege praktische en ethische overwegingen met betrekking tot het menselijk onderzoek, diermodellen have ontwikkeld om de relevante neurale mechanismen te identificeren. We hebben eerder gebruik gemaakt van de hernieuwde toelating 7,8 tot hervatting van de uitgedoofde zoek naar drugs te tonen bij ratten die zijn blootgesteld aan acute (24-48 uur) voedselontbering 9,10. Echter, een integraal onderdeel van de hernieuwde toelating is een uitsterven periode dat is niet een gemeenschappelijk kenmerk van verslaving behandelingen 11 (maar zie Epstein et al.. 12 voor een uitgebreide discussie over de geldigheid van de hernieuwde toelating). Bovendien, in het specifieke geval van dieet manipulaties bij de mens, alleen chronische voedselonzekerheid beperking, maar niet acuut onthouden van voedsel, bleek effectief te verhogen dopinggebruik 5,13.
Daarom hebben we een "onthouding procedure" 14 dat de studie van de effecten van chronische voedselonzekerheid beperking op zoek naar drugs laat gesuggereerd. Met deze procedure hebben wij recent een sterke vergroting van heroin zoek in abstinente ratten na blootstelling aan 14 dagen van milde voedsel beperking 15.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Dieren
Alle ratten worden behandeld in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadese Raad over Animal Care en de goedkeuring van alle experimentele procedures werd door de Concordia University Animal Research Ethics Committee verleend.
- Verkrijgen ratten bij 275-300 g (mannetjes) of 225-250 g (vrouwen). Huis ratten in paren tot chirurgie in standaard plastic kooien maïskolf beddengoed en papiersnippers bevatten.
- Handhaaf ratten op een omgekeerde licht-donker cyclus (licht uit bij 9:30).
- Zorg ervoor dat voedsel en water zijn ad libitum beschikbaar, behalve tijdens de periode van onthouding. We maken gebruik van een gewone rat chow (20,9% eiwit, 67,2% koolhydraten en 11,8% vet).
2. Katheters en Connectoren
- Voeg katheters in bulk als nodig gedurende een lange periode na autoclaaf sterilisatie.
- Snijd de Silastic slang aan 12 cm lange stukken.
- Gebruik een tandenstoker, een kleine te plaatsendruppel silicium rond de katheter 3 cm van de punt.
- Laat de siliconen droog gedurende 24 uur en vervolgens autoclaaf en bewaar de katheters.
- Buig de lange buis van de "5-up" canule, die zal dienen als een connector in een rechte hoek op de kunststof sokkel, dan autoclaaf en opslag.
- Monteer, aseptisch, de katheters op de dag van de operatie, door op de "lange" zijde van de buis Silastic via gebogen metalen buis van de "5-up" canule, ongeveer halverwege de kunststof sokkel.
- Sluit de "5-up" buis via Tygon slangen en een afgestompte 22 G naald om een 1 ml injectiespuit gevuld met een steriele zoutoplossing.
- Spoel zoutoplossing door de katheter om een onbelemmerde doorstroming te garanderen.
3. Intraveneuze catheterisatie Chirurgie
- Laat de ratten een week van acclimatisatie in het dier zorginstelling (ACF) voor de operatie. Heeft de operatie niet uitvoeren op ratten met een lichaamsgewicht lagerdan 300-325 g (mannetjes) of 250-275 g (vrouwen).
- Voor de operatie wegen en verdoven de ratten met een ketamine / xylazine mengsel (90/13 mg / kg, ip).
- Scheren, en reinig het hoofd en het gebied aan de rechter schouder (vlakbij basis van de hals) met alcohol en chirurgische scrub.
- Injecteer penicilline (450.000 IU / rat, sc) te beschermen tegen infectie en 2 ml zoutoplossing (sc) voor hydratatie. Breng scheur gel ogen van de rat tot droog veroorzaakt door anesthesie voorkomen.
- Plaats de rat op de buik en een insnijding, met een scalpel, aan de bovenkant van de kop tussen de ogen en caudaal naar de oren van de rat.
- Plaats de rat op zijn rug met de onderarmen plakband aan de oppervlakte. Til de huid in de incisie gebied, net rostraal van het sleutelbeen, met een tang en een 1 cm in lengterichting snijden met een klein schaartje.
- Met behulp van twee rechte tang, scheiden het vet en ander weefsel totdat de externe halsader vein is blootgesteld.
- Druk de uiteinden van rechte tang onder de ader op te tillen en te scheiden van de ader van het omringende weefsel. Reinig zorgvuldig de ader van vastzittende weefsel en plaats vervolgens gebogen pincet onder de ader te houden opgetild en enigszins uitgerekt.
- Voeg een kleine, V-vormige, bezuinigen op het bovenoppervlak van de ader met kleine lente schaar.
- Houd de opengesneden met een vaatdilatator, en vooraf de "korte", 3 cm tip van de katheter in de ader naar het hart tot de siliconen druppel is op de incisie punt.
- Bind de katheter de ader met 3 hechtingen: een caudaal zoveel mogelijk een net rostraal van de siliconen vallen en derde zoveel mogelijk rostraal.
- Passeren zoutoplossing door de katheter na elke hechting te zorgen dat het vrij blijft en dat de hechtingen niet te strak.
- Verwijder de tape rond de armen en plaats de rat ventrale kant naar beneden.
- Plaats een hemostaat through de caudale kant van de kop incisie en druk om de huid te scheiden van het onderliggende weefsel een subcutane "pocket" te creëren.
- Leid de hemostaat onder de huid naar de opening op de schouders waar de katheter is ingebracht.
- Doorbreken bindweefsel met de hemostaat, en stevig klem de catheter in de rostrale punt onder de basis van de "5-up."
- Maak de "5-up" en steek het lange uiteinde van de katheter onder de huid en uit de incisie zich aan de bovenkant van het hoofd van de rat.
- Gebruik een schaar om de katheter onder de plaats waar de hemostaat werd geklemd gesneden en sluit het lange eind van de "5-up."
- Trek de katheter langs de metalen schacht van de "5-up" tot aan het plastic voetstuk. Passeren zoutoplossing door de vrije doorstroming te garanderen.
- Plaats de rat op zijn rug, en hechten alleen de incisie in de buurt van het sleutelbeen. Het hoofd incisie moet remain de open.
- Plaats de rat in een stereotaxische apparaat. Trek de huid weg bij de incisie aan de bovenkant van het hoofd met behulp bulldog klemmen en schoon en droog het oppervlak van de schedel.
- Gebruik een handleiding boor, om 04:56 gaten boren in de schedel en steek machine schroeven in de gaten om op te treden als steigers voor de hoofd-cap.
- Plaats de "5-up"-connector tussen de schroeven en plooi de overtollige lengte van de katheter in de onderhuidse "pocket" eerder gemaakt met behulp van de hemostaat.
- Gebruik tandcement aan de "5-up" naar de bovenkant van de schedel brengen. Haal de rat uit de stereotaxische apparaat nadat het cement volledig gedroogd.
- Geef de rat postoperatieve zorg, bestaande uit ketoprofen (analgetisch, 5 mg / kg, sc) en 2 ml zoutoplossing (sc). Dien ketoprofen voor een extra 2 dagen na de operatie om te helpen met pijnbestrijding.
- Gaat 48 uur na een operatie, flush ratten dagelijks wet een mengsel van heparine en gentamicine in steriele zoutoplossing (7,5 IE + 12 ug; 0,2-0,3 ml) gedurende de herstelperiode van ~ 2 dagen en door de heroïne zelftoediening fase.
4. Behavioral Procedure
De tijdlijn voor de procedure van voedsel-beperking geïnduceerde vergroting van heroïne zoekende is weergegeven in figuur 1.
- Operante conditionering kamers.
- Huis ratten individueel in operante conditionering kamers ingesloten in geluiddempende houten compartimenten uitgerust met een ventilator.
- Elke kamer bestaat uit een roestvrij stalen metalen rooster vloer, een voor-en achterkant plexiglas wand en twee metalen paneel zijwanden. Mount twee intrekbare hefbomen 9 cm boven de vloer van de rechter zijwand, en zoek een cue-licht boven elke hefboom. Inspelen op de drug-gepaarde (actieve) hendel activeert een infuuspomp en tegelijk tegemoetkomen aan de-nondrug gepaarde (inactieve) hendel heeft geen programmeerbare gevolgen.
- Zoek een toon module (2,9 kHz) boven de actieve hefboom, en plaats een rood huis-licht op de top-centrum van de linker zijwand.
- Sluit de drug pomp aan de katheter via een vloeistof draaibare en Tygon slangen beschermd met een metalen veer. Bovendien, uit te rusten elke kamer met een voedsel hopper en een fles water ongehinderde toegang tot voedsel en water.
- Gewenning dag:
- Na herstel van een operatie verplaatsen de ratten aan de operante opleiding kamers en zorgen voor een 24-uurs gewenningsperiode.
- Heeft de ratten niet aan op de metalen veer en niet de cue-light/tone complex niet te activeren.
- Zorg ervoor dat de actieve hefboom blijft ingeschoven, maar zorgen voor de inactieve hendel wordt uitgebreid om te helpen met de discriminatie tussen de twee hendels tijdens de training.
- Heroïne zelf-administratie:
- Sluit de 5-up connector aan op de Tygon buis en bevestig de metalen veer.
- Laat de ratten zelf-administer heroïne (0,1 mg / kg / infusie) gedurende 10 dagen gedurende drie 3 uur sessies gescheiden door 3 uur intervallen.
- Begin elke sessie na het begin van de donkere fase (ongeveer 9:30 in ons laboratorium) de uitbreiding van de actieve en inactieve hefbomen, alsmede verlichting van het huis licht en activering van de cue-light/tone complex 30 sec.
- Reacties op de actieve hefboom resultaat in de activering van het geneesmiddel pomp (5 sec, 0,13 ml / infusie) en de start van een 20 seconden time-out periode waarin de huis-licht wordt uitgeschakeld en de cue licht / toon complex boven de actieve hendel geactiveerd (FR-1, 20 sec timeout). Tijdens de time-outperiode, worden actieve hefboom reacties opgenomen, maar niet versterkt. Inactieve hendel reacties worden opgenomen maar hebben geen programmeerbare gevolgen.
- Na elke 3 uur sessie, wordt de actieve hendel ingetrokken terwijl de inactieve hendel blijft verlengd tot 1 uur voor de eerste sessie van de volgende dag.
- Onthouding en voedsel beperking:
- Na zelfbestuur training, verwijder de ratten uit de operante conditionering kamers en individueel huisvesten ze in de ACF, en geeft onbeperkte toegang tot voedsel en water voor een drug-wash-out dag.
- Verdeel de ratten in twee groepen: voedsel beperkt (FDR) of verzadigd, afgestemd op basis van lichaamsgewicht, aantal infusies en actieve hefboom reacties over de laatste 5 dagen van de opleiding.
- Naar aanleiding van de drug-wash-out dag, verwijder het voedsel van de FDR ratten ', en voer ze ongeveer 15 g rattenvoer op 1:30. Pas de hoeveelheid voedsel die in 14 dagen van onthouding aan de FDR ratten lichaamsgewicht (BW) te behouden om ongeveer 90% van hun eigen basislijn BW.
- Op zoek naar drugs-test: Op de ochtend van onthouding dag 14, de terugkeer van de ratten naar de operante conditionering kamers en voeg ze toe aan de metalen veer. Gebruik een 1 uur of 3 uur sessie waarbij actieve en inactieve hefboom reacties dezelfde gevolgen hebben en eens in zelftoediening training, exclusief de beschikbaarheid van het geneesmiddel (dat wil zeggen onder omstandigheden extinctie).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Lichaamsgewicht in de tijd: Typische resultaten tonen aan dat het lichaamsgewicht stabiel blijven gedurende heroïne zelftoediening training. Tijdens onthouding, ratten met onbeperkte toegang tot chow verhogen hun lichaamsgewicht, terwijl degenen die voedsel beperkt hun lichaamsgewicht verlaagt tot ongeveer 90% van hun oorspronkelijke gewicht of 75-80% van de sated ratten lichaamsgewicht (figuur 2) .
Infusions, actieve en inactieve hefboom reacties over opleiding:
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De hier beschreven procedure heeft een sterke face validity omdat 1) het zorgt voor vrijwillige inname van het geneesmiddel en de controle over het toedienen van medicijnen, 2) het gebruik van een toedieningsweg dat gebruikelijk is in de menselijke verslaafden, 3) het reflecteert (relatief) langdurig blootstelling aan het geneesmiddel en onthouding, en 4) het vermijdt het uitsterven training voor de zoek naar drugs-test die integraal deel uitmaakt van de hernieuwde toelating, maar wordt zelden waargenomen in menselijke ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Goedkeuring voor alle experimentele procedures werd verleend door de Concordia University Animal Research Ethics Committee, in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadese Raad over Animal Care. De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen. FS en TD eveneens bijgedragen aan de ontwikkeling van het hier en het schrijven van het manuscript gepresenteerde procedure.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Natural Sciences & Engineering Discovery Program Council (US: 298.915), het Fonds de Recherche du Quebec - Sante (CSBN), en de Canada Research Stoelen Program (US).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | |
| Ketamine (Vetalar, 100 mg/ml) | Bioniche Animal Health | Verkregen via lokale distributeur | |
| Xylazine (Rompun, 100 mg/ml) | Bayer | Verkregen via lokale distributeur | |
| Heroïne HCl | National Institute for Drug Abuse, Research Triangle Park, NC, USA | ||
| Anafen-injectie 1 mg/ml Fless/20 ml | CDMV, Canada | 12868 | |
| Uitrusting | |||
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | |
| Silastic-buis (ID 0,02, OD 0,037) | Fisher Scientific | 1118915A | |
| GE marine silicon | GE | SE-1134 | |
| Tygon-buis (ID 0,02, OD 0,060) | VWR | 63018-044 | |
| Kanules (22 G, 5-up) | Plastics One | C313G-5up | |
| Vloeistofdraaikoppeling, plastic, 22 G | Lomir Biomedical, Inc. | RSP1 | |
| Vaste snelheid infuuspomp (3,3 rpm) | Coulbourn Instruments | A73-01-3.3 | |
| Rattentestkooi | Coulbourn Instruments | H10-11R-TC | |
| RVS roostervloer | Coulbourn Instruments | H10-11R-TC-SF | |
| Huislicht-rat | Coulbourn Instruments | H11-01R | |
| Enkel hoog heldere aanwijzing-rat | Coulbourn Instruments | H11-03R | |
| Toonmodule 2,9 kHz | Coulbourn Instruments | H12-02R-2.9 | |
| Intrekbare hendel-rat | Coulbourn Instruments | H23-17RA | |
| Balansarm | Coulbourn Instruments | H29-01 | |
| Gelasluitingsboxen | Concordia University | Zelf gemaakt | |
| Systeemcontroller 2 | Coulbourn Instruments | SYS CTRL 2 | |
| Systeemvoedingsbasis | Coulbourn Instruments | H01-01 | |
| Habitest Universal Linc | Coulbourn Instruments | H02-08 | |
| Omgevingsverbindingsbord & Linc-kabel | Coulbourn Instruments | H03-04 | |
| Graphic State Notation 3 | Coulbourn Instruments | GS3 |
Referenties
- Jaffe, J. H. Drug addiction and drug abuse. Goodman & Gilman's the pharmacological basis of therapeutics. Gilman, A. G., Rall, T. W., Nies, A. S., Taylor, P. , Pergamon Press. New York. 522-573 (1990).
- O'Brien, C. P., McLellan, A. T. Myths about the treatment of addiction. Lancet. 347, 237-240 (1996).
- Childress, A. R., Ehrman, R., Rohsenow, D. J., Robbins, S. J., O'Brien, C. P. Classically conditioned factors in drug dependence. Substance abuse: A comprehensive textbook. Lowinson, J. W., Luiz, P., Millman, R. B., Langard, G. , Williams and Wilkins. Baltimore. 56-69 (1992).
- Sinha, R. How does stress increase risk of drug abuse and relapse? Psychopharmacology. 158, 343-359 (2001).
- Cheskin, L. J., Hess, J. M., Henningfield, J., Gorelick, D. A. Calorie restriction increases cigarette use in adult smokers. Psychopharmacology. 179, 430-436 (2005).
- Krahn, D., Kurth, C., Demitrack, M., Drewnowski, A. The relationship of dieting severity and bulimic behaviors to alcohol and other drug use in young women. J. Subst. Abuse. 4, 341-353 (1992).
- de Wit, H., Stewart, J. Reinstatement of cocaine-reinforced responding in the rat. Psychopharmacology. 75, 134-143 (1981).
- Shaham, Y., Shalev, U., Lu, L., De Wit, H., Stewart, J. The reinstatement model of drug relapse: history, methodology and major findings. Psychopharmacology. 168, 3-20 (2003).
- Shalev, U., Highfield, D., Yap, J., Shaham, Y. Stress and relapse to drug seeking in rats: studies on the generality of the effect. Psychopharmacology. 150, 337-346 (2000).
- Tobin, S., Newman, A. H., Quinn, T., Shalev, U. A role for dopamine D1-like receptors in acute food deprivation-induced reinstatement of heroin seeking in rats. Int. J. Neuropsychopharmacol. 12, 217-226 (2009).
- Katz, J. L., Higgins, S. T. The validity of the reinstatement model of craving and relapse to drug use. Psychopharmacology. 168, 21-30 (2003).
- Epstein, D. H., Preston, K. L., Stewart, J., Shaham, Y. Toward a model of drug relapse: an assessment of the validity of the reinstatement procedure. Psychopharmacology. 189, 1-16 (2006).
- Zacny, J. P., de Wit, H. The effects of a restricted feeding regimen on cigarette smoking in humans. Addict. Behav. 17, 149-157 (1992).
- Fuchs, R. A., Lasseter, H. C., Ramirez, D. R., Xie, X. Relapse to drug seeking following prolonged abstinence: the role of environmental stimuli. Drug Discov. Today Dis. Models. 5, 251-258 (2008).
- D'Cunha, T. M., Sedki, F., Macri, J., Casola, C., Shalev, U. The effects of chronic food restriction on cue-induced heroin seeking in abstinent male rats. Psychopharmacology. 225, 241-250 (2013).
- Caprioli, D., Celentano, M., Dubla, A., Lucantonio, F., Nencini, P., Badiani, A. Ambience and drug choice: cocaine- and heroin-taking as a function of environmental context in humans and rats. Biol. Psychiatry. 65, 893-899 (2009).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
