Methodenartikel

Hitte-geïnduceerde antigeentraughering: een effectieve methode om stamcellentypen te detecteren en identificeren tijdens neurogenese van de hippocampus bij volwassenen

DOI:

10.3791/50769

⸱

30 augustus 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurologic Surgery, Mayo Clinic College of Medicine, 2Department of Anatomy, Korea University College of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic College of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tijdens neurogenese van de hippocampus bij volwassenen wordt een specifieke set genetische markers tot expressie gebracht wanneer een inactieve neurale stamcel sequentieel progresseert en zich ontwikkelt tot een functioneel geïntegreerde neuron in de circuit. Met behulp van warmte-geïnduceerde antigeenretrieval worden progenitorceltypen die anders moeilijk te detecteren zijn, met verbeterde effectiviteit geïdentificeerd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Traditionele methoden van immunohistochemie (IHC) na weefselfixatie maken de visualisatie van verschillende celtypen mogelijk. Deze gaan doorgaans gepaard met het aanbrengen van antilichamen om antigenen te binden en cellen te identificeren met kenmerken die een functie zijn van de inherente biologie en ontwikkeling. Neurogenese in de hippocampus bij volwassenen is een sequentieel proces waarin een rustige neurale stamcel geactiveerd kan worden en door stadia van proliferatie, differentiatie, maturatie en functionele integratie kan gaan. elke fase is uniek met een karakteristieke morfologie en opregulatie van genen. Identificatie van deze fasen is belangrijk om de regulerende mechanismen die aan het werk zijn te begrijpen en eventuele veranderingen in dit proces die de pathofysiologie van invaliderende aandoeningen onderliggen. Onze door hitte geïnduceerde antigenretrieval-aanpak verbetert de intensiteit van het signaal dat wordt gedetecteerd en maakt correcte identificatie van het progenitorceltype mogelijk. Zoals besproken in dit artikel, stelt het ons vooral in staat om huidige problemen bij de detectie van bepaalde progenitorceltypen te omzeilen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurogenese, de vorming van nieuwe neuronen uit neurale stamcellen, is nu bekend dat het constant plaatsvindt tot in de volwassenheid in twee gespecialiseerde gebieden in de hersenen. Deze omvatten de subventriculaire zone (SVZ) van de olfactorische bol en de subgranulaire zone (SGZ) van de dentate gyrus in de hippocampus. In het afgelopen decennium heeft het veld van de neurogenese van de volwassen hippocampus aanzienlijk werk gezien. Het gebied heeft veel belangstelling gewekt omdat pasgeboren neuronen in de SGZ bijdragen aan verbeterde neurale plasticiteit die specifieke hersenfuncties kan ondersteunen1-5. Volwassen hippocampale neurogenese is betrokken gebleken bij het spelen van belangrijke rollen in stemmingsregulatie, regeneratie, en leren en geheugen. Daarom is er een gezamenlijke inspanning geweest om de ontwikkeling en regulatie van neuronen te begrijpen in deze rijke neurogene niche.

Een onvermijdelijk en belangrijk aspect van het bestuderen van de neurogenese van de volwassen hippocampus is de identificatie van afzonderlijke stadia waardoor een geactiveerde neurale stamcel gaat op weg naar een volledig functionele neuron. In dit proces wordt de rustige neurale stamcel geactiveerd en gaat door een reeks vroege actieve en late actieve voorlopercellentypen (Figuur 1). Deze verschillende populaties van neurale voorlopers kunnen worden geïdentificeerd door morfologie en hun expressie van moleculaire markers zoals MCM2, nestin, Tbr2 en Doublecortin (DCX) en NeuN die de omzetting van RGL's in hun respectieve voorlopercellentypen begeleiden. Nestin is een intermediaire filament-eiwit dat wordt tot expressie gebracht in de radiale gliacellen en sommige vroege voorlopercellentypen. Een andere marker is Tbr2 dat specifiek wordt tot expressie gebracht in de versterkende voorlopercellen. De Tbr2-transgenexpressie wordt aanvankelijk uitgeschakeld in de Type-1 cellen (radial-glia-achtig), ingeschakeld over de Type-2a, Type-2ab en Type-2b voorlopers en uitgeschakeld onder de meer gedifferentieerde Type-3 en onvolwassen neuronen (Figuur 1). DCX is een marker voor neuronale migratie die wordt tot expressie gebracht in de Type-2ab, Type-2b en Type-3 neurale voorlopers. Door deze combinatie van drie markers te gebruiken, kunnen we verschillende subtypen van neurale voorlopers labelen. Deze omvatten de Type-1 (MCM2+nestin+Tbr2-), Type-2a (MCM2+nestin+Tbr2+), Type-2ab (gedeeltelijke MCM2+nestin-Tbr2+ en gedeeltelijke MCM2+Tbr2+DCX-), Type-2b (MCM2+Tbr2+DCX+) en Type-3 (MCM2+Tbr2-DCX+). Post-mitotische cellen zoals de onvolwassen en functioneel geïntegreerde neuronen kunnen worden geïdentificeerd door DCX en de rijpe neuronale marker, NeuN te gebruiken.

Traditionele methoden van IHC gebruiken antilichamen om antigenen te identificeren voor specifieke celtypen op basis van hun genexpressie. Vervolgvisualisatie door hoge resolutie beeldvormingstechnieken zoals confocale microscopie kan worden gebruikt voor hun identificatie. Er zijn echter momenteel problemen met deze methoden die geen efficiënte identificatie van de radiale glia-achtige cellen en vroege voorlopercellentypen toestaan. Het is moeilijk om deze specifieke celtypen te identificeren omdat het toegepaste antilichaam niet in staat is om de nestineiwit te penetreren en efficiënt te binden. Nestin is het intermediaire filament-eiwit dat de radiale processen bevat die worden geproduceerd door de radiale glia-achtige cel. Het inefficiënte binden van een antilichaam aan het antigeen kan het gevolg zijn van vele factoren, waaronder fixatietijd, temperatuur en gebruikte techniek6-7. Om dergelijke problemen te helpen oplossen, hebben we een antigeenherstel- of 'koken'-methode ontwikkeld. Naast nestin verbetert deze methode van antigeenherstel ook de kleuring voor andere markers zoals Ki67, BrdU, gliale fibrillaire zure eiwitten (GFAP), Tbr2 en MCM2. Onze methode combineert chemische en fysische benaderingen. Het omvat chemische fixatie van het weefsel in paraformaldehyde en vervolgens hoogtemperatuur koken van dunne coronale hippocampale secties in een buffer van een denaturant en chaotropisch behandeling. Dit verbetert de toegankelijkheid van het antigeen voor het antilichaam, verbetert de antilichaamspecificiteit en staat verbeterde identificatie van voorlopercellentypen toe. Onze aanpak is eenvoudig te gebruiken en vereist meestal al beschikbare gereedschappen en reagentia in het laboratorium. We hebben het uitgebreid gebruikt om de ontwikkeling van neurale stamcellen en hun regulatie via intrinsieke genetische of extrinsieke omgevingsfactoren te bestuderen8.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pre-immunohistochemistry: Perfusie en Histologie

  1. Perfuse muizen volgens een algemeen transcardiaal protocol aangepast voor muizen en verwijder de hersenen in 4% paraformaldehyde (PFA)9.
  2. Laat de hersenen overnacht in PFA bij 4 °C (bijv. een 10 ml conische buis gevuld met PFA). Houd in PFA gedurende minimaal 12-24 uur, niet meer dan 36 uur voor volledige fixatie. Na overnachte fixatie, giet de PFA uit de conische buis maar laat de hersenen erin. Giet 30% sucrose in de buis en was de hersenen gedurende 5 seconden om eventueel overgebleven PFA te verwijderen. Vul tenslotte de buis met hersenen opnieuw met 30% sucrose. Bewaar de hersenen in sucrose bij 4 °C tot de hersenen op de bodem van de buis zinken.
  3. Snijd 40 μm hersensecties op een microtoom. Raadpleeg een muizenhersenatlas om te beginnen met het verzamelen van secties vanaf het begin van de dentate gyrus tot het einde. Bewaar de secties in antivriesoplossing (een eenvoudig recept is 300 g sucrose in 500 ml 0,1 M PBS en 300 ml ethyleenglycol) totdat ze klaar zijn voor immunohistologie.
  4. Montage het gesneden weefsel op microscoopglazen die specifiek ontworpen zijn om sterk aan weefsel te hechten. Deze glazen zorgen voor een sterke hechting aan het weefsel tijdens de kookfase. Laat het glas na montage van het weefsel 10 min drogen of tot het volledig droog is. Het drogen kan worden versneld als het glas tegen een verticale oppervlakte wordt geplaatst met de onderkant van het glas op een papieren handdoek. Als er meer dan één glas wordt gemonteerd, kunnen de andere glazen gedurende die tijd droog worden gelaten (1-2 uur is oké) totdat klaar om door te gaan naar de volgende stap.
  5. Zodra het glas droog is, was het driemaal gedurende 5 min met PBS en droog het opnieuw (PBS-buffer = 0,137 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,0119 M Na2PO4). Dit zorgt ervoor dat eventuele eerdere chemicaliën (zoals glycerol uit de antivriesopslagoplossing) voldoende worden verwijderd en de hechting van het weefsel aan het glas niet kunnen beïnvloeden.

2. Voorbereiding van Reagentia en Kleine Apparatuur

  1. Bereid Oplossing A (0,1 M of 19,21 g/l citroenzuur) en Oplossing B (0,1 M of 24,9 g/l tris-natriumcitraat) voor waarin weefselsecties gekookt zullen worden.
  2. Combineer in een geschikte cilinder 9 ml van Oplossing A en 41 ml van Oplossing B. Voeg 450 ml ddH2O toe aan dit mengsel.
  3. Plaats dit mengsel in een lege container (bijv. een lege doos met pipettips) die magnetronbestendig is.

3. Warmte-geïnduceerde Antigeenretrieval

  1. Kook de oplossing gemaakt in stap 2 gedurende 5 min op standaardinstellingen in een standaard magnetron. De oplossing zal beginnen te koken bij of boven de 100 °C.
  2. Zodra het koken voltooid is, verwijder voorzichtig de container uit de magnetron en plaats de gedroogd glazen erin, zorg ervoor dat het glasoppervlak met hippocampale secties naar beneden gericht is en volledig blootgesteld aan de vloeistof. Plaats indien mogelijk de glazen schuin tegen de wanden van de doos en stapelt andere glazen eromheen. Zorg ervoor dat hun "pasvorm" in de doos goed zit, zodat de glazen geen ruimte hebben om boven elkaar te bewegen.
  3. Kook dit mengsel met glazen gedurende 7 min op standaardinstellingen in de magnetron. De oplossing zal gedurende deze tijd koken bij of boven de 100 °C.
  4. Tijdens deze kookfase, vul twee ijsemmers voor de helft met ijs.
  5. Zodra het koken in stap 3.3 voltooid is, verwijder de container uit de magnetron en plaats deze in een van de ijsemmers. Giet het resterende ijs uit de andere emmer om de container heen en bedek deze volledig. Laat het 1 uur staan.

4. Primaire en Secundaire Antilichaamkleuring

  1. Aan het einde van de 1 uur wachttijd, verwijder de glazen uit de container en was ze driemaal gedurende 5 min met TBS-T buffer. Elke apparaat kan worden gebruikt om deze basiswassingen uit te voeren. (Buffer TBS = 50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, TBS-T = 0,05% Triton X-100 TBS-buffer, TBS-TT = 4% ezelsserum TBS-T-buffer).
  2. Na het wassen, laat de glazen drogen in een donkere plaats (bijv. in een laboratoriumlade, plaats een papieren handdoek in de lade en laat het glas er tegenaan leunen) gedurende 5-10 min of tot het glas volledig droog is. Bereid gedurende deze periode een kamer voor voor overnachtelijke primaire antilichaamkleuring. Een eenvoudige kleuringskamer kan een container met een groot oppervlak gevuld met ddH2O en een podium binnenin de container omvatten, waarop het glas boven het ddH2O kan rusten.
  3. Zodra het glas droog is, teken een omtrek rond de weefselsecties met een waterafstotende pen. Tijdens stap 4.5 dient deze omtrek als een barrière die voorkomt dat het antilichaammenggewas overstroomt.
  4. Bereid het primaire antilichaammenggewas in TBS-TT. Er is minimaal 500 μl nodig om één volledig glas te bedekken (bijv. als het antilichaam-voorraad bij een concentratie van 1:500 is, voeg dan 1 μl van een specifiek antilichaam toe aan 500 μl van TBS-TT). Gebruik primaire antilichamen zoals vermeld in de reagentiatabel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurogenese in de hippocampus van volwassenen is een sequentieel proces waarbij het representatieve progenitorceltype in elke fase kan worden geïdentificeerd met een combinatie van markers. Zorgvuldige chemische fixatie en antigeen-retrieval verbeteren de effectiviteit en toegankelijkheid van markers die anders moeilijk te detecteren zijn. Een van deze markers is nestin, dat tot expressie komt in radiale glia-achtige neurale stamcellen en sommige vroege actieve progenitorceltypes. Nestin kan een sleutelprotein zijn bij h...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De meest kritische stappen voor succesvolle antigeen-retrieval en kleuring van progenitorceltypen zijn: 1) het gebruik van goed geperfundeerd en gefixeerd weefsel van de optimale coronale dikte; 2) voldoende tijd toestaan voor koken en daaropvolgende afkoeling tijdens antigeenretrieval; 3) handmatig vakmanschap bij het monteren van gefixeerde coronale secties en het voorkomen van schade hierbij.

Het is cruciaal bij IHC om geperfundeerd weefsel te gebruiken dat voldoende fixatie heeft ondergaan...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De methodologie werd oorspronkelijk ontwikkeld in het laboratorium van Dr. Hongjun Song aan het Institute for Cell Engineering, Department of Neurology, Johns Hopkins School of Medicine. Dit werk werd gefinancierd door NIMH (R00MH090115), NARSAD, de Fraternal Order of Eagles' Mayo Cancer Research Fund en een startpakket van Mayo Foundation toegekend aan M.H.J. en Basic Science Research Program via de National Research Foundation of Korea (NRF) gefinancierd door het Ministry of Education, Science and Technology (A3014385) toegekend aan W.R.K.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
SuperFrost Plus SlideFisherbrand12-550-15Biedt sterke hechting aan hippocampal weefsel tijdens koken
PVA/DABCO Mounting MediaSigma Aldrich10981-100 ml
Nestin (chicken) Aves LabNESNeurale stamcel marker
GFAP (rabbit)Dako North AmericaZ033401-2Astrocyte en neurale stamcel marker
MCM2 (mouse)BD Transduction Laboratory610701Proliferatie marker
DCX (goat)Santa Cruz BiotechnologySC8066Onrijpe neuron marker
Tbr2 (rabbit)AbcamAb23345Amplificerende progenitor marker
NeuN (mouse)MilliporeMAB377Mature neuron marker
Cy2 (anti-rabbit)Jackson Immunoresearch111-226-047
Cy2 (anti-chicken)Jackson Immunoresearch303-165-006
Cy5 (anti-mouse)Jackson Immunoresearch315-175-047
Cy5 (anti-goat)Jackson Immunoresearch305-165-047
DAPILife Technologies CorporationD1306
Dako PenS2002DakoWaterafstotende pen

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annual Reviews of Neuroscience. 28, 223-250 (2005).
  2. Santarelli, L., Saxe, M., et al. Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants. Science. 301 (5634), 805-809 (2003).
  3. Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-4670 (2011).
  4. Clelland, C. D., Choi, M., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325 (5937), 210-213 (2009).
  5. Wang, J. W., David, D. J., et al. Chronic fluoxetine stimulates maturation and synaptic plasticity of adult-born hippocampal granule cells. Journal of Neuroscience. 28 (6), 1374-1384 (2008).
  6. D'Amico, F., Skarmoutsou, E., Stivala, F. State of the art in antigen retrieval for immunohistochemistry. Journal of Immunological Methods. 341 (1-2), 1-18 (2009).
  7. Daneshtalab, N., et al. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 61 (2), 127-135 (2010).
  8. Jang, M. H., Bonaguidi, M. A., et al. Secreted frizzled-related protein 3 regulates activity-dependent adult hippocampal neurogenesis. Cell Stem Cell. 12 (2), 215-223 (2013).
  9. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).
  10. Porcelli, M., Cacciapuoti, G., et al. Non-thermal effects of microwaves on proteins: Thermophilic enzymes as model system. FEBS Letters. 402 (2-3), 102-106 (1997).
  11. Stone, J. R., Walker, S. A., Povlishock, J. T. The visualization of a new class of traumatically injured axons through the use of a modified method of microwave antigen retrieval. Acta Neuropathologica. 97 (4), 335-346 (1999).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

ImmunohistochemieConfocale MicroscopieWeefselfixatiePrimaire AntilichaamkleuringSecundaire AntilichaamkleuringHersensectieMagnetronkoken

Gerelateerde artikelen