Identificatie van specifieke Sensory Neuron Populaties voor Studie van Uitgedrukt Ion Channels

Samenvatting

Afferent sensorische neuronen geven sensorische informatie van de periferie naar het centrale zenuwstelsel door. Het identificeren van specifieke afferente neuronen zal helpen bij het begrijpen van hun fysiologie. We beschrijven een methode van retrograad labelen om afferente neuronen te identificeren, en bestuderen de spanningsafhankelijke ionenkanalen in deze neuronen met behulp van patch clamp elektrofysiologie en immunocytochemie.

Samenvatting

Sensorische neuronen dragen signalen van verschillende delen van het lichaam over naar het centrale zenuwstelsel. De soma van deze neuronen bevinden zich in de dorsale wortelganglia die langs de wervelkolom lopen. Het begrijpen van de receptoren en kanalen die door deze sensorische afferente neuronen worden uitgedrukt, kan leiden tot nieuwe therapieën voor ziekten. De eerste stap is om de specifieke subset van sensorische neuronen van interesse te identificeren. Hier beschrijven we een methode om afferente neuronen die de spieren innerveren te identificeren door retrograde markering met behulp van een fluorescerende kleurstof DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanineperchloraat). Het begrijpen van de bijdrage van ionkanalen aan de excitatie van spierafferenten kan helpen om overmatige excitabiliteit, veroorzaakt door bepaalde ziektetoestanden zoals perifere vaatziekten of hartfalen, beter te beheersen. We gebruikten twee benaderingen om de spanningsafhankelijke ionkanalen die door deze neuronen worden uitgedrukt te identificeren, patch clamp elektrofysiologie en immunocytochemie. Terwijl elektrofysiologie plus farmacologische blokkers functionele ionkanaalsoorten kunnen identificeren, gebruikten we immunocytochemie om kanalen te identificeren waarvoor specifieke blokkers niet beschikbaar waren en om het ionkanaaldistributiepatroon in de celpopulatie beter te begrijpen. Deze technieken kunnen worden toegepast op andere delen van het zenuwstelsel om specifieke groepen neuronen te bestuderen.

Inleiding

Dorsale wortelganglia (DRG) bestaan uit soma van afferente neuronen die verschillende delen van het lichaam innerveren, en belangrijke inzichten kunnen worden verkregen door sensorische neuronen met verschillende innervatiedoelen te bestuderen¹. Er worden verschillende indirecte of invasieve methoden gebruikt om afferente neuronen te isoleren en te identificeren, bijvoorbeeld door het injecteren van de zenuw met markers zoals fluorogold¹, het injecteren van kleurstof in de spieren via een chirurgische methode². Van de verschillende kleurstoffen die succesvol zijn gebruikt om neuronen en neuronale banen te labelen, worden fluorescerende kleurstoffen zoals DiI veel gebruikt in neuroanatomische tracings vanwege hun snelle opname door neuronterminals, langetermijnretentie in neuronen en het ontbreken van overdracht tussen neuronen³. De afferente neuronen gelabeld met DiI kunnen gemakkelijk worden gevisualiseerd met behulp van een fluorescerende microscoop voor gedetailleerd onderzoek. Een beperking is echter dat markers zoals DiI kunnen verloren gaan uit cellen tijdens celpermeabilisatie die nodig is voor immunocytochemie met intracellulaire epitopen⁴. Hier beschrijven we een methode die DiI gebruikt dat in skeletspier wordt geïnjecteerd om spier-afferent neuronen in de DRG te identificeren. We beschrijven ook een methode voor celpermeabilisatie die DiI in het neuron behoudt terwijl het toegang tot antilichamen tot intracellulaire epitopen mogelijk maakt. We demonstreren het gebruik van zowel patch clamp elektrofysiologie als immunocytochemie om deze geïdentificeerde neuronen te bestuderen, evenals de verschillende voordelen van elke techniek bij het bestuderen van ionenkanalen die de neuronale excitabiliteit regelen. Ten slotte beschrijven we potentiële problemen die de interpretatie van elektrofysiologische gegevens kunnen belemmeren. We hebben deze methoden gebruikt om spier- en cutane afferente neuronen te identificeren en de voltage-gereguleerde natrium (NaV) kanalen te bepalen die in deze geïdentificeerde neuronen worden tot expressie gebracht⁸. Deze methoden kunnen echter worden aangepast aan een verscheidenheid aan preparaten voor het bestuderen van geïdentificeerde subsets van neuronen die een bepaald doelweefsel of hersenkern innerveren.

Protocol

Let op: Al het werk met dieren moet worden uitgevoerd volgens institutionele richtlijnen en richtlijnen voor dierenverzorging.

1. Voorbereiding van het dier en labeling

1. Anesthesieren van ratten: Anesthesier een rat (meestal 150-400 g) met behulp van een intraperitoneale injectie van een mengsel van ketamine (50 mg/kg lichaamsgewicht), xylazine (5 mg/kg) en acepromazine (1 mg/kg). Controleer op reflexen door in de poot te knijpen, wacht tot er geen reactie meer is. Aangezien de anesthesierespons varieert tussen dieren, is het het beste om het effect van de anesthetica te bepalen door pijnreflexen te testen.
2. DiI-oplossing: Weeg DiI-poeder en los op in steriele 100% DMSO om een 1,5%-oplossing (15 mg/ml) te verkrijgen. Bewaar de oplossing op kamertemperatuur in een droge atmosfeer tot gebruik.
3. DiI-injecties: scheer het haar boven de kuitgebied aan beide poten van de anesthetiseerde rat met een elektrische scheerapparaat.
   1. Vul een steriele 1 ml-spuiten (1¼ in 27 G naald) met 200 µl van 1,5% DiI-oplossing. Steek de naald langzaam parallel aan de lange as van elke gastrocnemiusspier en injecteer 100 µl DiI in de spier terwijl u de naald langzaam uit de spier trekt (~10 sec) zonder deze uit de spier te trekken.
   2. Voordat u de naald uit de spier trekt, trek aan de plunjer van de spuit om ervoor te zorgen dat de kleurstof niet meer uit de punt stroomt, wacht 10 sec en trek vervolgens de naald uit de spier. Deze stap voorkomt dat DiI uit de naald op de huid lekt, wat cutane afferente vezels zou kunnen labelen.
   3. Herhaal voor de andere poot.
   4. Laat 4-5 dagen verstrijken voordat de DiI van de spier naar de DRG wordt getransporteerd.

2. Dissecto en neuronale isolatie

1. Oplossingen:
   1. Bereid Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) en Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) volgens de instructies van de fabrikant, filter steriliseer en bewaar bij 4 °C.
   2. Kweekmedium (MEM Plus): Meng 89 ml minimaal essentieel medium (MEM), 10 ml foetaal bovien serum (FBS), 1 ml penicilline-streptomycineoplossing, filter steriliseer en bewaar bij 4 °C.
   3. Polylysineoplossing: los poly-L-lysine hydrobromide poeder (10 mg/100 ml) op in 0,1 M natriumboraatoplossing, pH 8,4, filter steriliseer en bewaar aliquots bij -20 °C.
2. Bekleed dekglasjes
   1. Reinig de glazen dekglasjes (12 mm rond) 3-4 uur in 70% ethanol en laat ze in de steriele kweekkap drogen.
   2. Plaats de gedroogde dekglasjes in de polylysineoplossing O/N.
   3. Haal ze uit de polylysineoplossing en was ze 2x gedurende 5 min in sterieel gedestilleerd water om eventueel overtollig polylysine te verwijderen.
   4. Scheef de dekglasjes, droog in de kweekkap en bewaar bij 4 ^oC.
3. Opzetten voor dissectie
   1. Plaats op ijs een beker met 10 ml HBSS, een 35 mm petrischaal en een 100 mm petrischaal.
   2. Weeg enzymen af: 7 mg collagenase, 1 mg DNAse en 10 mg trypsine.
   3. Verwarm een schuddend waterbad tot 37 ^oC en plaats in het bad een 15 ml centrifugeerbuisje met 10 ml van EBSS om op te warmen.
4. Dissectie:
   1. Offer de rat volgens een IACUC-goedgekeurd protocol. Karbon dioxide werd gebruikt om de rat te euthanaseren.
   2. Verwijder snel de rug door de huid op de rug open te snijden, verwijder het bind- en spierweefsel langs de wervelkolom voor een betere blootstelling en verwijder het lendendeel van de wervelkolom (eind van de thoracale regio tot het iliacale bot; Figuur 1).
   3. Plaats de geïsoleerde wervelkolom in de 100 mm petrischaal en breng met behulp van een steriele Pasteurpijpje gekoelde HBSS-oplossing aan om de preparatie vochtig en koud te houden.
   4. Snij de spieren van de zijkanten van de wervelkolom af. Voer een dorsale laminectomie uit, met behulp van rongeurs of schaar, en verwijder voorzichtig het bot dat de recessen met de DRG omsluit.
   5. Breng herhaaldelijk ijskoud HBSS (~1 ml) aan tijdens deze procedure.
   6. Isoleer de DRG door de perifere en centrale zenuwen door te snijden (laat 1-2 mm van de zenuw over om de handhaving van de ganglia te vergemakkelijken)
   7. Plaats de geïsoleerde DRG in de 35 mm petrischaal met ijskoud HBSS-buffer.
   8. Herhaal totdat alle L-4 en L-5 DRG zijn geïsoleerd. Thoracale DRG kunnen worden geïsoleerd en afzonderlijk worden verwerkt als een negatieve controle voor DiI-labeling.
   9. Plaats de schaal met geïsoleerde DRG onder een dissectiemicroscoop en verwijder de overtollige zenuwen en bloedvaten met behulp van microschaar en pincet.
   10. Snij de DRG open voor een betere blootstelling aan de enzymen, maar schaaf de DRG niet af.
5. DRG-neurondissociatie:
   1. Voeg de enzymen toe aan het warme EBSS-medium (in het waterbad gehouden). Schud kortjes om op te lossen en filter steriliseer.
   2. Plaats alle DRG met behulp van

Resultaten

Met behulp van de hier beschreven methode hebben we spierafferente neuronen in DRG geïdentificeerd en gingen verder om de spanningsafhankelijke natriumkanalen (NaV) te bepalen die door deze neuronen worden uitgedrukt. DiI-gelabelde spierafferente neuronen (Figuur 1C) vormden een klein deel van de totale populatie neuronen in de DRG met een gemiddelde van 16% van de neuronen (167/1047) gelabeld. De kwantificering werd gedaan door eerst de fluorescentie te meten met behulp van ImageJ en histogrammen van de...

Discussie

Spierafferente die afkomstig zijn van triceps surae-spieren (bijv. gastrocnemius) zijn in meerdere studies gebruikt om de oefenpressorreflex (EPR)¹³ te onderzoeken. Gezien de interesse in het bestuderen van sensorische neuronen die de EPR mediëren, werden de gastrocnemiusspieren geselecteerd voor verfinjectie. DiI werd gekozen vanwege zijn lipofiele aard en omdat het niet door diffusie door het intacte plasmamembraan uit de neuronen verloren gaat^3,14. Met behulp van deze methode als richtli...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
NaV 1.8	Abcam	Ab93616
NaV 1.1 / 1.6/ 1.7 en 1.9	Alamone Labs, Jeruzalem, Israël	ASC- 001/ 009 /008 /017
Alexa Fluor secundaire antilichamen	Invitrogen
Normaal geitenserum
Fluoro-Gel	Electron Microscopy Sciences	17985