Procedure voor de ontwikkeling van multi-diepte Circulaire Cross-sectionele endotheel Microkanalen-on-a-chip

Summary

Een microchannels-on-a-chip platform werd ontwikkeld door de combinatie van fotolithografische reflowable fotolak techniek, zachte lithografie, en microfluidics. Het endotheel microkanalen platform bootst de driedimensionale (3D) geometrie van in vivo micro-vaatjes, loopt onder gecontroleerde continue perfusie stroom, zorgt voor hoge kwaliteit en real-time beeldvorming en kan worden toegepast voor microvasculaire onderzoek.

Abstract

Inspanningen gericht op het ontwikkelen van in vitro assays voor de studie van microvaatjes omdat in vivo dierstudies zijn tijdrovend, duur en observatie en kwantificering zijn zeer uitdagend. Echter, conventionele in vitro assays microvaatje hebben beperkingen als die in vivo microvaatjes met betrekking tot driedimensionale (3D) geometrie en een continue vloeistofstroom. Met behulp van een combinatie van fotolithografische reflowable fotolak techniek, zachte lithografie, en microfluidics, hebben we een multi-diepte cirkelvormige dwarsdoorsnede endotheel microkanalen-on-a-chip, die de 3D-geometrie van de in vivo micro-vaatjes nabootst en draait onder gecontroleerde continue perfusie flow. Een positieve herplaatsbaar fotolak werd gebruikt om een ​​meester mal te fabriceren met een halfronde dwarsdoorsnede microchannel netwerk. Door de afstemming en binding van de twee polydimethylsiloxaan (PDMS) microchannels replvoor bestemde van de meester mal, werd een cilindrische microchannel netwerk gecreëerd. De diameters van de microkanalen kan goed worden gecontroleerd. Bovendien primaire humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) gezaaid in de chip bleek dat de cellen gevoerd het binnenoppervlak van de microkanalen in gecontroleerde perfusie die gedurende een tijdsperiode tussen 4 dagen tot 2 weken.

Introduction

Microvaatjes als onderdeel van het circulatiesysteem, bewerkstelligen de interactie tussen bloed en weefsels, ondersteunen metabolische activiteiten definiëren weefsel micro en spelen een belangrijke rol in vele gezondheids en pathologische omstandigheden. Recapitulatie van functionele microvaatjes in vitro kan een platform voor de studie van complexe vasculaire fenomenen. Echter, conventionele in vitro assays microvaatje, zoals endotheliale celmigratie testen buisvorming endotheliale assays en ratten en muizen aortaring assays, in staat zijn de opnieuw in vivo microvaatjes met betrekking tot driedimensionale (3D) geometrie als continu control ^1-8. Studies microvaatjes met dierlijke modellen en in vivo assays, zoals corneale angiogenese assay, kuiken chorioallantoïsmembraan angiogenese assay en Matrigel plug assay, zijn tijdrovend, in hoge kosten, uitdaging met betrekking tot waarneming en kwantificering enethische kwesties ^{1, 9-13.}

Vooruitgang in micromanufacturing en microfluïdische chip technologieën hebben verschillende inzichten mogelijk in biomedische wetenschappen terwijl vermindering de experimentele hoge kosten en complexiteit van de dieren in vivo studies ^14, zoals gewoon strak gecontroleerde biologische omstandigheden en dynamische vloeibare milieus, die niet zou mogelijk met conventionele technieken macroschaal.

Hier presenteren we een aanpak om een endotheel construeren microchannels-on-a-chip, die de 3D-geometrie van de in vivo micro-vaatjes nabootst en draait onder gecontroleerde continue perfusie stroom door gebruik te maken van de combinatie van fotolithografische reflowable fotolak techniek, zachte lithografie, en microfluidics.

Protocol

1. Fotolithografie Fabrication van Photoresist Master Mold

Het volgende protocol toont het proces om de microkanalen fabriceren met een diameter tussen 30-60 um. Een microkanaal komen met een kleinere diameter (kleiner dan 30 urn), een spin-coating fotoresist nodig.

1. Breng de reflow fotolak van de koelkast bij 4 ° C tot de cleanroom 24 uur voor gebruik en laat het opwarmen tot kamertemperatuur.
2. Schoon een silicium wafer en bak het gedurende een uur bij 150 ° C om deze te dehydrateren. De uitdroging wordt de fotoresist voorkomen kan het siliciumsubstraat.
3. Spin-laag de eerste laag fotolak met het volgende recept:

Stap	Tijd (seconden)	Toerental (tpm)	Versnelling
1	2	300	hoogst
2	10	0
3	3	300	hoogst
4	60	600	hoogst
5	10	500	hoogst
6	10	600	hoogst

4. Bak dan de wafel op een verwarmingsplaat met een temperatuur van 110 ° C gedurende 90 sec. Na het zacht bakken de dikte van de fotoresist wordt 20-30 urn.
5. Spin laag een tweede laag fotolak volgens dezelfde receptuur voor de eerste laag.
6. Zachte bak de wafer opnieuw door het op een verwarmingsplaat met een temperatuur van 110 ° C gedurende 90 sec. Hierna soft bake de dikte van de fotoresist wordt 40-60 urn.
7. Genereren van positieve meester patronen door het blootstellen van de photoresist aan UV-licht met een bestralingsdosis van 14.500 mJ / cm ² door middel van een film masker.
8. Verdun de ontwikkelaar met gedeïoniseerd (DI) water (1:2 (v / v)). Herhaaldelijk spoelen de wafer in de oplossing totdat het patroon volledig is ontwikkeld. Was daarna de wafer met DI-water en droog het met behulp van stikstofgas.
9. Opnieuw: Plaats de wafer op een verwarmingsplaat met een temperatuur van 120 ° C gedurende 4 min en deksel met een glazen petrischaal om oplosmiddelverdamping te voorkomen. Verwijder de wafer uit een verwarmingsplaat en laat afkoelen tot kamertemperatuur. De fotoresist dikte na reflow is gewoonlijk 50-60 micrometer.

2. Zachte Lithografie Fabrication van PDMS Microchannel Network

1. Bereid polydimethylsiloxaan (PDMS) oplossing in de gewichtsverhouding van 10:01 (basis: verharder) en meng het grondig met een centrifugale planetaire menger.
2. Wierp de PDMS oplossing op de opnieuw geplaatste fotolak meester mal. Plaats de gegoten PDMS in een exsiccator gedurende 15 minuten te ontgassen. Gebruik stikstofgas om alle resterende luchtbellen indien nodig te verwijderen.
3. Bak de PDMS in een oven bij een temperatuur van 60 ° C gedurende 3 uur om deze te genezen. Verwijder vervolgens de uitgeharde PDMS laag van de meester mal.
4. Gebruik een scherp puncher met inlaat / uitlaat gaten te creëren door het ponsen van gaten in het kanaal netwerk. Reinig het oppervlak van de PDMS met stikstofgas.
5. Behandel twee PDMS lagen met zuurstofplasma gedurende 30 seconden in een plasma cleaner bij een werkdruk van 4,5 x 10 ^-2 Torr en een zuurstof stroomsnelheid van 3,5 m ³ / min. Breng daarna de oppervlakken van de PDMS handmatig onder een optische microscoop. Gebruik een druppel water eventueel een betere controle van de uitlijning.
6. Bak de inrichting in een oven bij 60 ° C gedurende 30 min tot permanente verbinding te verkrijgen.

3. HUVEC Cultuur en zaaien in de Chip

1. Cultuur de HUVEC door kweekmedium met L-glutamine, aangevuld met 10% foetaal bovine serum (FBS). Voor the experiment doorgangen tussen 2 en 5 werden gebruikt.
2. Zodra de HUVEC confluent zijn, tellen de cellen en oogst ze door eerst spoelen van de cellen met HEPES gebufferde zoutoplossing (HEPES-BSS), en vervolgens behandelen van de cellen met trypsine / EDTA en incubeer gedurende 2-6 minuten bij 37 ° C. Na de behandeling met trypsine is voltooid, neutraliseren de trypsine / EDTA met trypsine neutraliserende oplossing. Centrifugeer en schorten de cellen in kweekmedium met 8% dextran om ze te verzamelen. Dextran werd gebruikt om het medium viscositeit te verhogen om te helpen bij hogere cellulaire zaaien en bevestiging.
3. Behandel het apparaat met zuurstofplasma gedurende 5 min bij een werkdruk van 4,5 x 10 ^-2 Torr en een zuurstof stroomsnelheid van 3,5 m ³ / min. Vervolgens laadt het apparaat met DI-water en behandelen met UV-licht voor 8 uur in een laminaire bioveiligheid kap voor sterilisatie.
4. Een dag voor de cellen klaar zijn, was het apparaat met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x PBS) dan jas met fibronectine (100 ug / ml, diluted met 1x PBS) en incubeer in de koelkast bij 4 ° C overnacht.
5. Na de fibronectine coating, wast het apparaat met 1x PBS vervolgens te vullen met kweekmedium. Incubeer de inrichting bij een temperatuur van 37 ° C gedurende 15 minuten.
6. Plaats de HUVEC cellen in 8% dextran kweekmedium met een celconcentratie van 3-4 x 10 ⁶ cellen / ml. Plaats een 20 ul druppel cellen bij een inlaat van het toestel en kantelen om de cellen te introduceren in de microfluïdische kanaal. Na 15-20 min de cellen beginnen te hechten aan de zijwanden van de kanalen. Draai het apparaat elke 15 minuten tot een gelijkmatige verdeling van de cellen te creëren. Indien nodig kan extra lading worden uitgevoerd.

4. Langdurige perfusie Setup

Na 5-6 uur van statische cultuur, zal de bijgevoegde HUVECs beginnen om volledig uit te strekken. Opzetten perfusie met behulp van een op afstand bestuurbare spuit pompsysteem met een gestage stroom van 10 pl / uur. Perfusie kan worden aangepast fof een hoger debiet, en kan duren voor een periode van 4 dagen tot 2 weken.

5. Cel kleuring en Microscoop karakterisering

1. Wanneer de cellen te bereiken samenvloeiing in het apparaat, ten eerste, was het apparaat met 1x PBS om grondig te verwijderen het medium. Vervolgens laadt het apparaat met rode kleurstof verdund met verdunner (4 pl-1 ml). Laad de kleurstof vergelijkbaar met de cel laadproces. Incubeer het apparaat in het donker gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en daarna wassen het apparaat kweekmedium kleuring stoppen. Lange incubatie van de kleurstof kan cellulaire toxiciteit en disadhesion veroorzaken.
2. Laad het apparaat met blauwe kleurstof verdund met 1x PBS (2 druppels per ml). Incubeer in het donker gedurende 5 min bij kamertemperatuur geroerd en daarna grondig het apparaat met 1x PBS.
3. Onderzoek de cel kleuring onder een omgekeerde optische microscoop. Als de kleuring was goed, laadt de microkanalen met vaststelling medium (3,5% paraformaldehyde verdund met 1x PBS), vervolgens onderdompelenhet apparaat bij de vaststelling van middelgrote en volledig bedekken met aluminiumfolie. Bewaar het toestel in de koelkast bij een temperatuur van 4 ° C zodat het apparaat niet uitdroogt en fotobleken. De vaste inrichting is nu klaar voor confocale beeldvorming, die kan worden uitgevoerd door een laser scanning confocale microscoop.

Results

Onze benadering van de multi-diepte microkanaal netwerk vervaardigen bootst de complexe 3D geometrieën van in vivo microvaatjes, waarbij de microkanalen afgeronde doorsneden ^15. Bovendien, de diameters van de ouder vertakkende kanalen en dochter kanalen ongeveer gehoorzamen Murray wet handhaven de fluïdumstroom op een vereist niveau, zodat de totale kanaal weerstand laag en stroomsnelheden zijn gelijk voor het gehele netwerk ^16-18. De procedure en de resultaten voor de vervaardiging van ee...

Discussion

1. Meester schimmel fabricage

Een van de ontwerpen en de leidende beginselen voor vasculaire morphometry staat bekend als Murray's wet ^16, waarin staat dat de verdeling van het schip diameters in het gehele netwerk wordt beheerst door minimale energie overweging. Het bepaalt ook dat de kubus van de diameters van een ouder schip op een vertakking is gelijk aan de som van de kubussen van de diameters van de dochter schepen (

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagens/Materiaal
Reflow Photoresist	AZ Electronic Materials	AZP4620
Ontwikkelaar	AZ Electronic Materials	AZ 400K
PDMS	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
MCDB 131 Cultuurmedium	Invitrogen	10372-019
NacBlue Kernkleuring	Invitrogen	H1399
PKH Red Kleuring	Sigma	MINI26 en PKH26GL
Fibronectine	Gibco	PHE0023
L-Glutamine	Sigma	G7513
Fosfaat Gebufferde Saline	Invitrogen	14040-133
HEPES Gebufferde Saline Oplossing	Lonza	CC-5024
Trypsine/EDTA	Invitrogen	25300-062
Trypsine Neutralisatie Oplossing	Lonza	CC-5002
PDMS Uithardingsmiddel	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
Primaire Humane Umbilicale Vaat Endotheel Cellen	Lonza	CC-2517
Foetaal Rundserum	Lonza	14-501F
Diluent C	Sigma	CGLDIL
Hoechst33342	Invitrogen, Molecular Probes	R37605
Dextraan	Sigma	95771
3,5% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	15710-S
Apparatuur
Spinner	Laurell Technologies Corporation	WS-400BZ-6NPP/LITE
Exsiccator	BelArt Products	999320237
Omgekeerd Microscoop	Nikon	Eclipse Ti
Spuitpomp Systeem	Harvard Apparatus	PHD Ultra
Laminaire Bioveiligheids Kap	Thermo Scientific	1300 Series A2
Planetaire Centrifuge Mixer	Thinky	ARE-310
Isotemp Oven	Fisher Scientific	13-246-516GAQ
Optische Microscoop	Zeiss	Invertoskop 40C
Plasma Reiniger	Harrick Plasma	PDC-32G
Hotplate	Barnstead/Thermolyne Cimarec	SP131635
Laser Scanning Confocal Microscoop	Zeiss	LSM 510