Cel-gebaseerde test protocol voor de prognostische Voorspelling van Idiopathische scoliose met behulp van cellulaire diëlektrische spectroscopie

Samenvatting

Een gestructureerd protocol wordt gepresenteerd voor een cel-gebaseerde test als een functionele test om de prognose van idiopathische scoliose te voorspellen met behulp van cellulaire diëlektrische spectroscopie (CDS). De test kan worden uitgevoerd met vers of ingevroren perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) en de procedure binnen 4 dagen.

Samenvatting

Dit protocol geeft de experimentele en analyseprocedure voor celgebaseerde assay ontwikkeld in ons laboratorium als een functionele test voor de prognose voor idiopathische scoliose bij asymptomatische en getroffen kinderen voorspellen. De test bestaat uit de evaluatie van de functionele status van Gi en Gs eiwitten in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) door cellulaire diëlektrische spectroscopie (CDS), met een geautomatiseerde CDS gebaseerde instrument, en de indeling van de kinderen in drie functionele groepen (FG1 , FG2, FG3) met betrekking tot het profiel van onbalans tussen de mate van respons op Gi en Gs eiwitten stimulatie. De classificatie wordt verder bevestigd door het differentieel effect van osteopontine (OPN) op reactie op Gi stimulatie tussen de groepen en de ernstige progressie van de ziekte wordt verwezen door FG2. Ongeveer wordt een volume van 10 ml bloed nodig PBMC extraheren door Ficoll-gradiënt en cellen worden vervolgens opgeslagen in vloeibare stikstof. Het voldoende aantal PBMCS verrichten van de bepaling wordt verkregen na twee dagen van celkweek. In wezen worden cellen eerst geïncubeerd met phytohemmaglutinin (PHA). Na 24 uur incubatie wordt het medium vervangen door een PHA kweekmedium gedurende 24 uur voorafgaand aan zaaien van cellen en OPN behandeling. Cellen worden vervolgens spectroscopisch gescreend op hun reacties op somatostatine en isoproterenol, die respectievelijk activeren Gi en Gs proteïnen via hun verwante receptoren. Zowel somatostatine en isoproterenol gelijktijdig geïnjecteerd met een geïntegreerde fluïdica systeem en de reacties van de cellen 'worden gecontroleerd gedurende 15 minuten. De test kan worden uitgevoerd met vers of bevroren PBMCs en de procedure wordt afgerond binnen 4 dagen.

Inleiding

Idiopathische scoliose is een ruggengraat misvorming van onbekende oorzaak algemeen gedefinieerd als een laterale kromming groter dan 10 graden vergezeld van een wervel rotatie ^1. De aandoening komt 4% van de pediatrische populatie en wordt meestal gediagnosticeerd in de leeftijd van 9 tot 13 ​​jaar ^2,3,4. De diagnose is in de eerste plaats van uitsluiting en wordt pas na het uitsluiten van andere oorzaken van vervorming van de wervelkolom, zoals vertebrale misvorming, neuromusculaire of syndromale aandoeningen. Traditioneel wordt de trunkal asymmetrie onthuld door Adams naar voren buigen testen en meten met Scoliometer tijdens lichamelijk onderzoek ^5. De diagnose kan dan worden bevestigd door radiografische waarneming van de curve en de hoekmeting met Cobb methode ^6.

Zodra de diagnose, de primaire zorg voor artsen in het beheer scoliotische kinderen is de vraag of de curve zal vorderen. Inderdaad, de karakteristieken hebben vaak onvoorspelbaar enis vaker waargenomen bij meisjes dan bij jongens ^7. Indien onbehandeld, kan de curve drastisch vooruitgang, het creëren van belangrijke fysieke misvorming en zelfs hart-problemen. Deze manifestaties levensbedreigend worden indien de curve hoger is dan 70 ° ^8,9. De huidige behandeling opties te voorkomen of te stoppen curve progressie onder schoren en chirurgie. In het algemeen, schrap wordt aanbevolen voor bochten tussen 25-40 °, terwijl chirurgie is gereserveerd voor bochten van meer dan 45 ° of niet reageren op schoren.

Ongeveer 10% van de kinderen met de diagnose idiopathische scoliose hebben karakteristieken hebben die voor corrigerende chirurgie ^10. Momenteel is er geen bewezen methode of proef waarover deze categorie patiënten identificeren. Bijgevolg worden alle gediagnosticeerde kinderen onderworpen aan meerdere röntgenfoto's over meerdere jaren, meestal tot ze volwassen skelet bereiken. Geschat wordt dat de typische patiënten met scoliose zalongeveer 22 radiologische onderzoeken over een periode van 3 jaar ^11. Vanwege het potentiële risico van meerdere radiografische onderzoeken, de alternatieve benaderingen waardoor het uitvoeren van de prognose van idiopathische scoliose zonder kinderen bloot te stellen aan ioniserende straling zijn sterk gewenst. Met de bedoeling om aan deze behoefte, hebben we eerder ontwikkelde een cel-gebaseerde screeningstest als een prognostische test om de asymptomatische kinderen sneller identificeren die risico lopen op het ontwikkelen van idiopathische scoliose. De test voorspelt klinische uitkomst zowel asymptomatische en getroffen kinderen door onderzoek van de functionele status van Gi eiwitten en classificeren kinderen in drie functionele groepen (FG1, FG2 en FG3) volgens de mate van de maximale respons op stimulatie Gi eiwitten ¹² zoals gemeten door CDS -gebaseerd systeem. Dit systeem wordt voornamelijk gebruikt om signaaltransductie te beoordelen door middel van G-eiwitten in verschillende celtypes ^13,14,15,16. Het levert informatie over detotale geïntegreerde respons van de cellen aan de externe stimuli door het meten van veranderingen in impedantie na de activering van celoppervlak receptoren. Cellen worden gezaaid in microtiterplaten die elektroden bevatten onder aan de putjes en het systeem past een kleine spanning die extracellulaire en transcellulaire duceren. Volgende verbinding injectie in de put worden celoppervlak receptoren gestimuleerd en signaaltransductie gebeurtenissen plaatsvinden, die tot cellulaire veranderingen die de stroom van extracellulaire en transcellulaire stromingen beïnvloeden en daardoor de gemeten grootte beïnvloeden. Met deze aanpak, de scoliotische patiënten en kinderen meer risico lopen op het ontwikkelen van scoliose zijn minder ontvankelijk voor Gi proteïne stimulatie in vergelijking met gezonde proefpersonen, en de indeling is gebaseerd op het percentage van de mate van reductie ten opzichte van controlegroep. De classificatie bereiken worden vastgesteld tussen 10 en 40% voor FG3, 40 en 60% voor FG 2, en 60 en 90% voor FG1 ^12.

Meer recent hebben we deze aanpak gewijzigd door aan te tonen dat de drie functionele groepen duidelijk te onderscheiden op basis van het profiel van de onbalans tussen respons op Gi en Gs stimulatie. Inderdaad vonden we respons op stimulatie Gi overheerste in FG3, terwijl er geen duidelijke onbalans werd waargenomen in FG2. Daarentegen vertoonde FG1 overwicht het antwoord op Gs stimulatie. Daarnaast hebben we het bewijs dat patiënten uit FG2 lopen meer risico op progressie naar de punt van een noodzakelijke operatie ¹⁷ voorzien. De precisie van deze classificatie-test is verder verbeterd door aan te tonen een differentiële effect van osteopontine (OPN) op reactie op Gi stimulatie tussen functionele groepen.

Hier leggen we de gedetailleerde stappen van experimentele en analytische procedures van deze functionele test zoals thans uitgevoerd in ons laboratorium.

Protocol

De gehele procedure wordt uitgevoerd onder steriele biologische kap uitgevoerd en alle oplossingen en apparatuur die in contact komen met cellen moeten steriel zijn.

1. Voorbereiding van Essential Solutions

1. Bereid oplossingen volgens tabel 1.
2. Houd gebalanceerde zoutoplossing (BSS) bij kamertemperatuur en alle andere oplossingen bij 4 ° C tot het tijdstip van gebruik.
3. Warme koude media tot 37 ° C in het waterbad gedurende enkele minuten voor gebruik.

2. Bereiding en opslag van PBMCs

1. Verzamel 10 ml bloed in EDTA-behandelde verzamelbuizen twee aliquots van PBMC bereiden in 5 ml elk aliquot.
2. Overdracht 5 ml volledig bloed van de EDTA behandelde verzamelbuis een 50 ml buisje.
3. Voeg een gelijk volume van BSS en meng monster door zachte pipetteren op en neer.
4. Breng 3 ml Ficoll in twee 15 ml Falcon buizen.
5. Layer zorgvuldig 4,5 mlvan verdunde bloed mengsel over de Ficoll in elke buis.
6. Laat de buizen rusten tot 5 minuten een duidelijke scheiding van het bloed en Ficoll bevorderen.
7. Centrifugeer de buizen bij 400 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur zonder rem.
8. Haal de buizen uit de centrifuge zodat de gelaagdheid niet verstoren. De PBMC zichtbaar zijn op de BSS / Ficoll-interface.
9. Oogst de troebele laag van PBMC bij het grensvlak van beide buizen met een pipet overgebracht naar een nieuwe buis van 50 ml.
10. Voeg 20 ml van complete media.
11. Centrifugeer het buisje bij 288 xg gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur.
12. Verwijder het supernatant door aspiratie.
13. Resuspendeer de celpellet in 500 ui aanvullende media.
14. Voeg een gelijk volume ijskoud medium.
15. Breng de celsuspensie om een ​​cryovial.
16. Plaats de cryovial in een cryofreezing container met isopropanol.
17. Bewaar de bevriezing container bij -80 ° C gedurende de nacht.
18. Transfer de bevroren PBMC aliquot om vloeibare stikstof voor langdurige opslag.

3. Functionele Assay

1. Dag 1

1. Plaats hoeveelheid van vloeibare stikstof in een waterbad bij 37 ° C gedurende een minuut of tot ontdooid.
2. Breng de celsuspensie in een 50 ml buis met een steriele pipet.
3. Voeg 15 ml compleet medium en spin de cellen neer op 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
4. Verwijder het supernatant door aspiratie.
5. Voorzichtig schorsen celpellet in 1 ml PHA media.
6. Vul het volume op 20 ml met dezelfde media.
7. Doe het buisje dicht losjes om de lucht te laten voeren.
8. Laat de buis gedurende de nacht bij 37 ° C in een _CO2 incubator zodat zwakke lymfocyten om te zetten in snel prolifererende lymfoblasten.

2. Dag 2

1. Neem de buis uit de incubator, schroef de doppen volledig en draai de cellen neer op 200 xg gedurende 5 minutenbij kamertemperatuur.
2. Verwijder het supernatant door aspiratie.
3. Voorzichtig schorsen celpellet in 1 ml compleet medium.
4. Vul het volume op 20 ml met dezelfde media.
5. Doe het buisje dicht losjes om de lucht te laten voeren.
6. Laat de buis gedurende de nacht bij 37 ° C in een _CO2 incubator celaantallen breiden.

3. Dag 3

1. Haal de buis uit de incubator, schroef de doppen volledig en draai de cellen neer op 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
2. Verwijder het supernatant door aspiratie.
3. Was de cellen tweemaal met 10 ml RPMI-1640 door centrifugeren bij 200 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
4. Voorzichtig resuspendeer de celpellet in 600 ul RPMI-1640.
5. Meet de cel concentratie en de levensvatbaarheid, met behulp van een geautomatiseerde celgetalmeter en levensvatbaarheid analyzer.
6. Voeg geschikt volume RPMI-1640 aanpassen aan een celconcentratie van 1,5 x 10 ⁵ cells/20 ul.
7. Behandel cellen met recombinant OPN (rOPN) of drager (PBS) in 1,5 ml Eppendorf buisjes.
   1. Breng 100 pi celsuspensie twee steriele 1,5 ml Eppendorf buisjes.
   2. Voeg rOPN in een buis tot een eindconcentratie van 0,5 ug / ml.
   3. Voeg een gelijk volume PBS in de tweede buis.
   4. Meng elke conditie door en neer te pipetteren twee keer met een steriele pipet vastgesteld op 100 pl.
8. Bereid de kleine steekproef 96-putsmicroplaat.
   1. Voeg 5 ul van RPMI-1640 in elk putje.
   2. Centrifugeer de plaat bij 200 xg gedurende 3 minuten om eventuele luchtbellen te verwijderen.
9. Zaad de onbehandelde cellen als cellen behandeld met rOPN of PBS.
   1. Voor de overdracht van cellen uit buis microplaat, voorzichtig pipet op en neer eenmaal om een ​​uniforme suspensie van cellen te verzekeren.
   2. Voeg 40 ul celsuspensie per putje in viervoud voor onbehandelde cellen in tweevoud rOPN of PBS behandelde cellen. Refer naar figuur 1 voor het ontwerp. Dit ontwerp staat 12 patiënten worden getest op dezelfde microplaat.
   3. Laat de cel plaat onder de steriele kap gedurende 5 minuten om cellen te rusten en op te lossen gelijkmatig aan de bodem van de put voordat u het in de incubator.
10. Incubeer de plaat gedurende 18 uur bij 37 ° C in een _CO2 incubator om het effect van OPN optimaliseren.

4. Dag 4

1. Voer de plaat met verbindingen.
   1. Neem de plaat uit de incubator en laat het bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 30 minuten.
   2. Bereid 1 ml 100 uM isoproterenol somatostatine en in RPMI-1640 door toevoeging van 10 pl voorraadoplossing (10 mM) in 990 pl RPMI-1640.
   3. Vul het samengestelde plaat door af 20 ul in geschikte putjes zoals aangegeven in figuur 2.
   4. Bedek de verbinding plaat met een voorgesneden doorboorbare afdichting om verandering in de concentratie van de verbinding te voorkomen door verdamping vóórof tijdens incubatie in de CDS-systeem.
   5. Load cell plaat, pipet tips, en samengestelde plaat in de CDS-gebaseerd systeem.
   6. Noem de plaat in de CDS-gebaseerde instrument software.
   7. Selecteer het juiste protocol. Het protocol bewerkt voor de indeling met PBMC's heet 'Agonist Niet-hechtende cellen kleine steekproef Plate RT 15 min'. Ga naar het vak protocol en selecteer dit protocol in de lijst van protocollen
   8. Start het protocol door te klikken op 'Start'.
   9. De geïntegreerde fluidica systeem voegt tegelijkertijd de verbindingen alle putjes door het injecteren 5 ul per putje tot een eindconcentratie van 10 uM in een totaal volume van 50 pl.
   10. De CDS-systeem verzamelt de gegevens automatisch gedurende 15 minuten na verbinding toevoeging.
2. Data-analyse
   1. Selecteer lage en hoge reeksen van frequenties te gebruiken bij het berekenen onttrokken waarden voor de niethechtende cellen.
   2. Selecteer drift correctie op de lineaire verandering in basislijn impedantie metingen in de tijd te corrigeren.
   3. Selecteer gegevens filteren om variaties in de kinetische reactie omdat soms elektronische ruis en samengestelde toevoeging verminderen.
   4. Selecteer het Max-Min-methode voor de volledige analyse tijd.
   5. Gegevens exporteren naar Excel onder de optie plaat formaat.
   6. Bereken delta G (ΔG) door de gemiddelde omvang van de respons op stimulatie Gi (RmGi) van de gemiddelde grootte van de respons op stimulatie Gs (RMGS) met de volgende formule:
      ΔG = RmGi - RMGS
   7. Bereken het percentage van de vouw effect (Fe) van OPN op Gi-gemedieerde respons door de gemiddelde respons omvang delende aan Gi stimulatie in aanwezigheid van OPN (RmGiOPN) met de gemiddelde respons op stimulatie omvang gi in aanwezigheid van PBS ( RmGiPBS) met de volgende formule:
      Fe = 100 x (RmGiOPN / RmGiPBS)
   8. Zie Tstaat 2 aan patiënten te classificeren.

Resultaten

Levensvatbaarheid van de cellen was vergelijkbaar tussen alle monsters met constante waarden in het bereik van 86 en 96%. Daarentegen werden grote verschillen opgemerkt in het aantal cellen tussen monsters (Tabel 3). Van de 32 monsters gebruikt, twee hadden onvoldoende aantal cellen en die niet zijn ingedeeld. Een voorbeeld van de resultaten van de functionele indeling overeenkomstig de mate van onbalans tussen Gi en Gs signalering wordt getoond in figuur 3. De verticale as van deze figuur is verdeeld in drie secties de afbakening van de functionele groepen met dynamische bereiken opgericht als> 10 voor FG3, tussen +10 en -10 voor FG2, en tenslotte <-10 voor FG1. Bij 30 patiënten hier getest, 14, 6 en 5 patiënten duidelijk ingedeeld in FG3, FG2 en FG1, respectievelijk, terwijl vijf patiënten, met name 345, 353, 370, 371 en 382, ​​waren borderline van bereiken. De evaluatie van de OPN effect op de respons op Gi stimulatie bleek dat OPN verhoogde de respons in patients 353 en 371. Daarentegen werd respons met meer dan 50% bij patiënten 345 en 382 en minder dan 50% bij 370 patiënten na rOPN behandeling. Dus, volgens onze indelingscriteria (tabel 2), waren we in staat om patiënten 353 en 371 categoriseren in FG1, patiënten 345 en 382 in FG2 en patiënt 370 in FG3. Tegelijkertijd werden alle patiënten gescreend op hun reactie op Gi proteïne stimulatie en vergeleken met controle personen. Zoals verwacht, waren alle patiënten minder responsief dan controlepersonen en patiënten in dezelfde functionele groep ondergebracht onze nieuwe procedure vertoonden vergelijkbare niveau van de maximale respons (Figuur 5). Bovendien, ongelijkheid tussen patiënten van elke functionele groep was in overeenstemming met onze klassieke aanbod van classificatie ^12, onze nieuwe procedure te valideren. De indeling van een grote cohort van scoliotische patiënten regelmatig gevolgd in onze speciale kliniek in Sainte-Justine Ziekenhuis is gebleken dat de driefunctionele groepen waren gelijk verdeeld matige gevallen, terwijl de FG2 overheerste bij ernstige gevallen (figuur 6), het identificeren van patiënten ingedeeld in deze functionele groep meer risico op ernstige progressie van de ziekte en geeft aan dat dit classificatietestresultaten nuttig het kan prognose van idiopathische scoliose.

Compleet media

Oplossing A	Watervrij D-glucose	0.1%
	CaCl2 2H 2 O	0,05 mM
	MgCl2	0,98 mM
	KCl	5,4 mM
	Tris	145 mM
Oplossing B	NaCl	140 mM
Gebalanceerde zoutoplossing (BSS)	Oplossing A	1 volume
	Oplossing B	9 volume
RPMI-1640	500 ml
Antibioticum-antimycoticum	1%
FBS	10%
Aanvullende media	RPMI-1640	50 ml
	Antibioticum-antimycoticum	1%
	FBS	40%
Invriezen media	RPMI-1640	50 ml
	Antibioticum-antimycoticum	1%
	FBS	40%
	DMSO	20%
PHA media	RPMI-1640	500 ml
	Antibioticum-antimycoticum	1%
	FBS	10%
	Phytohemaglutinin	1%

Tabel 1. Essentialoplossingen.

Dynamische bereiken met ΔG	Functionele Groepen	Dynamische bereiken met Fe
ΔG <-10	FG1	Fe> 100%
-10 <ΔG <10	FG2	Fe <50%
ΔG> 10	FG3	50%

Tabel 2. Categorisering van functionele groepen volgens dynamische bereiken gelegd met ΔG en Fe.

Patiënten	Levensvatbaarheid (%)	Celconcentratie (x 10 6 / ml)	Reacties
343	88.7	11.64
344	90.5	13.6
345	94.4	8.54
346	94.3	25.79
347	94.2	27.36
348	94.6	8.52
349	91.2	0,82	Onvoldoende aantal cellen
350	90.3	8,92
352	92.6	8.28
353	91.3	12.75
354	86.9	7.62
355	91.2	7.51
356	90.3	9.36
358	95.1	16.94
359	92.3	13.89
360	89.4	7.67
361	93.5	7.84
365	86.5	2.2	Onvoldoende aantal cellen
368	92.6	15.69
369	93.4	10.9
370	92.5	19.93
371	88.8	10,68
374	93.9	16.86
376	92.9	15,67
377	93.1	9.99
378	93.6	13.57
379	92.6	19.86
380	91.1	8.46
381	93.9	14.82
382	92.1	23.06
383	92.9	11.82
384	89.1	7.73

Tabel 3. Levensvatbaarheid procent en cel-concentratie zoals bepaald met behulp van een geautomatiseerde celgetalmeter en levensvatbaarheid analyzer.

Figuur 1. Ontwerp voor cel zaaien.

Figuur 2.Ontwerpen voor het afgeven van verbindingen.

Figuur 3. Dynamisch bereik van de functionele indeling in de CDS-gebaseerd systeem. Grafiek toont waarden van de mate van onbalans tussen reacties op Gi en Gs stimulatie verkregen PBMC van patiënten met idiopathische scoliose. De waarden werden gemeten door de CDS-systeem in reactie op 10 uM somatostatine en isoproterenol. Elk punt staat voor de ΔG van beide reacties in tweevoud.

Figuur 4. Effect van rOPN op respons op Gi stimulatie in PBMCs. Cellen werden serum-verhongerd gedurende 18 uur in aanwezigheid of afwezigheid van 0,5 ug / ml rOPN en vervolgens gestimuleerd met 10 56, M van somatostatine aan Gi-gemedieerde cellulaire respons initiëren. Gegevens in de grafiek werd gegenereerd uit maximum-en minimum impedantie overeen met het gemiddelde van de respons in tweevoud.

Figuur 5. Functionele status van Gi eiwitten in PBMC van controle en scoliostic onderwerpen. PBMC van controlepersonen en scoliotische patiënten werden blootgesteld aan toenemende concentraties van somatostatine aan Gi eiwitten via endogene somatostatine receptor te stimuleren. De cellulaire respons werd gemeten door CDS-systeem zoals beschreven onder procedure. Curves werden gegenereerd uit maximum-minimum impedantie. Elke kromme geeft de lineaire regressie. De gegevens werden genormaliseerd naar maximale respons in cellen van controlepersonen en elk punt komt overeen met het gemiddelde van de respons in tweevoud./ 50768/50768fig5large.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Figuur 6. Verdeling van de functionele groepen tussen verschillende fasen van scoliose. Een grote cohort van scoliotische patiënten met een matige 794 (krommingen tussen 10-44 °) en 162 ernstige (kromming groter dan 45 °) gevallen regelmatig gevolgd bij Sainte-Justine Ziekenhuis, werden ingedeeld naar de mate van onbalans tussen de respons op Gi en Gs stimulatie. De respons werd gemeten door de CDS-systeem in reactie op 10 uM somatostatine en isoproterenol.

Discussie

We hebben een gedetailleerde procedure van cel-gebaseerde prognostische test voor idiopathische scoliose die voor perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) vers geïsoleerde of geconserveerd maximaal een jaar in vloeibare stikstof ingevroren beschreven. Aangezien met vers geïsoleerde PBMC omslachtig bij het testen groot aantal individuen, werd de procedure gepresenteerd bevroren PBMC die een praktischer alternatief klinische omgeving te bieden. Echter, problemen met de cel klonteren bij het ontdooien werden ondervonden bij ingevroren PBMCs werden aanvankelijk gebruikt, leidt soms tot inter-assay variabiliteit. Om assay reproduceerbaarheid te maximaliseren, raden we vermijden vries-dooi cyclus en slechts een keer met de bevroren monster. De procedure is zeer eenvoudig, waardoor een nauwkeurige detectie van defecte Gi eiwitfunctie in een korte tijd. Met deze procedure kan asymptomatisch en scoliotische kinderen gemakkelijk worden ingedeeld naar hun klinische resultaten beter te voorspellen zonder gevaar voor hun gezondheid. However, bij het ​​uitvoeren indeling overeenkomstig de mate van de maximale respons op stimulatie Gi vergelijking met de gezonde proefpersonen ¹² verschillende vereisten voor de controlegroep worden voldaan. Inderdaad, om een ​​goede vergelijking cohort hebben, de controlegroep moet leeftijd en geslacht gematched zijn, niet op enige vorm van medicatie, en geven prive-informatie, zoals in het verleden individuele / familiale medische geschiedenis. Deze eisen kunnen een belangrijk obstakel voor de werving van proefpersonen vormen. Daarom is het uitvoeren van de indeling door het onderzoeken van de mate van onbalans tussen de respons op Gi en Gs eiwit stimulatie in dezelfde persoon is ideaal om de noodzaak van het gebruik controlepersonen elimineren.

Het gebruik van de CDS-systeem deze prognostische test is belangrijk in termen van de gelijktijdige toevoer van Gi-en Gs-gemedieerde cellulaire responsen in dezelfde assay. Hoewel veel patiënten kunnen worden ingedeeld zonder ambiguity behulp van het dynamische bereik voor deze test vast, een klein aantal patiënten zal waarden vertonen op de grens van de reeksen, zoals blijkt uit de resultaten van dit verslag. Om deze individuen onderscheiden, hebben we de evaluatie van het effect van OPN geïntroduceerd respons op stimulatie door Gi tonen dat OPN induceert een differentieel effect op Gi-gemedieerde cellulaire respons onder de drie functionele groepen. Inderdaad vonden wij dat in aanwezigheid van OPN, respons op stimulatie Gi toename FG1, terwijl afneemt in FG2 en FG3, een hogere mate FG2. Ondanks de hoge kosten van OPN, het gebruik van deze chemokine essentieel dubbelzinnige gevallen onderscheiden, en derhalve de nauwkeurigheid van onze assay indeling. Echter, deze test is een nadeel dat minimaal 1,5 x 10 ⁵ cellen per putje vereist is om cellulaire respons waarnemen met de CDS-systeem onder onze experimentele omstandigheden. Bepaalde monsters patiënt voldoende niette testen cellen. In dit geval moet de patiënt extra bloedafname, die zorgelijk voor gezinnen en frustrerend voor de medische en laboratoriumpersoneel roepen. Prospectieve studies zijn gepland in ons laboratorium om dit probleem aan te pakken.

Toch is de huidige protocol is gebaseerd op eenvoudige en beproefde methoden om cellen te bereiden terwijl de testen wordt geautomatiseerd met behulp van een gevalideerde label-free-systeem ^{13, 14} om de reacties van de cellen te controleren. Het testplatform is relatief goedkoop in vergelijking met genetische platform vindt de prognose voor andere ziekten. Ook de kosten van alle beschikbare materialen, zoals de bloedafname buizen, tips, de elektrodekabel microplaten en conisch Eppendorf buizen, is niet erg duur en wordt geschat op minder dan $ 3000 een test ongeveer duizend patiënten voltooien. Hoewel deze schatting niet arbeidskosten voor de voorbereiding van de monsters bevattenen het uitvoeren van de test, deze test blijft aanzienlijk goedkoper dan next-generation sequencing platforms. Opmerkelijk is niet alleen de kosten ten opzichte van genetische platforms, maar meer specifiek op het gebied van AIS, de kosten voor radiologische beeldvorming. Vandaag, meer dan een miljoen kinderen in de VS en ongeveer 100.000 kinderen in Canada zijn gediagnosticeerd met idiopathische scoliose, en de totale kosten van diagnose en monitoring van de scoliotische kinderen door blootstelling X-ray is jaarlijks meer dan 2,5 miljard dollar in Noord-Amerika. Zo zou onze cel-gebaseerde test procedure worden verwacht geschikt voor routinematige screening en monitoring van kinderen met idiopathische scoliose zonder risico voor de gezondheid en tegen lagere kosten te zijn.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Materials
RPMI	Wisent, Inc	350-005-CL
FBS	Therno Scientific Hyclone	SH3007103
DMSO	Sigma Aldrich	D2650
Ficoll-Plaque Plus	GE Healthcare	17144003
Antibiotic-Antimycotic	Invitrogen	15240-062
Phytohemagglutinin	Invitrogen (Gibco)	10576-015
Recombinant Human Osteopontin	R&D Systems, Inc	1433-OP/CF
Somatostatin	Tocris	1157
Isoproterenol	Tocris	1743
PBS	Wisent, Inc	311-010-CL
Sterile pipette tips	Axygen Scientific	301-06-451
Sterile Eppendorf tubes	Ultident	24-MCT-150-C
50 ml conical tubes	VWR International	89039-658
Cellkey small sample 96W microplate	Molecular Devices	1026496
Cellkey tips	Cybio	OL3800-25-559N
Precut pierceable seals	Excel Scientific, Inc	XP-100
Equipment
Vicell XR	Beckman Coulter	731050	Geautomatiseerde celteller
Cell culture hood	Forma Scientific	1284	Klasse II
Liquid nitrogen storage	Thermo Scientific	CY5093570
Water bath	VWR International	89032-204
Standard light microscope	Leica Microsystems	DMIL LED
Cell culture incubator	Thermo Scientific	51019557	5% CO2 bij 37 °C
Low speed centrifuge	Thermo Scientific	75004364
Cellkey system	Molecular Devices	1019185	CDS-gebaseerd instrument