Er is een correctie aangebracht in Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. Het Nissl-kleuringsprotocol is gewijzigd van:
2. Monstervoorbereiding: Nissl
- De muis wordt diep geanestheseerd met intraperitoneel geïnjecteerde ketamine en xylazine en vervolgens transcardiaal geperfuseerd met 50 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 7.4) op kamertemperatuur, gevolgd door 250 mL 10% neutraal gebufferde formaline (pH 7.4) op kamertemperatuur, en tot slot met 3.0 cc onverdunde India-inkt.
- Perfusie van het gehele lichaam met zoutoplossing en fixatief is noodzakelijk om het bloed uit het cardiovasculaire systeem te verwijderen en de weefsels te fixeren. Perfusie met India-inkt is noodzakelijk om de vasculatuur van het cardiovasculaire systeem volledig te vullen.
- De resulterende hersenen worden vervolgens gedehydrateerd via een reeks graduele ethylalcoholen (25%{}-100%) en daarna ingebed in araldite-plastic volgens het protocol in 1.8-1.9 hierboven. Indien LR white het inbeddingsmedium is, wordt het protocol in 1.10 hierboven gevolgd.
- De muis wordt diep geanestheseerd met intraperitoneel geïnjecteerde ketamine en xylazine en vervolgens transcardiaal geperfuseerd met 50 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 7.4) op kamertemperatuur, gevolgd door 250 mL 10% neutraal gebufferde formaline (pH 7.4) op kamertemperatuur, en tot slot met 3.0 cc onverdunde India-inkt.
- Perfusie van het gehele lichaam met zoutoplossing en fixatief is noodzakelijk om het bloed uit het cardiovasculaire systeem te verwijderen en de weefsels te fixeren. Perfusie met India-inkt is noodzakelijk om de vasculatuur van het cardiovasculaire systeem volledig te vullen.
- De resulterende hersenen worden vervolgens gedehydrateerd via een reeks graduele ethylalcoholen (25%{}-100%) en daarna ingebed in araldite-plastic volgens het protocol in 1.8-1.9 hierboven. Indien LR white het inbeddingsmedium is, wordt het protocol in 1.10 hierboven gevolgd.
- De muis wordt diep geanestheseerd met intraperitoneel geïnjecteerde ketamine en xylazine en vervolgens transcardiaal geperfuseerd met 50 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 7.4) op kamertemperatuur, gevolgd door 250 mL 10% neutraal gebufferde formaline (pH 7.4) op kamertemperatuur, en tot slot met 3.0 cc onverdunde India-inkt.
- Perfusie van het gehele lichaam met zoutoplossing en fixatief is noodzakelijk om het bloed uit het cardiovasculaire systeem te verwijderen en de weefsels te fixeren. Perfusie met India-inkt is noodzakelijk om de vasculatuur van het cardiovasculaire systeem volledig te vullen.
- De resulterende hersenen worden vervolgens gedehydrateerd via een reeks graduele ethylalcoholen (25%{}-100%) en daarna ingebed in araldite-plastic volgens het protocol in 1.8-1.9 hierboven. Indien LR white het inbeddingsmedium is, wordt het protocol in 1.10 hierboven gevolgd.
naar:
2. Specimenpreparatie: Nissl
- Dit protocol volgt nauwgezet het protocol van Mayerich et al.7
- De muis wordt diep geanestheseerd met intraperitoneel geïnjecteerde ketamine en xylazine en vervolgens transcardiaal geperfuseerd met 50 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 7,4) op kamertemperatuur, gevolgd door 250 mL koude 4% fosfaatgebufferde paraformaldehyde (pH 7,4).
- De muis wordt vervolgens geperfuseerd met 100 mL van een oplossing van 0,1% thionine-kleurstof in gedeïoniseerd water, waarna het lichaam gedurende 24 uur in de koelkast (4 °C) wordt geplaatst.
- Na 24 uur wordt het brein uit de schedel verwijderd, geplaatst in een verse oplossing van 0,1% thionine en 7 dagen op 4 °C bewaard. De lange duur van deze procedure was bedoeld om volledige infiltratie van thionine in de en bloc preparatie te waarborgen.
- Het brein wordt vervolgens ontkleurd en gedehydrateerd via een reeks oplopende ethanolconcentraties, beginnend bij 50% ethanol in water en toenemend tot 100% ethanol over een periode van 6 weken. De ethanolwisselingen van 50% naar 70% worden in de koelkast (4 °C) bewaard en alle ethanolwisselingen boven de 70% worden bij kamertemperatuur bewaard.
- Na drie wisselingen van aceton (2-4 dagen in elke oplossing bij kamertemperatuur) wordt het brein ingebed in araldite-plastic volgens het protocol in 1.8-1.9 hierboven. Indien LR white als inbeddingsmedium wordt gebruikt, wordt het protocol in 1.10 hierboven gevolgd.