Techniek voor het bestuderen van geleedpotigen en microbiële gemeenschappen binnen Tree Tissues

Samenvatting

We bieden een techniek om intact boomfloëem te behouden en het voor te bereiden op observatie. We creëren een apparaat genaamd een floëemsandwich dat het mogelijk maakt om geleedpotigen, microben en andere organismen die in floëemweefsels leven te introduceren en observeren.

Samenvatting

Floëmgeweven van dennen zijn habitats voor duizenden organismen. Geleedpotigen en microben gebruiken floëm en cambiumweefsels om partners te zoeken, eieren te leggen, jongen groot te brengen, te voeden of zich te verbergen voor natuurlijke vijanden of barre omgevingsomstandigheden buiten de boom. Organismen die in het floëmgeweven blijven, zijn moeilijk waar te nemen vanwege hun locatie onder de bast. We bieden een techniek om intact floëm te behouden en het voor te bereiden op experimenten met ongewervelden en micro-organismen. De apparaat wordt een ‘floëmsandwich’ genoemd en maakt het mogelijk om geleedpotigen, microben en andere organismen te introduceren en te observeren. Deze techniek heeft geresulteerd in een beter begrip van de voedingsgedragingen, levensgeschiedeniskenmerken, voortplanting, ontwikkeling en interacties van organismen in het floëmgeweven van bomen. De sterke punten van deze techniek zijn het gebruik van goedkope materialen, variabiliteit in de grootte van de sandwich, flexibiliteit om de sandwich te heropenen of meerdere organismen te introduceren via geboorde gaten, en het behoud en de instandhouding van de integriteit van het floëm. De floëmsandwich is een uitstekend educatief hulpmiddel voor wetenschappelijke ontdekkingen in zowel K-12 wetenschapscursussen als universitaire onderzoekslaboratoria.

Inleiding

Het floëem en schors weefsels van naaldbomen zijn gastheer voor duizenden organismen. Phloeophagy, het voeden op floëem weefsels van de bast, is een gewoonte meestal geassocieerd met schors kevers, woodborers, en diverse andere ongewervelde en microbiële taxa die leven binnen de bomen ²³ Bastkevers. (Coleoptera: Curculionidae) te ontwikkelen en te leven binnen floëem behalve voor korte periodes waarin volwassenen op zoek naar nieuwe gastheer bomen. ³¹ Bastkevers zijn uitgebreid bestudeerd door hun economische effecten op bomen ^18,19, maar directe gedragsobservaties van de insecten binnen boom materialen zijn beperkt. ⁴ Bovendien, de galerijen gebouwd door schorskevers geworden habitat voor een groot aantal diersoorten. ¹¹ Grote aantallen schimmels ^30, bacteriën ^3, mijten ^10,21, en ​​nematoden ^16,19 samen met andere roofzuchtige en parasitaire geleedpotigen ^22,24 bewonen het floëem materiaal. De technieken die hierzorgen voor directe observatie van de schors kevers, mijten, en houtboorders die typisch leven in subcorticale omgevingen. Kleine veranderingen in protocol kan worden gemaakt schimmels en bacteriën te bestuderen.

Schorskevers en bijbehorende organismen in boom weefsels zijn onderzocht met behulp van een "floëem sandwich." Vroege toepassing van deze techniek is te vinden in de literatuur dateert uit 1933, toen het werd gebruikt om de larvale stadia van de Douglas-spar kever observeren (Dendroctonus pseudotsugae). ² De floëem sandwich is gegaan door vele afleidingen zoals verschillende materialen beschikbaar kwamen. Oorspronkelijk dit apparaat bestond uit een stuk floëem geplaatst tussen twee glasplaten, samengedrukt door elastiekjes. ² later klemmen, plakband, lijm, kunststof en andere materialen gebruikt bij de constructie van de sandwich. ^{13,14 , 15,17,26,28} Het hier beschreven protocol biedt verbeteringen ten opzichte van een aantal van de laatste ontwerpen. Bijvoorbeeld, inVroeger testsoort werden in de zijkant van de sandwich tussen de platen van glas of plastic ingevoerd. Dit beperkt de bouw van galerijen naar een richting. Het gebruik van binnenkomst gaten in de bovenplaat zorgt voor een grotere vrijheid voor de test soorten die de natuurlijke galerij bouw te starten. Een ander voordeel van het gepresenteerde protocol is zijn vereenvoudigd ontwerp, dat gemakkelijk kan worden vervaardigd met weinig hulpmiddelen. Het gebruik van het floëem sandwich heeft het mogelijk gemaakt voor de directe waarneming van eetgedrag, de voortplanting, de ontwikkeling, en de interacties van organismen die anders niet mogelijk zijn geweest. ^{1,5, 22} Deze methode is ook een uitstekend hulpmiddel voor K-12 onderwijs en wetenschap programma's en displays.

Er zijn verschillende subtiliteiten in de oprichting van een floëem sandwich die moeilijk te interpreteren vanuit of niet gemeld in manuscripten zijn. Wij geloven dat een visuele (bijvoorbeeld, video) beschrijving van de productie van een floëem sandwich noodzakelijk en zouvan waarde zijn voor wetenschappers en opvoeders geïnteresseerd in het bestuderen phloeophagous organismen. Ons protocol een eenvoudige en goedkope manier om geleedpotigen, microben en andere organismen die floëem weefsels bewonen observeren.

Protocol

1. Floëem Selectie- en Verwijdering van de Boom

1. Kies een boom met bijzondere kenmerken. Verzamel floëem van dennen (dwz, bomen in het geslacht Pinus), omdat ze hebben een kenmerkende floëem laag die is enkele millimeters dik. ^18,27 Zodra een boom ligt dat enkele lagere takken heeft, inspecteren voor enige andere gebreken zoals insecten aanvallen en / of pathogenen. U kunt ook gebruik maken van floëem van andere coniferen, zoals sparren in floëem sandwiches. ⁹ Overige bomen soorten kunnen geschikt zijn voor floëem verwijdering zoals hardhout.
   OPMERKING: Naald bomen met grote kronen hebben meestal de dikste floëemweefsel. Om de hoeveelheid floëem te maximaliseren, is het het beste om bomen die enkele gebreken en takken op de stam (stam) hebben gesneden. Pine soorten die best zelf-snoeiwerk zijn. Floëem typisch dikste tijdens het groeiseizoen en dikker hoger de romp dan nabij de grond. Floëem is soms moeilijk om remove van bomen tijdens de herfst of winter seizoenen.
2. Snijd een boom naar beneden of gebruik onlangs gesneden logs om floëemweefsel verkrijgen. Kies een dalende richting die schade aan de boom en in de buurt bomen zal minimaliseren. Cut vertakt de stam om gemakkelijker toegang te blaffen materialen tijdens floëem kunnen blijven zitten.
3. Zodra een boom wordt gesneden (geveld; laten vallen op de grond) begint het schrapen van de bast van de stam met een scherp mes gelijkspel (Fig 1A.). Schraap een gebied van de bast totdat het floëem laag wordt bereikt.
   OPMERKING: De floëem laag is typisch lichter van kleur (bijvoorbeeld crème kleur) en vochtig, terwijl de buitenste schors droger en donkerder (figuur 1B.). Wees extra voorzichtig het floëem niet te schrapen. Het gebied van de schors afgeschraapt afhankelijk van de grootte van het floëem stuk (s) nodig.
4. Nadat de bast is verwijderd, snijd een schets van het floëem stuk met een scherp mes. Controleer het mes snijdt helemaal naar het xyleem (fig. 2A).
5. Om het floëem te verwijderen, te beginnen bij een hoek van het floëem stuk met behulp van de vingers om voorzichtig afpellen het floëem. Gebruik een mes om te helpen bij het schrapen het floëem van de houtvaten. Trek net het floëem uit tot het hele stuk wordt verwijderd.
   OPMERKING: Floëem pelt meestal af van de boom makkelijkste in de zomer. Voor floëem dat is bijzonder moeilijk te verwijderen is, kan een spatel-vormige hulpmiddel te helpen bij de inspanning.
6. Plaats het floëem stuk onmiddellijk in een steriele zak. Voor het beste resultaat, vacuum sluit de zak (Fig. 2B) of, bij gebruik van ziploc zakken, verwijder alle lucht uit de zak. Dit verhoogt de levensduur van het floëem. Eventueel plaatst u meerdere stukken van floëem in één zak. WINKEL floëem in luchtdichte zakken iets boven het vriespunt (tussen 1 en 10 ° C) om de versheid te behouden.

2. Het creëren van de Floëem Sandwich

1. Snij twee gelijke stukken helder acryl, polycarbonaat, of een dergelijke harde, doorzichtig materiaal (bijvoorbeeld glas) licht grootr dan het stuk van floëem (Fig. 2C). Rond de randen van de acryl te voorkomen dat de hoeken scheurt de Parafilm afdichting. Dit protocol maakt gebruik van een 1/8 in. Dik helder acryl.
   OPMERKING: De grootte van de gesneden stukken afhankelijk van de behoeften van de betreffende organisme en de duur van de studie. Bijvoorbeeld, een paar bastkevers gebruikt 4 ^dm2 van floëem gedurende maanden, maar alleen 1 ^dm2 indien het onderzoek plaatsvindt binnen enkele dagen.
2. Boor een gat in één van de acryl stukken opneming van onderzoek organisme (n) mogelijk. De grootte en aantal gaten afhankelijk van de doelen (Fig. 2D).
3. Voorafgaand aan het plaatsen van het floëem tussen de acryl stukken, steriliseren het acryl oppervlak (met> 70% ethanol) of, bij gebruik van nieuwe acryl, verwijder de beschermende folie.
4. Leg de verse stuk floëem tussen de steriele acryl stukken. Plaats de acrylstuk met het gat (en) op de binnen- of buitenzijde van het floëem, whichever nodig. Typisch gezicht van de buitenzijde van het floëem (kant die schors op het had) naar de ingang gaten.

3. Het afdichten van de Floëem Sandwich

1. Een tijdelijke afdichting rond het floëem sandwich maken gebruik 2 in. Parafilm brede stroken getrokken rond de randen van het floëem sandwich (fig. 2C). Als alternatief gebruikt een polyvinylideenchloride wikkel om de randen te verzegelen. ⁶ Plaats vervolgens een klem aan beide zijden van de sandwich acryl aan het floëem knijpen. Zorg ervoor dat het gehele oppervlak is geklemd omlaag om de lucht ruimte tussen de acryl en floëem (Fig 2C) te voorkomen. Als dit niet goed geklemd, kan exemplaren tussen de acryl en floëem bewegen.
2. Het creëren van een semi-permanente afdichting toe een niet-lijmen of epoxy vaseline rond het floëem. Zorg ervoor dat het materiaal volledig omringt het floëem. Vervolgens gebruikt klemmen of schroeven met moeren (kan nodig zijn om gaten te boren van tevoren) om de acryl strak om het floëem te houden.De broodjes alleen levensvatbaar blijven tot één of twee maanden.
3. Afhankelijk van de zuurstofbehoefte van de studie organismen, voeg een luchtfilter op één of meer zijden van de sandwich. Dit zal de lucht in het floëem sandwich aan te gaan, maar te beperken waterverlies uit het floëem. We gebruiken eenvoudige koolstoffilters dat het risico van schimmel en bacteriële verontreiniging te verminderen.
4. Voor studie exemplaren die in- en uitstappen op wil vereisen, vervangt een van de acryl-stukken met hout of soortgelijk materiaal dat een insect kan boren zich in. Dit is bijzonder belangrijk voor de waarneming van houtboorders, want na larvale staat het floëem laag is voltooid, dan droegen ze in het xyleem.
5. Om proefpersonen verhinderen de toegang gaten verlaten, plaatst kleine petrischalen (of andere objecten, tape) over de gaten, het blokkeren ontsnappen. Sinds organismen die in deze ruimten bevinden zijn wennen aan lage lichtniveaus, kan het nodig zijn om de broodjes te plaatsen in een donkere kamer of een doos, of plaats oPaque materiaal op de top aan het licht af.

4. Observeren Organismen in het floëem Sandwich

1. Introduceren studie specimens in ingangsgat van het floëem sandwich (Fig. 2D). Observeer exemplaren met behulp van een dissectie microscoop onder een rood licht of wit licht instellen op een lage stand (fig. 2E).
2. Om de activiteiten of de groei van specimens in de floëem sandwich neem een ​​camera of video camera aan de microscoop te bevestigen. Bevestig speciale videocamera's om de microscoop oculair (Fig. 2E & F). Voor zeer kleine organismen zoals mijten, nematoden, en pseudo-schorpioenen, gebruik dan een high definition video camera op de microscoop.
3. Om geluiden op te nemen, plaatst microfoons in het gat van de vermelding van het floëem sandwich of via de zijkant van het floëem sandwich. Omdat de ingang gat klein is, gebruik dan een kleine microfoon, zoals een electret condensator microfoon.
4. Om op te nemen vanaf de kant of het vlak vanhet floëem sandwich gebruiken een piëzo-element (fig. 3B). Om het geluid weer, maken gebruik van dezelfde piëzo-element of bevestig een tactiele transducer (Excitor) aan het oppervlak van de bovenkant of onderkant van de acryl.

Resultaten

De hierboven beschreven protocol zal een onderzoeker in staat stellen om organismen die in de cryptische milieu onder de schors van een boom leven te observeren. Om het gebruik van deze techniek beschrijven we een representatief onderzoek van ons laboratorium dat deze techniek. ¹² In dit experiment gebruikt illustreren, werden floëem sandwiches gebruikt om de effecten van akoestische behandelingen voortplantingsresultaat, tunneling afstand en overleving schors kevers zien (Fig . 2E en 2F). Directe observatie van kevers, mogelijk gemaakt door het gebruik van een sandwich floëem, onthulde een aantal interessante bevindingen. Ten eerste hebben we opgenomen dagelijkse tunneling afstanden door het markeren van de locatie van de kevers 'op de acryl met een marker elke 24h. Dit proces bleek echter belangrijke verschillen tussen geluid behandelingen die zou zijn verborgen, zonder het floëem sandwich. Vervolgens zagen we een verlaging van eierproductie bijzonder geluid behandelingen. Het mobiele karakter van het floëem sandwich toegestaan ​​voor egg waarnemingen onder een dissectie microscoop worden afgerond zonder verstoring van de kevers. Tijdens deze observaties, we gevangen kever eierleggende gedrag met een high-definition camera bevestigd aan de microscoop. Andere opmerkelijke waarnemingen waren de doden van stuurlieden en de inleiding van de vlucht in verband met bijzondere akoestische behandelingen. Het floëem sandwich assay was cruciaal voor onze studie van schorskever reacties op akoestische behandelingen. Deze ontdekkingen, die onmogelijk waar te nemen onder de schors van een boom zou zijn, zijn waardevolle bijdragen aan de ontwikkeling van het management opties voor het bestrijden van schorskever uitbraken.

Figuur 1. A) Hulpmiddelen die nodig zijn om de schors van boom verwijderen. Artikelen 1 en 2 zijn gelijkspel messen gebruikt om bast afschrapen van de boom. Artikelen 3 (bijl) en 4 (pull saw) zijn nuttig om takken te verwijderenin de buurt van het scheren gebied. B) Gebruik van draw mes om schors van boom verwijderen. Let op de lichte kleur van het floëem onder de roodachtige schors.

Figuur 2. A) Verwijdering van floëem na schors werd afgeschraapt van boom. B) Verse floëem opgeslagen in vacuüm verzegelde tas. C) Floëem sandwich met klemmen die de acryl stukken samen en Parafilm rond randen om verontreiniging en verdroging van floëem voorkomen. D ) Bark kever dichtbij gat geboord in acryl. E) met behulp van microscoop tot floëem sandwich observeren. F) Video weergave van de schors kevers binnen floëem sandwich.

Figuur 3. A) Pheromone overname van kevers in floëem sandwich. De lucht wordt via buisjes met Super-Q absorberend. B) opnemen en afspelen van geluid via een piëzo-elektrische transducer (midden van de foto) om te mountain pine kevers binnen floëem sandwich wordt getrokken.

Discussie

Het floëem sandwich maakt de invoering en observatie van geleedpotigen, microben en andere kleine organismen die floëem weefsels bewonen. ^{1,7,8,9,17,18} Deze techniek heeft geleid tot nieuwe ontdekkingen en een beter begrip van gedrag, leven- history kenmerken, de ontwikkeling, en de interacties van organismen in boom floëem. ^1,5,10 De sandwich protocol hier beschreven is een hybride van verleden ontwerpen, en zal een economische sandwich die gemakkelijk is gebouwd met een minimale uitrusting en materialen. Het glas, acryl, polycarbonaat of stukken kunnen worden hergebruikt, en de enige verbruiksmaterialen de Parafilm en floëem.

Hoewel alle stappen in het protocol zijn belangrijk, moeten bepaalde stappen strikt worden opgevolgd om de hoogste mate van succes te verzekeren. Ten eerste moet een boom worden geplaatst dat een deel van de stam vrij, of relatief vrij van takken heeft. Bomen die veel takken hebben, zijn moeilijk te scheren en wil yield weinige levensvatbare floëem stukken, zoals elke tak rond moet worden gesneden bij het verwijderen van het floëem. Vervolgens is het belangrijk blootstelling lucht van het floëem minimaliseren. We plaatsen snel elke floëem stuk in een zak bij verwijdering. Zodra 5:57 stukken zijn verwijderd, worden deze overgebracht in een vacuüm zak; we maken gebruik van een omvormer om de sealer vandoor accu van een voertuig in het veld. Last, ontsmetten de acryl stukken en de algemene netheid bij de uitvoering van dit protocol zal schimmelgroei in de sandwich te verminderen. Dit is vooral belangrijk voor uitgebreide observaties.

Zoals hierboven vermeld, zijn er beperkingen van het floëem sandwich inrichting. Aangezien het floëem dun is, kan slechts kleine organismen die gewoonlijk in het bastweefsel nog worden ingebracht in de sandwich. Grotere insecten zoals hout boren (dwz Buprestid, Cerambycid species) kunnen worden ingevoerd en gecontroleerd op het begin van hun levenscyclus. Dit tijdsbestek is meestal beperkt tot twee totdrie weken; na dit punt de larven vereisen xylem hout te boren in voor de verpopping. In contrast, voor schorskevers, vooral die in het geslacht Ips, een volledige levenscyclus kan worden waargenomen, waaronder de paring, ei uitbroeden, voeden, pupating en verpopping tot een volwassen kever. Op dit punt wordt de levensvatbaarheid van de sandwich meestal uitgeput als gevolg van verdroging en schimmelgroei. ²⁸ Bovendien wordt dit apparaat niet toe insecten te vrij en natuurlijk te koloniseren of verlaat het floëem sandwich. ²⁷

Ons protocol is flexibel in termen van grootte, vorm en het type van floëem gebruikt. Korte studies vereisen minder floëem materiaal en sandwich grootte kan dienovereenkomstig worden aangepast. Veel naaldbomen zijn gebruikt als floëem donoren in een floëem sandwich (bijv ponderosapijnboom ^12, Douglas-spar ^2, sparren ^29, loblolly grenen ^27, longleaf grenen ^27). Materialen in de sandwich kan worden gewijzigd; exruim, glasplaten gebruikt worden in plaats van acryl- en epoxy of tape in plaats van Parafilm.

Het moeilijkste deel van dit protocol is het floëem verwijdering proces. Bomen naast elkaar kunnen verschillen hoe moeilijk het floëem te verwijderen. Wanneer een boom heeft moeilijke floëem, geduld is kritiek. In deze gevallen nauwkeurig uitvoeren van een mes tussen de harde xyleem en floëem het sponsachtige. Dit proces voelt letterlijk als het villen van de boom.

Na het beheersen van de basis-sandwich-techniek, kan wijzigingen in het protocol te helpen fit specifieke behoeften. Bijvoorbeeld door honen technieken nodig floëem verwijderen grotere stukken kunnen worden verwijderd en gebruikt om grotere sandwiches maken. Ook kunnen wijzigingen worden aangebracht in specifieke instrumenten, bijvoorbeeld, extra gaten aan chemische uitstoot (Fig. 3A), of opnemen of afspelen geluiden (Fig. 3B) monitor tegemoet. Modificaties kunnen worden gemaakt om semi-permanente instandhouding van het floëem en orgelismen, of voor tijdelijke waarnemingen van organismen die later kan worden verhuurd gratis.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Draw blade	Big Horn Brand	20265	11” blade
Fillet Knife	American Angler	30530	9” blade
Polycarbonate	Nexan	GE-33	0.093 in. thickness
Parafilm M	Fisher Scientific	S37441	2” wide
Clamps	Pony Jaw Opening	3201-HT-K	4” x 1”
Vacuum Sealer  en zakjes	FoodSaver	V2840; FSFSBF0742-015	VacLoc vacuum  zakjes in rollen