Methodenartikel

Het identificeren van DNA-mutaties in Gezuiverd hematopoietische stamcellen / progenitorcellen

DOI:

10.3791/50752

⸱

24 februari 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Greehey Children's Cancer Research Institute, UT Health Science Center at San Antonio, 2Department of Cellular and Structural Biology, UT Health Science Center at San Antonio, 3Department of Pathology, UT Health Science Center at San Antonio, 4Department of Microbiology, UT Health Science Center at San Antonio, 5Cancer Therapy and Research Center, UT Health Science Center at San Antonio

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een in vivo mutagenese test voor kleine aantallen hematopoietische cellen gezuiverd met de Lacl transgene muismodel. De Lacl gen kan worden geïsoleerd om de frequentie, locatie en soort DNA mutanten spontaan ontstaan ​​of na blootstelling aan genotoxinen bepalen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De laatste jaren is gebleken dat genomische instabiliteit nauw gerelateerd aan vele ontwikkelingsstoornissen, kanker en veroudering. Gezien het feit dat stamcellen zijn verantwoordelijk voor weefselhomeostase en reparatie gedurende het hele leven, is het redelijk om te veronderstellen dat de stamcel populatie is van cruciaal belang voor het behoud van genomische integriteit van de weefsels. Daarom is er aanzienlijke belangstelling ontstaan ​​bij de beoordeling van de impact van de endogene en omgevingsfactoren op genomische integriteit in stamcellen en hun nakomelingen, gericht op de etiologie van stamcel-ziekten te begrijpen.

Lacl transgene muizen dragen een herstelbare λ faag coderend voor het Lacl reporter systeem, waarbij de Lacl gen dient als mutatie reporter. Het resultaat van een gemuteerd Lacl gen de productie van β-galactosidase, dat een chromogeen substraat klieft, draaien blauw. De LacI reporter systeem is uitgevoerd in alle cellen, met inbegrip van stam / voorlopercellen en kan eenvoudig worden teruggewonnen en gebruikt vervolgens infecteren E. coli. Na incubatie geïnfecteerde E. coli op agarose dat de juiste substraat bevat, kan plaques worden gescoord; blue plaques wijzen op een mutant LacI gen, terwijl heldere plaques haven wild-type. De frequentie van blauwe (onder duidelijke) plaques geeft de mutatiefrequentie in de oorspronkelijke celpopulatie het DNA werd geëxtraheerd uit. Sequencing van de gemuteerde Lacl gen zal de locatie van de mutaties in het gen en het soort mutatie vertonen.

De LacI transgene muismodel is goed ingesteld als een in vivo mutagenese test. Bovendien, de muizen en de reagentia voor de test zijn commercieel verkrijgbaar. Hier beschrijven we in detail hoe dit model kan worden aangepast aan de frequentie van spontaan optredende mutanten DNA stamcellen verrijkte Lin meten - IL7R - Sca-1 + cKit + + (LSK) cellen en andere subpopulaties van het hematopoietische systeem.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de meeste weefsels, gedifferentieerde cellen hebben een beperkte levensduur. Om functionele integriteit, langlevende, weefselspecifieke stamcellen continu produceren progenitorcellen die op hun beurt aanleiding geven tot de volledig gedifferentieerde cellen vereist voor de functie van dat weefsel. Stamcellen hun eigen compartiment vullen ook door een proces genaamd zelfvernieuwing. Aldus stamcellen zijn verantwoordelijk voor de functionele integriteit van het weefsel waaruit ze wonen inch Daarom is het noodzakelijk dat ze uitgerust met robuuste mechanismen te voelen en mogelijk repareren beschadigd DNA. Anders kan deze meerdere genomische (mogelijk schadelijke) verstoringen, die worden overgenomen door hun nageslacht te verkrijgen. Inzicht in hoe stamcellen vrijwaren hun genoom tijdens de levensduur van een organisme is een belangrijke vraag en kan ons helpen begrijpen waarom genomische instabiliteit is verbonden met kanker en andere ouderdomsziekten (beoordeeld in 1,2).

Controlling genomische integriteit van een weefsel op het niveau van stamcellen of voorlopercellen vroege celpopulaties kan worden bereikt door ofwel het elimineren defecte stam (of progenitor cellen) via celdood, senescentie of differentiatie en / of efficiënte reparatie van beschadigd DNA. Recente studies hebben aangetoond dat het mogelijk is bepaalde DNA herstel direct deze zeldzame populaties 3-6 meten. Er werd gevonden dat bijvoorbeeld in het hematopoietische systeem, dubbelstrengs DNA breuken kunnen worden gerepareerd door homologe recombinatie (HR) of niet-homologe eind mee (NHEJ), waarbij de laatste een reparatieproces lagere betrouwbaarheid en dus meer kans maken fouten. Beide worden gebruikt in hematopoietische stamcellen (HSC's) 4,5, maar in muizen lijkt het overwegend NHEJ in HSC terwijl vroege voorlopercellen cellen te gebruiken HR 4. Een vergelijkbare waarneming werd gedaan voor stamcellen in de huid 6. Interessant is dat in menselijke HSCs HR, niet NHEJ,lijkt het herstelmechanisme van de keuze voor dubbelstrengsbreuken 3 zijn. Of dit functioneel verschil tussen de twee species echt is of slechts vertegenwoordigt een technologische of experimentele verschil nog te bezien.

Repertoire Een stamcel om beschadigd DNA te repareren waarschijnlijk andere DNA herstel mechanismen, zoals base excisie reparatie (BER), nucleotide excisie reparatie (NER) en mismatch repair (MMR) bevatten. BER en NER zijn verantwoordelijk voor het repareren van een of meerdere basenparen laesies in enkelstrengs DNA, terwijl MMR fixes base-base mismatches en insertie / deletie lussen, deze vormen van DNA-schade niet kan worden gerepareerd door NHEJ of HR. Ondersteunende dit begrip verschillende onderzoeken van het hematopoëtische systeem het verband aantoont tussen veranderingen in een van deze wegen en afwijkingen in de HSC compartiment 7-9, en een verhoogd risico op myelodysplastisch syndroom 10-16, een ziekte die ontstaat in deHSC en dat bij hogere genomische instabiliteit als de ziekte vordert 17. Tot nu toe, hebben metingen van BER, NER, en MMR direct HSC niet gemeld.

Naast het ophelderen van de verschillende processen die weefselintegriteit op een mechanistische niveau beheersen, is het noodzakelijk om in staat om de mate van gemuteerde DNA te meten, waardoor de gevolgen van afwijkingen in een van deze processen kunnen worden getest, bijvoorbeeld in normale versus genetisch gemanipuleerde stamcellen of in oud versus jong. De ontwikkeling van een relevante assay is moeilijk vanwege het gebrek aan weefselspecifieke stamcellen en het ontbreken van kweekomstandigheden die "stemness" behoudt. Bovendien moet een dergelijke test wijzigbaar milieu en genetische manipulaties. Een mogelijke oplossing voor deze beperkingen en eisen is het gebruik van muismodellen die specifiek zijn ontworpen om DNA-mutaties te detecteren.

Multiple transgene muismodellen voor mutatiedetectie zijn ontwikkeld. Bijvoorbeeld LacI transgene muizen 18 dragen een herstelbare λ faag coderend voor het Lacl reportersysteem, waarbij de Lacl gen codeert voor een suppressor van Lac operator en dient als de mutatie reporter. Na mutatie van het Lacl gen, is de Lac operator geactiveerd en β-galactosidase geproduceerd. β-galactosidase splitst het chromogene substraat X-gal (5-broom-4-chloor-e-indolyl-β-D-galactopyranoside), die blauw wordt. De cos plaatsen aan weerszijden van de LacI vector maakt een eenvoudige herstel door lambdafaag eiwitten en de daaropvolgende infectie van E. coli. Na incubatie geïnfecteerde E. coli op agarose dat de X-gal substraat bevat, kan plaques worden gescoord. Blauwe plaques bevatten een vermeende mutant Lac-I dragende faag, terwijl heldere plaques haven niet-mutanten. De frequentie van blauwe plaques (onder the duidelijk zijn) geeft de mutant frequentie in de oorspronkelijke cel bevolking het DNA werd geëxtraheerd uit. Bovendien kan de faag λ gastheer van de Lacl doel gemakkelijk worden gesequenced met behulp van PCR-technieken relatief hoge doorvoer analyse. Sequencing meerdere gemuteerde LacI genen zullen belangrijke informatie over de mutatie spectrum, die op hun beurt kunnen wijzen op eventuele tekortkomingen in specifieke DNA repair pathways of om specifieke genotoxische gebeurtenissen onthullen. Het Lacl transgene systeem is gestandaardiseerd verschillende laboratoria 19 en reagentia zijn commercieel verkrijgbaar. Een groot nadeel van het Lacl systeem is de beperkte mogelijkheid om grote deleties of herschikkingen detecteren, daarom, andere methoden, zoals multi-color FISH metafase smeersels moeten worden gebruikt om deze tekortkoming complimenteren.

Binnen de λ faag vector van de Lacl muismodel er een veel kleinere gen, CII, Beschikbaar voor mutatie analyse. De omvang en het feit dat mutanten kunnen worden gekozen maakt dit een minder arbeidsintensief en goedkoper assay 20 dan de Lacl gen analyse. Echter, de Lacl gen uitvoeriger bestudeerd voor mutagenese 21 en de gevoeligheid van het gen mutaties is goed gekarakteriseerd, zodat er een duidelijk begrip van de aminozuurresten die een fenotypische reactie op een chromogeen substraat 22-25 genereren.

Andere muismodellen voor mutatie detectie omvatten het gebruik van de ΦX174 of LacZ transgenen. De ΦX174 transgeen muismodel, met de originele A: T → G: C terugkeer mutatieassay 26 of de forward mutatie assay 27 dat maakt de ontdekking van een spectrum van substituties van baseparen, betekent een minder kostbaar systeem dan de LacI model. Echter, het mutatie-scherm in de forward test is niet triviaal en de mutatie spectrum van de ΦX174 transgen is minder goed gekarakteriseerd als die van de Lacl. In muismodellen dragen LacZ transgenen, wordt de LacZ mutatie-verslaggever hersteld met behulp van E. coli gastheercellen die gevoelig galactose en medium met galactose 28 zijn. Een nadeel van dit systeem is dat het herstel van het LacZ doel ook betrekking restrictie endonuclease digestie gevolgd door ligatie en elektroporatie van E. coli gastheer, waardoor het moeilijk is om het systeem aan te passen voor kleine aantallen cellen. Hoewel het geen absoluut vereiste voor de bewerking van stam / voorlopercellen celpopulaties (men altijd beginnen met meer muizen), als grote aantallen cellen zijn (bijv. miljoen of meer) zal snel onpraktisch en duur is geworden. Ook de relatief grote omvang van LacZ, terwijl een mutatie gevoelige reporter, is omslachtig en kostbaar voor DNA-sequentieanalyse en bepaald tenzoek van mutatie spectra. Een groot voordeel van dit model is echter het vermogen om grote deleties en inserties detecteren en chromosomale herschikkingen.

Aangezien alle cellen in de Lacl, LacZ ΦX174 en transgene muismodellen dragen de reporter systeem, kan elk van deze muizenmodellen worden gebruikt om mutagenese te meten op elk celtype, waaronder stamcellen en progenitorcellen, zolang zij betrouwbaar kunnen worden geoogst en in voldoende aantallen. Omdat we veel ervaring met de LacI muismodel en de LacI mutatie assay, hebben we besloten om dit systeem verder voor mutagenese analyse voort te zetten in de hematopoietische stamcellen en populaties.

De hematopoietische weefsel is goed gekarakteriseerd in termen van celoppervlak fenotype van de individuele componenten, inclusief langdurige herbevolken stamcellen, die herkenbaar zijn als de uiterst zeldzame bevolking van Lin zijn - IL7R - Sca-1 + cKit + + (LSK) / Flk2 - CD150 + CD48 - cellen 29. . Mohrin et al. 4 aangetoond dat de iets grotere populatie van LSK/Flk2 - cellen zijn nog steeds goed vertegenwoordigers voor HSC en significant verschillend van de meest primitieve gecommitteerde myeloïde voorlopercellen (CMP) bevolking als het gaat om het bestuderen van DNA-herstel. Bovendien, wanneer de HSC-verrijkte LSK (Flk-2 + en Flk-2 -)-cellen vergeleken met de Lin - IL7R - Sca-1-cKit + + (LS-K progenitorcellen), was er nog steeds een significant verschil in NHEJ vermogen 5 tussen de minder zuiver, stamcellen verrijkte LSK bevolking en de voorlopercellen. In ons onderzoek gebruiken we HSC-verrijkte LSK (Flk-2 + en Flk-2 -) cellen omdat we vonden dat ten minste 2 x 10 5 cellen voor consistente, betrouwbare resultaten in deze bepaling mutagenese, dit aantal cellen is uiterst moeilijkte verkrijgen als men sorteert de LSK/Flk2 - CD150 + CD48 bevolking of zelfs de LSK/Flk2 - bevolking (in termen van muizen, kosten en uitvoerbaarheid). Dit protocol, gebaseerd op een oorspronkelijk ontwikkeld door Kohier et al.. 18 beschrijft in detail hoe de spontane mutatiefrequentie DNA kan worden bepaald LSK cellen en gedefinieerde populaties van myeloïde cellen gedifferentieerde en voorspannen beenmerg en milt cellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leukocyten uit Lacl transgene muizen op een C57BL / 6 achtergrond niet tot expressie Sca-1 (Figuur 1). Daarom, als Sca-1 een merker voor cel zuivering moeten deze muizen worden gekruist met een geschikte stam Sca-1 expressie te verkrijgen, in dit protocol de F1 van een kruising tussen normale C57BL / 6 (B6) muizen en Lacl (C57BL / 6) transgene muizen (Lacl) werd gebruikt (figuur 1). Van de celpopulaties die in dit protocol, LSKs en CMP's vertegenwoordigen de kleinste bevolking in het beenmerg. Om te zuiveren ten minste 2 x 10 5 van elk / sorteren, combineren het merg uit circa tien muizen bij het ​​oogsten van het merg uit alleen de achterpoten of uit ten minste vier muizen wanneer ook de heup-, voorpoten-, wervelkolom botten, en borstbeen worden gebruikt.

Maak enkele cel suspensies uit beenmerg en de milt. Een klein deel van het beenmerg wordt gebruikt als is, wordt het grootste deel gebruikt om purify LSKs en gedifferentieerde myeloïde voorlopercellen, dwz CMP's en granulocytaire / monocytaire voorlopers (GMP) door fluorescentie-geactiveerde cel sortering (FACS). De isolatie van beenmergcellen en FACS-zuivering van deze populaties wordt elders 30-32 beschreven. Ongeveer zes onafhankelijke soorten moeten significante verschillen in mutatiefrequentie tussen populaties te identificeren.

Het volgende protocol voor het meten van de spontane in vivo mutant frequentie in gezuiverde hematopoietische subpopulaties is een bewerking van meerdere Strategene handleidingen 33-35, gebaseerd op het originele werk van Kohler et al.. 18 De meest kritische verschillen tussen de bestaande protocollen 33-35 en dit protocol , nodig bij gebruik van relatief kleine aantallen cellen omvatten verschillen in hoeveelheden reagentia en tijden en temperaturen voor proteinase K incubatie.

1. Voorbeeld Opslag

Na het verzamelen van de gewenste celpopulaties hoeveelheid cellen in 1 ml centrifugebuis (voor celaantal per portie, zie tabel 1). Centrifugeer bij 266 xg gedurende 7 minuten bij 4 ° C. Zuig het supernatant voorzichtig. Zet de tubes in vloeibare stikstof gedurende 5 minuten en vervolgens overbrengen naar een -80 ° C vriezer voor verder gebruik. De monsters worden gedurende ten minste 6 maanden.

2. Isolatie van genomisch DNA

  1. Neem de monsters uit de -80 ° C vriezer. Voeg 500 ul ijskoude lysisbuffer DNA (Tabel 3) aan de monsterbuis. Vortex de buizen gedurende 3-5 seconden op gemiddelde snelheid en plaats de buizen op ijs gedurende 10 minuten.
  2. Centrifugeer de buisjes gedurende 12 min, 4000 x g, 4 ° C. Gooi zorgvuldig ~ 450 pi van het supernatant. Spin down de buis voor 3-5 sec. Gebruik een glazen capillaire buis voorzichtig de rest van de supernatant. Drogen de binnenwanden van de thij buis totdat er geen druppels zijn meer zichtbaar (ca. 2 min.).
  3. Voeg 2 pl RNace Het ribonuclease-cocktail en 10 pl 1 M DTT en 100 ul van de DNA digestie buffer (tabel 3). Stel het volume volgens het aantal monsters dat wordt verwerkt, 20 gl van dit DNA verteringsoplossing vereist per monster. Na het toevoegen van 20 pi van deze naar de cel pellet, proberen om de pellet zich los te maken van de bodem, door de buis zachtjes tikken met uw vinger of een pen.
    Opmerking: het kan moeilijk zijn om de pellet te zien vanwege de lage celaantallen.
  4. Voeg 20 ul proteinase K oplossing * (Tabel 3) aan elk monster, zeer tik buis opnieuw zachtjes.
    * Opmerking: de proteinase K oplossing moet worden verwarmd in een 50 ° C waterbad, 2 min voor gebruiken om het enzym te activeren.
  5. Plaats de buis onmiddellijk in een 50 ° C waterbad. Verteren van het monster volgens de richtlijnen in Tabel 1. Tik op de buis heel voorzichtig om de 10 minuten.
    Opmerking: Bij dergelijke kleine aantallen cellen, de temperatuur van het waterbad en digestietijden zijn absoluut essentieel voor succesvol verkrijgen van hoge kwaliteit genomisch DNA.
  6. Maak het DNA dialysesysteem in de koude kamer (figuur 2). Giet 600 ml TE buffer (tabel 3) in een 600 ml bekerglas, voeg een kleine magnetische roerstaaf zodat de buffer tijdens dialyse te roeren en laat de (0,025 mM poriegrootte) membranen drijven op het oppervlak van de buffer. Een membraan per monster 1-4 membranen kunnen worden gebruikt in een enkele dialyse bekerglas. Maak een merkteken op de rand van het membraan met een schaar voor de identificatie van elk monster.
  7. Na de aanvaardbare destructieperiode voeg de nu zeer viskeus genomisch DNA * voorzichtig naar het midden van de drijvende membraan (Figuur 2). Dek het bekerglas onmiddellijk af met aluminiumfolie. Dialyseer het genomische DNA bij 4 ° C voor ~ 16-20hr, roer de buffer voorzichtig.
    * Opmerking: Bij het werken met visceuze DNA oplossingen, gebruiken pipet tips met een brede opening.
  8. De volgende dag giet 600 ml vers bereide TE-buffer (tabel 3) om een schone glazen beker en breng de membranen aan de nieuwe beker met een lepel heel voorzichtig, en dek het bekerglas af met folie. Dialyseer gedurende 2 uur.
  9. Verwijder het dialysemembraan van de beker met de TE-buffer met een lepel en overdragen alleen de meest viskeuze "massa" van de DNA-oplossing naar een nieuwe, steriele 1 ml buisje. Bewaar het monster bij 4 ° C. Blijven de mutagenese test de volgende dag of tot 1,5 maanden later. Voor het gezuiverde bevolking, wacht minstens 1 week.

3. Voorbereiding van Trays voor de E. coli / Fagen Cultuur (dag 1)

Elke lade twee lagen bevat, een agar-laag aan de onderkant en een agaroselaag boven dat X-gal bevat. De E.coli / faag-oplossing wordt toegevoegd aan de laatste. Het aantal en type cellen geïsoleerd bepaalt hoeveel schotels vereist. Raadpleeg Tabel 1 het aantal benodigde schotels en daaropvolgende hoeveelheden van oplossingen voor dit deel van het protocol te berekenen. Het volgende zal genereren ~ 60 trays, waarbij een ervaren persoon gemakkelijk kan verwerken.

  1. Bereid de volgende media:
    1. voor de onderste laag, bereiden 6 x 2 L flessen met elk 1600 ml DDH 2 O. Voeg NZY poeder (21 g / l) en agar (15 g / L); meng goed.
    2. voor de toplaag bereiden 4 x 1 L flessen met elk 800 ml DDH 2 O. Voeg NZY poeder (21 g / l) en agar (7,2 g / l); meng goed.
    3. voor het kweken van E. coli, voeg 2,5 g NZY poeder elk van 2 x 250 ml kolven en breng het volume op 100 ml met DDH 2 O;
    4. bevestiging trays gebruikt bij stap 8, voeg 8,4 g van NZY poeder en 6 g agar een kolf van 1 liter en breng het volume op 400 ml met DDH 2 O.
  2. Dek de opening van de kolven met aluminiumfolie. Meng goed en ze autoclaaf bij 121 ° C, 15 psi gedurende 30 minuten.
  3. Verwijder de kolven (ZEER HEET!) Uit de autoclaaf. Wervelen zorgvuldig de kolven te mengen de agar en agarose, plaats deze in een 50 ° C waterbad. Wanneer het waterbad 50 ° C weer heeft bereikt, giet van de 2 L flessen (stap 3.1.1) ~ 150 ml NZY agar in elke lade (onderste laag).
  4. Laat de agar stollen bij kamertemperatuur gedurende ten minste 2 uur, dan keren en open de laden. Plaats de bodem van de bakken op het deksel, 45 ° uit het midden (fig. 3) en laten drogen gedurende 30 minuten. Sluit de laden en laat O / N bij RT.
  5. Ondertussen bereiden de SCS-8 E. coli-cultuur voor de volgende dag. Van een van de twee 250 ml kolven * (stap 3.1.3), neem 5 ml NZY bouillon (tabel 3) en over te dragen aan een steriele 14 ml buis. Supplement met 62,5 ul van maltose / MgSO4-oplossing en voeg 10 ul van de SCS-8 E. coli glycerol voorraad. Incubeer bij 37 ° C gedurende 3-4 uur onder schudden bij 250-300 tpm. Gebruik 15 ul van deze kweek 95 ml NZY bouillon te inoculeren (in een 250 ml kolf pistool), cultuur O / N bij 37 ° C in een incubator schudden (250-300 rpm).
    * Opmerking: de andere van 250 ml kan later worden gebruikt om de OD van de cultuur aan te passen indien nodig (stap 4.1)
  6. Neem de kolf van 1 liter met agar (stap 3.1.4), en giet ~ 6-7 ml NZY agar in 60 mm gerechten (dit genoeg voor ~ 50 gerechten, die nodig is voor stap 8 zal zijn). Laat agar te verharden (~ 10 min), daarna omkeren en wikkel in plastic. Deze gerechten kunnen bij 4 ° C worden bewaard tot een maand.

4. Voorbereiding van Trays voor de E. coli / Fagen Cultuur (Dag 2)

  1. Controleer de OD van de SCS-8 E. coli cultuur (stap 3.5) op de spectrofotometer.Pas de OD 600-,6 met NZY bouillon (tabel 3) (stap 3.1.3), en plaats de kolf op het ijs om de groei te stoppen en te houden op ijs tot aan gebruik. Deze wordt gebruikt voor de stappen 6.3 en 8.2. Deze cultuur kan gedurende 5 dagen bewaard bij 4 ° C.
  2. Lucht drogen alle assay trays (goot de dag ervoor) voor ~ 5 uur (Figuur 3).

5. Verpakking van Genomic DNA (Dag 2; vervolg)

  1. Neem het vereiste aantal oranje Transpack buizen uit de -80 ° C vriezer en leg ze op droog ijs tot aan gebruik; neem een ​​oranje Transpack buis voor elk verpakkingsmateriaal reactie uit te voeren. Label elke buis op de juiste wijze. Hebben de genomische DNA-monsters (stap 2.9) klaar op ijs.
  2. Deze stap moet worden uitgevoerd een buis op het moment. Beëindig de complete stap voordat u naar de volgende DNA-monster. Ontdooi een oranje buis * noot 1 snel: gebruik je vingers totdat het meeste is ontdooid, zet danop ijs. Neem de overeenkomstige genomische DNA-monster en 8-12 ul monster * note 2,3 onmiddellijk aan de oranje buis. Meng de inhoud van de pipet voorzichtig op en neer 3x, alsmede door de buis zachtjes tikken met je vinger. Probeer niet om luchtbellen te introduceren bij het mengen. Plaats de buis in een 30 ° C waterbad gedurende 90 minuten.
    * Opmerking 1: een snelle een microcentrifugepuls kan nodig zijn om de gehele inhoud van de binnenwanden en de kap te verzamelen.
    * Noot 2: volume van de toegevoegde monster is afhankelijk van het aantal cellen gebruikt om het monster te genereren: 11-12 pl monsters bereid 2,0-5,0 x 10 5 cellen, 10 pl van 1,0 x 10 6 cellen samples en 8 pi van 1,5 x 10 6 cell-monsters.
    * Noot 3: Het DNA is nog steeds erg stroperig, aan het DNA nemen, duw de pipet tip om de onderkant van het monster buis en voorzichtig draai de tip rond tegen de binnenwand van de buis.
  3. Neem 1 of 2 blauwe Transpack tubes * uit de -80 ° C vriezer en leg ze op droog ijs tot gebruik. Ontdooi ze snel en breng 12 pl van elk van de oranje buizen. Meng de oplossing door de pipet voorzichtig op en neer 3 keer. Spin de buis naar beneden voor 2-3 seconden, tik vervolgens op de buis met je vinger voor verder mengen en onmiddellijk terug te sturen naar de 30 ° C waterbad gedurende nog eens 90 minuten.
    * Opmerking: Gebruik 1 blauwe buis voor 5-6 reacties en 2 blauwe buizen voor 10-12 reacties.
  4. Na 90 min, vul telkens reactie met 970 pl SM buffer * (Tabel 3) aan de reactie en vortex gemiddelde snelheid voor 5 seconden stoppen. Zet buizen op ijs tot verder gebruik.
    * Opmerking: als het aantal cellen is ≤ 5 x 10 5, gebruiken 500 ul SM buffer (tabel 3) om de reactie te stoppen, 2 buizen (van hetzelfde monster) kan dan later worden gecombineerd (stap 6.4).

6. Plating Verpakte Genomic DNA (Dag 2, vervolg)

  1. Sluit de omgekeerde agar tstralen die voor het drogen in de ochtend werden geopend. Label de laden voor elk monster.
  2. Los 4,8 g X-gal in 16,8 ml N, N-dimethylformamide (nodig voor stap 6.5). Onmiddellijk roeren en op een schudplatform. Beschermen tegen licht. Oplossing moet helder zijn in 20-30 minuten.
  3. Aliquot de SCS-8 E. coli-cellen. Voor elke set van trays * Gebruik een 50 ml conische buis. Label de buis met de naam van het verpakte DNA monster. Voeg 2 ml van E. coli suspensie voor elke lade.
    * Opmerking: Bijvoorbeeld 3 x 10 5 GGP vereist een set van 8 schalen (zie tabel 1). Derhalve zijn twee aliquots vereisen 8 x 2 = 16 trays. Houd de monsters te scheiden en daarmee bereiden twee 50 ml buisjes met elk 8 x 2 = 16 ml E. coli suspensie.
  4. Voeg 1 ml * verpakte DNA monster (van stap 5.4) op de juiste 50 ml buis met het SCS-8 E. coli hoeveelheid en meng goed. Incubate dit E. coli / faag mengsel in een schuddend incubator (250-300 rpm) bij 37 ° C gedurende 23 minuten.
    * Opmerking: Als DNA werd geëxtraheerd van ≤ 5 x 10 5 cellen werd 500 ui SM-buffer gebruikt voor de reactie (stap 5.4) stoppen. Bij deze stap kunnen de buizen worden gecombineerd en toegevoegd aan een 50 ml conische buis.
  5. Wanneer de E. coli / faag mengsel wordt incubatie, beginnen de voorbereidingen voor de top agaroselaag. Voeg 5 ml X-gal / N, N-dimethylformamide-oplossing (stap 6.2) aan elke kolf van 800 ml toplaag agarose (uit stap 3.1.2, bij 50 ° C gehouden). De eindconcentratie van X-gal wordt 1,5 mg / ml zijn. De X-gal kan een beetje neerslaan wanneer toegevoegd aan de agarose. Swirl aan de X-gal te ontbinden en zet de fles terug in het 50 ° C waterbad.
  6. Neem de E. coli / faag mengsel uit de broedstoof (stap 6.4). Elk monster vereist meerdere trays, elke lade moet 50 ml X-gal/agarose oplossing (stap 6.5). De benodigde hoeveelheid X-gal/agarose voor elk monster (bijvoorbeeld 50 ml xaantal schotels) in een grotere steriele plastic fles en voeg de juiste E. coli / faag mengsel. Schud de fles te mengen. Verdeel het mengsel in porties van 45-50 ml in 50 ml conische buizen. Het aantal buizen moeten hetzelfde als het aantal bakken nodig is voor dat monster.
    Opmerking: De overgebleven X-gal/agarose oplossing wordt in stap 8.3. De oplossing kan worden opgeslagen in een 50 ° C waterbad tot gebruik.
  7. Giet 50 ml top agarose mengsel over de onderste helft van de assay lade. Verspreidde zich snel de agarose door het kantelen van de test bak lichtjes in een richting.
    Let op: de agarose zal naar beneden zeer snel afkoelen en wordt onmogelijk om zich te verspreiden over de lade. Daarom hoeft deze stap relatief snel en agarose die bij 50 ° C gehouden worden uitgevoerd
  8. Laat de top agarose uitharden ten minste 15 minuten. Dan, omkeren en open de test laden om ze te laten drogen aan de lucht gedurende 30 minuten (Figuur 3).
  9. Sluit de laden, incubeer de assay laden omgekeerd (onderste agar laagzijde geplaatst) bij 37 ° C gedurende 15-16 uur. Stapel nooit meer dan 5 laden.

7. Bepaling van een vermeend Mutant Frequency (dag 3)

  1. Verwijder de laden uit de 37 ° C incubator en laat ze afkoelen. Tel de doorschijnende plaque-vormende eenheden (PFU) op elke lade, selecteert willekeurig 2 plaatsen op de laden, teken een vierkant * van 2,5 x 2,5 cm 2 of 5 x 5 cm 2 en tel alle pfu's in elk vierkant met een markering celteller (Figuur 4A, B).
    * Opmerking: Om het plein gebruik een apparaat trekken zoals weergegeven in figuur 5. Indien het aantal getelde pfu is ≥ 40, gebruiken de kleinere plein, anders gebruikt de grotere.
  2. Neem het gemiddelde van de kwadraten geteld en vermenigvuldig dat met 96 het tellen met een kleinere vierkante, of vermenigvuldig dit getal met 24 indien tellen met de grote. Voeg het aantal pfu's geteld voor alle laden van de same proeven. Dit is het aantal pfu's gegenereerd voor dit monster.
  3. Vervolgens tellen de mutant plaques in elke lade. De bakken zijn nu afgekoeld, die zal helpen om de mutant plaques lokaliseren. Om verder te vergemakkelijken het spotten van de blauwe plaques, breng de lade over een rode en / of witte oppervlak, bladen van rood en wit papier goed werken. Omcirkelen elke blauwe plaquette met een viltstift. Neem de vorm en de intensiteit van de blauwe kleur van elke mutant (bv. volledige, cirkel, sector; figuur 4C) 36,37.
  4. Bepaal de vermeende mutant frequentie voor elk monster door het aantal mutante pfu (stap 7.3) door het totale aantal pfu (stap 7.2).

8. Verificatie van Putatieve Mutant plaques (Dag 3-5)

  1. Met behulp van een Pasteur pipet, kern elke mutant (blauw) PFU en breng de stekker in 250 ul steriele SM buffer (tabel 3). Voeg 25 pi chloroform, vortex gedurende 5 seconden eend bewaren bij 4 ° C om de volgende dag verder te gaan of te verlaten gedurende 2 uur bij kamertemperatuur voordat u verder gaat met de volgende stap, om te controleren of de mutant PFU is inderdaad een mutant. De monsters kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende ten minste 1 jaar.
  2. Label een 1 ml en een 4 ml steriel buisje voor elke mutant die werd aangesloten. In de nieuwe 1 ml buisje verdunnen geresuspendeerd faag vrijgelaten uit de agar plug (stap 8.1) 01:50 in steriele SM buffer (2 pl monster in 100 ui SM-buffer (tabel 3)), vortex kort gereserveerd. Om de 4 ml steriele buis voeg 200 ul SCS-8 E. coli cultuur (uit stap 4.1) en 2 pi van de verdunde faag uit de overeenkomstige 1 ml buisje, incuberen bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten.
  3. Voeg 2,5 ml van de topagarose met X-gal (overgebleven uit stap 6.6) toe aan elk 4 ml tube, werveling buis te mengen en giet op een 60-mm NZY agar plaat eerder gegoten (stap 3.6). Laat gedurende 10 minuten (te laten thij topagarose stollen), keren de schotel en incubeer O / N bij 37 ° C.
  4. De volgende ochtend Verwijder de schaal uit de incubator en bepaal het percentage blauwe pfu op elke schaal (figuur 6). Wanneer 70% of meer van de pfu zijn blauw, wordt een mutant als bevestigd 38,39. De kern van de mutant plaque van de schotel en zet in een 1,5 ml schroefdop buis, met 250 pl SM buffer (tabel 3) en 25 pi chloroform, het is nu klaar voor het rangschikken.
  5. Wanneer 50% of minder van het PFU blauw, wordt deze niet als een echte mutant 38,39. Wanneer de frequentie van de blauwe pfu is tussen 60-70%, kom later met in de toelichting over de vorm van de plaque, als de vorm van de PFU was "vol", verder met sequencing.

9. Sequencing voor een Mutaties in het LacI G ENE

  1. Opgericht PCR-reacties in een 25 ul reactie volume, inclusief 1,5 μ, L plaque supernatant (sjabloon, stap 8.4), de voorwaartse primer SF1 (5'-GGAAACGCCTGGTATCTT-3 ') en de reverse primer SR2 (5'-GCCAGTGAATCCGTAATCA-3'). Gebruik de PCR extender Taq polymerase kit volgens instructies van de fabrikant. Fietsen zijn als volgt: 94 ° C gedurende 2 minuten, vervolgens 35 cycli van 94 ° C gedurende 20 seconden, 60 ° C gedurende 20 seconden, 72 ° C gedurende 2 min, gevolgd door een laatste stap van 72 ° C gedurende 5 min .
  2. Neem 5 pl aliquot van elke reactie en uitgevoerd op een 0,8% agarosegel om amplificatie te bevestigen.
  3. Ruim het PCR-reacties met de Augencourt cleanup kit volgens instructies van de fabrikant.
  4. Kwantificeren DNA Template.
  5. Gebruik ~ 100 ng PCR-product als matrijs-DNA voor sequencing. Sequentie amplicons in beide richtingen met behulp van dezelfde PCR-primers als sequencing primers (zie hierboven).
  6. Monteer sequenties en af te stemmen op de LacI referentie sequentie 40 tot Mutati detecterenons.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De in vivo mutagenese test meet een zeldzame gebeurtenis (mutant pfu's) onder vele evenementen (alle pfu's). Door het uitvoeren van de assay met klein aantal cellen, is het mogelijk dat het resultaat sterk wordt beïnvloed door vals-positieve en vals-negatieve resultaten. Om dit probleem aan te pakken hebben we een seriële verdunning experiment met niet-gefractioneerde beenmergcellen, geoogst uit drie verschillende dieren. We maten de mutant frequentie in het beenmerg van dieren die met 1,4 x 10

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De in vivo mutagenese test hierin beschreven is het Lacl transgene muismodel oorspronkelijk gegenereerd door Kohier et al.. 18 Dit model maakt gebruik van een λ faag vector die een lacl reportergen. De twee cos plaatsen aan weerszijden van de vector zodat een relatief eenvoudige terugwinning en daaropvolgende verpakkingsmateriaal infectieuze faagdeeltjes, gebruikt infecteren E. coli. Een blauwe plaquette zal worden gegenereerd door faag-geïnfecteerde E...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij willen David R. Rodriguez, MA bedanken voor de grafische vormgeving en fotografie in dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door financiering van de GCCRI, de NIH / NIA (5R21AG033339) en het Cancer Support Grant (P30CA054174) aan de UTHSCSA flowcytometrie Core faciliteit en de UTHSCSA Geavanceerde nucleïnezuren Core Facility.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
LacI transgene muizen BioReliance Corporation
RecoverEase DNA-isolatiekit, inclusief de RNace-It ribonuclease cocktailAgilent Technologies (Stratagene)720202
Transpack Packaging Extract, inclusief de oranje en blauwe transpackbuizen en de SCS-8 E. coliAgilent Technologies (Stratagene)200221
DNA-maatstaven – lambda ladderBio Rad170-3635
0.025 mM Poregroottemembranen Fisher (Millipore)VSWP 025 00
245 mm2 Bioassay schaaltjes (bakken) Fisher (Corning)07-200-600
NZY-bouillon (poeder)Fisher (Teknova)N1144
AgarFisherBP1423-500
AgaroseFisherE-3120-500
N,N-DimethylformamideFisherAC34843-5000
X-galResearch Products Intl Corp (RPI)B71800-10.0
Proteinase KRoche3-115-852
PCR Extender Taq Polimerase kit5 PRIME2200500
Agencourt AMPure XP cleanup kitBeckman/CoulterA63880

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maslov, A. Y., Vijg, J. Genome instability, cancer and aging. Biochim. Biophys. Acta. 1790 (10), 963-969 (2009).
  2. Aguilera, A., Gomez-Gonzalez, B. Genome instability: a mechanistic view of its causes and consequences. Nat. Rev. Genet. 9 (3), 204-217 (2008).
  3. Milyavsky, M., et al. A distinctive DNA damage response in human hematopoietic stem cells reveals an apoptosis-independent role for p53 in self-renewal. Cell. Stem Cell. 7 (2), 186-197 (2010).
  4. Mohrin, M., et al. Hematopoietic stem cell quiescence promotes error-prone DNA repair and mutagenesis. Cell. Stem Cell. 7 (2), 174-185 (2010).
  5. Shao, L., Feng, W., Lee, K. J., Chen, B. P., Zhou, D. A sensitive and quantitative polymerase chain reaction-based cell free in vitro non-homologous end joining assay for hematopoietic stem cells. PLoS ONE. 7 (3), (2012).
  6. Sotiropoulou, P. A., et al. Bcl-2 and accelerated DNA repair mediates resistance of hair follicle bulge stem cells to DNA-damage-induced cell death. Nat. Cell Biol. 12 (6), 572-582 (2010).
  7. Prasher, J. M., et al. Reduced hematopoietic reserves in DNA interstrand crosslink repair-deficient Ercc1-/- mice. EMBO J. 24 (4), 861-871 (2005).
  8. Rossi, D. J., et al. Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haematopoietic stem cells with age. Nature. 447 (7145), 725-729 (2007).
  9. Reese, J. S., Liu, L., Gerson, S. L. Repopulating defect of mismatch repair-deficient hematopoietic stem cells. Blood. 102 (5), 1626-1633 (2003).
  10. Carney, D. A., et al. Therapy-related myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia following fludarabine combination chemotherapy. Leukemia. 24 (12), 2056-2062 (2010).
  11. Jankowska, A. M., et al. Base excision repair dysfunction in a subgroup of patients with myelodysplastic syndrome. Leukemia. 22 (3), 551-558 (2008).
  12. Tam, C. S., et al. Treatment-related myelodysplasia following fludarabine combination chemotherapy. Haematologica. 91 (11), 1546-1550 (2006).
  13. Webb, S. Xeroderma pigmentosum. BMJ. 336 (7641), 444-446 (2008).
  14. Ben-Yehuda, D., et al. Microsatellite instability and p53 mutations in therapy-related leukemia suggest mutator phenotype. Blood. 88 (11), 4296-4303 (1996).
  15. Casorelli, I., et al. Drug treatment in the development of mismatch repair defective acute leukemia and myelodysplastic syndrome. DNA Repair. 2 (5), 547-559 (2003).
  16. Olipitz, W., et al. Defective DNA-mismatch repair: a potential mediator of leukemogenic susceptibility in therapy-related myelodysplasia and leukemia. Genes Chrom. Cancer. 34 (2), 243-248 (2002).
  17. Haase, D., et al. New insights into the prognostic impact of the karyotype in MDS and correlation with subtypes: evidence from a core dataset of 2124 patients. Blood. 110 (13), 4385-4395 (2007).
  18. Kohler, S. W., et al. Analysis of spontaneous and induced mutations in transgenic mice using a lambda ZAP/lacI shuttle vector. Environ. Mol. Mutagen. 18 (4), 316-321 (1991).
  19. Rogers, B. J., Provost, G. S., Young, R. R., Putman, D. L., Short, J. M. Intralaboratory optimization and standardization of mutant screening conditions used for a lambda/lacI transgenic mouse mutagenesis assay. 327 (1-2), 57-66 (1995).
  20. Jakubczak, J. L., et al. Analysis of genetic instability during mammary tumor progression using a novel selection-based assay for in vivo mutations in a bacteriophage lambda transgene target. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (17), 9073-9078 (1996).
  21. Ward, T. L., Prtenjaca, A., Hill, K. A. A novel Escherichia coli-derived mutation detected with the Big Blue cII mutant selectable assay. Environ. Mol. Mutagen. 51 (4), 344-348 (2010).
  22. Miller, J. H., Coulondre, C., Farabaugh, P. J. Correlation of nonsense sites in the lacI gene with specific codons in the nucleotide sequence. Nature. 274 (5673), 770-775 (1978).
  23. Provost, G. S., et al. Transgenic systems for in vivo mutation analysis. Mutat. Res. 288 (1), 133-149 (1993).
  24. Schaaper, R. M., Danforth, B. N., Glickman, B. W. Mechanisms of spontaneous mutagenesis: an analysis of the spectrum of spontaneous mutation in the Escherichia coli lacI gene. J. Mol. Biol. 189 (2), 273-284 (1986).
  25. Schaaper, R. M., Dunn, R. L. Spontaneous mutation in the Escherichia coli lacI gene. Genetics. 129 (2), 317-326 (1991).
  26. Burkhart, J. G., Burkhart, B. A., Sampson, K. S., Malling, H. V. ENU-induced mutagenesis at a single A: T base pair in transgenic mice containing phi X174. Mutat. Res. 292 (1), 69-81 (1993).
  27. Valentine, C. R., et al. Characterization of mutant spectra generated by a forward mutational assay for gene A of Phi X174 from ENU-treated transgenic mouse embryonic cell line PX-2. Environ. Mol. Mutagen. 39 (1), 55-68 (2002).
  28. Gossen, J. A., Molijn, A. C., Douglas, G. R., Vijg, J. Application of galactose-sensitive E. coli strains as selective hosts for LacZ- plasmids. Nucleic Acids Res. 20 (12), 3254 (1992).
  29. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  30. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6674), 193-197 (2000).
  31. Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors. J. Vis. Exp. (65), (2012).
  32. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
  33. Stratagene, Transpack packaging extract for lambda transgenic shuttle vector recovery. Instruction manual. , (2001).
  34. Stratagene, RecoverEase DNA isolation kit. Instruction manual. , (2009).
  35. Stratagene, Big Blue transgenic mouse mutagenesis assay system. Instruction manual. , (1992).
  36. Nishino, H., Buettner, V. L., Sommer, S. S. Towards validation of the Big Blue transgenic mouse mutagenesis assay: the mutational spectrum of ex vivo pinpoint mutant plaques. Muta. Res. 372 (1), 97-105 (1996).
  37. Stuart, G. R., Gorelick, N. J., Andrews, J. L., de Boer, J. G., Glickman, B. W. The genetic analysis of lacI mutations in sectored plaques from Big Blue transgenic mice. Environ. Mol. Mutagen. 28, 385-392 (1996).
  38. Bielas, J. H., Heddle, J. A. Proliferation is necessary for both repair and mutation in transgenic mouse cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11391-11396 (2000).
  39. Paashuis-Lew, Y., Zhang, X. B., Heddle, J. A. On the origin of spontaneous somatic mutations and sectored plaques detected in transgenic mice. Mutat. Res. 373 (2), 277-284 (1997).
  40. de Boer, J. G., Glickman, B. W. The lacI gene as a target for mutation in transgenic rodents and Escherichia coli. Genetics. 148 (4), 1441-1451 (1998).
  41. Piegorsch, W. W., et al. Study design and sample sizes for a lacI transgenic mouse mutation assay. Environ. Mol. Mutagen. 25 (3), 231-245 (1995).
  42. Yang, L., et al. Identification of Lin(-)Sca1(+)kit(+)CD34(+)Flt3- short-term hematopoietic stem cells capable of rapidly reconstituting and rescuing myeloablated transplant recipients. Blood. 105 (7), 2717-2723 (2005).
  43. Hilbe, J. M. Negative Binomial Regression. second edn. , Cambridge University Press. (2011).
  44. de Boer, J. G., Provost, S., Gorelick, N., Tindall, K., Glickman, B. W. Spontaneous mutation in lacI transgenic mice: a comparison of tissues. Mutagenesis. 13 (2), 109-114 (1998).
  45. Huffman, M. D. An improved approximation to-sample poisson test. Appl. Stat. 33 (2), 224-226 (1984).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

LacI transgene muizenDNA mutatieanalysehematopo tische stamcellenLacI reportersysteemplaque assayisolatie van stamcellenmeting van mutantfrequentiegensequencingendogene mutageneseomgevingsfactoren

Gerelateerde artikelen