Methodenartikel

Gelijktijdige elektrofysiologisch registratie en calciumbeeldvorming van neuronen in de suprachiasmatische kern

DOI:

10.3791/50794

⸱

8 december 2013

 , 
1Center for Research on Occupational and Environmental Toxicology, Oregon Health & Science University, 2Department of Behavioral Neuroscience, Oregon Health & Science University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedures worden beschreven om gelijktijdige opnamen van membraanpotentiaal of stroom en veranderingen in intracellulaire calciumconcentratie uit te voeren. Suprachiasmatische nucleus-neuronen worden gevuld met de calciumindicator bis-fura-2 met behulp van een patch clamp-elektrode in de whole cell patch clamp-configuratie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gelijktijdige elektrofysiologische en fluorescerende beeldvormingsmethoden werden gebruikt om de rol van veranderingen in membraanpotentiaal of stroom in het reguleren van de intracellulaire calciumconcentratie te bestuderen. Veranderende omgevingsomstandigheden, zoals de licht-donkercyclus, kunnen neuronale en neurale netwerkactiviteit en de expressie van een familie van circadiane klokgenen binnen de suprachiasmatische kern (SCN), de locatie van de master circadiane klok in de zoogdierhersenen, aanpassen. Excitatorische synaptische transmissie leidt tot een toename van de post-synaptische Ca2+-concentratie waarvan wordt aangenomen dat deze de signaalroutes activeert die de ritmische expressie van circadiane klokgenen verschuiven. Hypothalamische plakjes die de SCN bevatten, werden patch-clamped met behulp van micro-elektroden gevuld met een interne oplossing die de calciumindicator bis-fura-2 bevat. Nadat er een verzegeling was gevormd tussen de micro-elektrode en de neuronale membraan van de SCN, werd het membraan verbroken met behulp van zachte zuiging en diffuseerde de calciumprobe in de neuronen waarbij zowel het soma als de dendrieten werden gevuld. Kwantitatieve ratiometrische metingen van de intracellulaire calciumconcentratie werden gelijktijdig opgenomen met het membraanpotentiaal of de stroom. Met behulp van deze methoden is het mogelijk om de rol van veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie, geproduceerd door synaptische activiteit en actiepotentiaalvuren van individuele neuronen, te bestuderen. In deze presentatie demonstreren we de methoden om gelijktijdig elektrofysiologische activiteit samen met intracellulair calcium op te nemen van individuele SCN-neuronen die worden behouden in hersensneden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veranderingen in genexpressie zijn bekend als ze optreden in neuronen als gevolg van synaptische signalering. Signalering door het excitatoire neurotransmitter glutamaat kan het neuronale membraanpotentiaal depolariseren, wat uiteindelijk leidt tot gentranscriptie en translatie1,2. Activering van ionotropische receptoren door glutamaat laat extracellulaire calciumionen de cel binnen, wat wordt gedacht een kritische rol te spelen als tweede boodschapper bij het activeren van gentranscriptie. Het evalueren van de relatie tussen membraan elektrische activiteit, zoals de frequentie van actiepotentiaalvuren, en veranderingen in intracellulaire calciumconcentratie vereist de combinatie van twee methoden - gehele cel patch clampen en kwantitatief beeldvorming van fluorescente calcium proben3-5, wat het mogelijk maakt om de relatie te bestuderen in individuele neuronen. De enkelcel opnametechniek maakt het mogelijk om de activiteit van individuele neuronen op identificeerbare delen van de hersenen op te nemen. De gehele cel opnametechniek maakt het mogelijk om het membraanvoltage of de stroom te controleren, wat experimentele manipulatie van specifieke ionisatorkanaalstromen mogelijk maakt. Het gebruik van micropipetten gevuld met fluorescente calcium proben zorgt er ook voor dat de neuron goed gevuld is met calcium sonde. Deze techniek heeft een duidelijk voordeel bij het werken met hersenslice preparaten van volwassen slice preparaten, omdat deze neuronen bijzonder moeilijk te laden zijn met de meer gebruikelijke cell permeante proben en reduceert potentiële achtergrondfluorescentie problemen6-8.

Licht is de belangrijkste manier waarop zoogdieren hun circadiane klok aanpassen, die zich bevindt in de suprachiasmatische kern (SCN) van de hypothalamus. Lichtinformatie die in het netvlies wordt getransduceerd, wordt overgebracht 9-11 via de retinohypothalamische tractus (RHT) waar glutamaat wordt vrijgegeven in de SCN12,13. Glutamaat opent NMDA en AMPA ionotropische receptoren op SCN neuronen waardoor een influx van calcium en natrium ontstaat, en een intracellulaire signaleringskaskade wordt geïnitieerd die uiteindelijk leidt tot het veranderen van de expressie van een familie van klokgenen14-17 en faseverschuivingen van de circadiane klok18-20. Calcium kan echter neuronen binnentreden via ionotropische glutamaatreceptoren of door membraandepolarisatie en activering van spanningsafhankelijke calciumkanalen (VDCC)21. Daarom hebben we een experimenteel protocol ontwikkeld om de relatie tussen de intracellulaire calciumconcentratie en membraan elektrische activiteit in SCN neuronen te onderzoeken, zoals optreedt bij actiepotentiaalvuren en synaptische input22.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparatie van hypothalamus hersensneden

  1. Verkrijg vooraf goedkeuring van de Institutionele Commissie voor Dierenwelzijn en -gebruik (IACUC) voor alle procedures waarbij dieren betrokken zijn. De hier beschreven dierprocedures zijn in overeenstemming met de AVMA Richtlijnen voor het Euthanaseren van Dieren 2013 en werden vooraf goedgekeurd door de IACUC van de Oregon Health & Science University.
  2. Bereid 500 ml van de snijbuffer zonder de MgCl2 en CaCl2 voor (Tabel 1). Belucht de oplossing met 95% O2 en 5% CO2 op kamertemperatuur en voeg dan de MgCl2 en CaCl2 toe terwijl je blijft beluchten. Pas de osmolariteit aan op 300 mOsm met sucrose. De osmolariteit wordt gemeten met een dampdrukosmometer.
  3. Bereid 1 L van het opnamemedium zonder de MgCl2 en CaCl2 voor (Tabel 2). Belucht de oplossing met 95% O2 en 5% CO2 en voeg dan de MgCl2 en CaCl2 toe terwijl je blijft beluchten. Pas de pH aan op 7,2-7,4 met NaOH (10 N) en de osmolariteit op 300 mOsm met sucrose. De toevoeging van HEPES-buffer is optioneel en werd gebruikt om de pH verder te stabiliseren.
  4. De snij- en opnameoplossingen kunnen enkele dagen in de koelkast worden bewaard voor gebruik.
  5. Bereid 3% agarose voor en giet deze in een steriele petrischaal (6 mm diep) en plaats in de koelkast.
  6. Snijd drie blokjes agarose van ongeveer 6 mm x 6 mm x 6 mm.
  7. Anesthesiseer een vier tot acht weken oude Sprague-Dawley-rat diep met isofluraange. Test de diepte van de anesthesie. De diepte van de anesthesie wordt als passend beschouwd wanneer er geen onttrekkingsreflex van de achterpoot is na het knijpen in de voetzool. Eenmaal goed verdoofd, wordt de rat geëuthanaseerd door snelle onthoofding. 
  8. Verwijder snel de hersenen, wees voorzichtig om de oogzenuwen eerst door te snijden, en plaats in ijskoude snijoplossing verzadigd met 5% CO2 en 95% O2 en laat 2-3 minuten afkoelen.
  9. Trim de hersenen. Plaats de hersenen met behulp van een pincet op een bevochtigd (met snijoplossing) rond filterpapier dat op een glazen petrischaal op ijs ligt.
  10. Snijd de hersenen coronaal om de resterende kleine hersenen en hersenstam te verwijderen, vervolgens de rostrale cortex en de zijden, om een blok hersenen over te houden dat de hypothalamus bevat, waarbij de zijde met SCN, oogzenuwen en optische chiasma zorgvuldig wordt bewaard.
  11. Spreid een dunne laag cyanoacrylaatlijm uit die groot genoeg is om de hersenen en agaroseblokken in een ijskoude maar droge microtoom-snijkamer te bevestigen.
  12. Breng het ijskoude hersenblok met de caudale zijde naar beneden op de lijm met de zijde die het SCN bevat, gepositioneerd om als eerste te snijden met de oogzenuwen die een 'V' vormen die omhoog wijst.
  13. Plaats de agaroseblokken op de andere 3 zijden. Vul de kamer met ijskoude snijbuffer die continu wordt beluucht met 5% CO2 en 95% O2. De cyanoacrylaatlijm zal drogen met vocht en de hersenen en agaroseblokken op hun plaats houden.
  14. Snijd coronale hypothalamussneden (220-250 µm dik) met de SCN met de vibrerende mesmicrotoom. Typisch wordt een snede gekozen waar de optische chiasma ongeveer 2-4 mm breed is, die eruitziet als een witte band met SCN net dorssaal verschijnend als twee kleine 'uitsparingen' in de optische chiasma aan weerszijden van de 3rd ventrikel (Figuur 1A).
  15. Plaats de sneden in de opnamekamer (36 °C) gemonteerd op het podium van een Leica DMLFS microscoop. De kamer is gevuld met continu stromende opnameoplossing (2 ml/min) beluucht met 95% O2 en 5% CO2 en voorverwarmd met een inlijnverwarming.
  16. Voer gehele-cel patch clamp en calcium beeldvorming opnames uit in SCN neuronen 0,5-8 uur na bereiding van de snede.

2. Patch Clamp Opname

  1. Bereid de elektrodeoplossing (intracellulair) oplossing in de helft van het totale eindvolume water.
  2. Pas de oplossing aan op pH 7,3 met KOH (1 N).
  3. Voeg de resterende water toe. De uiteindelijke osmolariteit van de oplossing moet in het bereik van 280-290 mOsm zijn.
  4. Leid de elektrodeoplossing door een 0,2 µm filter, verdeel in aliquots (0,5 ml) in microfugebuisjes, en bewaar bij -20 °C.
  5. Bereid de calciumsonde bis-fura-2 hexakaliumzout stockoplossing (10 mM) door 1 mg bis-fura-2 hexakaliumzout te mengen met 99,29 µl van 0,2 µm gefilterd water.
  6. Verdeel in aparte buisjes (2-5 µl elk) en bevries (-20 °C).
  7. Ontdooi een aliquot van interne oplossing en de Ca2+ sonde kort voor gebruik. Voeg 2 µl van de bis-fura-2 stockoplossing toe aan 400 µl van de interne oplossing voor een uiteindelijke calciumsondeconcentratie van 50 µM. Schurt kort om de oplossingen te mengen. De calciumsondeconcentratie (10-250 µM) varieert afhankelijk van het experimentele ontwerp en beeldvormingssysteem. Merk op dat bis-fura-2 bestaat uit twee aan elkaar gekoppelde fura-2 moleculen.
  8. Trek gehele-cel patch

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van hersenslices van de hypothalamus hebben we tegelijkertijd veranderingen in intracellulair calcium geregistreerd in de whole cell-modus onder zowel voltage- als stroomklemcondities. De micro-elektrode getoond in Figuur 1A wordt onder hoge vergroting (40X of 63X UV objectieven) met een kleine hoeveelheid toegepaste positieve druk in positie gebracht. Na het aanraken van de neuron wordt een gigaohm-seal gevormd met zachte zuiging. In voltage-clamp-modus na het instellen van het celmembraanpot...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hierboven beschreven methoden bieden een krachtige tool om gelijktijdig de link tussen elektrische activiteit van neuronmembranen en de intracellulaire calciumconcentratie op te nemen. De methode heeft een aantal sterke punten omdat het twee zeer goed gekarakteriseerde methoden combineert - whole cell patch clamp opname en meting van intracellulair calcium met behulp van fluorescerende kleurstoffen. Onze aanpak is vergelijkbaar met die beschreven door andere onderzoekers6,23.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk werd gefinancierd door een subsidie van het National Institute of General Medical Sciences (GM096972).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
NaClFisher Scientific Co.S271-3
KClFisher Scientific Co.P217-500
NaH2PO4•H2OSigma Chemical Co.S-9638
MgCl2•6H2OFisher Scientific Co.M33-500
CaCl2•2H2OFisher Scientific Co.C79-500
D-glucoseFisher Scientific Co.D16-500
NaHCO3Fisher Scientific Co.S233-500
SucroseFisher Scientific Co.S5-500
Potassium D-gluconateSigma-AldrichG4500
HEPESSigma-AldrichH4034
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrateSigma-AldrichA8937
Guanosine 5′-triphosphate tris saltSigma-AldrichG9002
Agarose (ultrapure)Life Technologies15510-027Gel pored into sterile Petri dish 6 mm thick layer
KOHSigma-AldrichP-6310
NaOHSigma-AldrichS-5881
Bis-fura-2, hexapotassium saltInvitrogenB6810Cell impermeant
Naam van apparatuurBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
MicrotoomLeicaVT1000SWeefselsnijden
Cyanoacrylaatlijm (Roti-Coll1)Carl Roth GmbH+CoArt-Nr. 0258.1
Micro-elektrode-trekkerNarshige International USAPP-83
Micro-elektrode capillaire buizenWorld Precision Instruments1B150F-4
Microfil 34 gWorld Precision InstrumentsMF34G-5
SpuitfilterCorning#431212
MicroscoopLeicaDM LFSMet 4X, 40X UV en 63X UV objectieven, en epifluorescentie
CCD-cameraHamamatsuORCA ER12 bit CCD
Fura-2 Filter CubeChroma71500ASet met UG11 filter
Polychrome IVTill Photonics GmBHMonochroom
Ultraviolet blokkerende veiligheidsbrilUltra-Violet Products
EPC-9 versterkerHEKA Elektronik
MetafluorMolecular DevicesBeeldverwerkingssoftware
PatchmasterHEKA ElektronikDataverzamelingsoftware
Igor versie 6WavemetricsElektrofysiologie & Ca2+ Data Analyse
VAPRO 5520WestcorVapor pressure osmolmeter

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bading, H., Ginty, D. D., Greenberg, M. E. Regulation of gene expression in hippocampal neurons by distinct calcium signaling pathways. Science. 260, 181-186 (1993).
  2. Ghosh, A., Ginty, D. D., Bading, H., Greenberg, M. E. Calcium regulation of gene expression in neuronal cells. J. Neurobiol. 25, 294-303 (1994).
  3. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
  4. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).
  5. Higley, M. J., Sabatini, B. L. Calcium signaling in dendrites and spines: practical and functional considerations. Neuron. 59, 902-913 (2008).
  6. Colwell, C. S. Circadian modulation of calcium levels in cells in the suprachiasmatic nucleus. Eur. J. Neurosci. 12, 571-576 (2000).
  7. Ikeda, M., Yoshioka, T., Allen, C. N. Developmental and circadian changes in Ca2+ mobilization mediated by GABAA and NMDA receptors in the suprachiasmatic nucleus. Eur. J. Neurosci. 17, 58-70 (2003).
  8. Irwin, R. P., Allen, C. N. GABAergic signaling induces divergent neuronal Ca2+ responses in the suprachiasmatic nucleus network. Eur. J. Neurosci. 30, 1462-1475 (2009).
  9. Berson, D. M., Dunn, F. A., Takao, M. Phototransduction by retinal ganglion cells that set the circadian clock. Science. 295, 1070-1073 (2002).
  10. Hattar, S., Liao, H. W., Takao, M., Berson, D. M., Yau, K. W. Melanopsin-containing retinal ganglion cells: architecture, projections, and intrinsic photosensitivity. Science. 295, 1065-1070 (2002).
  11. Hartwick, A. T., et al. Light-Evoked Calcium Responses of Isolated Melanopsin-Expressing Retinal Ganglion Cells. J. Neurosci. 27, 13468-13480 (2007).
  12. Castel, M., Belenky, M., Cohen, S., Ottersen, O. P., Storm-Mathisen, J. Glutamate-like immunoreactivity in retinal terminals of the mouse suprachiasmatic nucleus. Eur. J. Neurosci. 5, 368-381 (1993).
  13. Card, J. P., Moore, R. Y. The organization of visual circuits influencing the circadian activity of the suprachiasmatic nucleus. In Suprachiasmatic Nucleus - The Mind's Clock. Reppert, S. M., Klein, D. C., Moore, R. Y. , Oxford University Press. Oxford. 51-76 (1991).
  14. Shigeyoshi, Y., et al. Light-induced resetting of a mammalian circadian clock is associated with rapid induction of the mPer1 transcript. Cell. 91, 1043-1053 (1997).
  15. Albrecht, U., Sun, Z. S., Eichele, G., Lee, C. C. A differential response of two putative mammalian circadian regulators, mper1 and mper2, to light. Cell. 91, 1055-1064 (1997).
  16. Yan, L., Silver, R. Differential induction and localization of mPer1 and mPer2 during advancing and delaying phase shifts. Eur. J. Neurosci. 16, 1531-1540 (2002).
  17. Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. Genetics of the mammalian circadian system: Photic entrainment, circadian pacemaker mechanisms, and posttranslational regulation. Annu. Rev. Genet. 34, 533-562 (2000).
  18. Ding, J. M., et al. Resetting the biological clock: Mediation of nocturnal circadian shifts by glutamate and NO. Science. 266, 1713-1717 (1994).
  19. Ding, J. M., Fairman, L. E., Hurst, W. J., Kuriashkina, L. R., Gillette, M. U. Resetting the biological clock: mediation of nocturnal CREB phosphorylation via light, glutamate, and nitric oxide. J. Neurosci. 17, 667-675 (1997).
  20. Ding, J. M., et al. A neuronal ryanodine receptor mediates light-induced phase delays of the circadian clock. Nature. 394, 381-384 (1998).
  21. Bollmann, J. H., Helmchen, F., Borst, J. G., Sakmann, B. Postsynaptic Ca2+ influx mediated by three different pathways during synaptic transmission at a calyx-type synapse. J. Neurosci. 18, 10409-10419 (1998).
  22. Irwin, R. P., Allen, C. N. Calcium Response to Retinohypothalamic Tract Synaptic Transmission in Suprachiasmatic Nucleus Neurons. J. Neurosci. 27, 11748-11757 (2007).
  23. Smetters, D., Majewska, A., Yuste, R. Detecting action potentials in neuronal populations with calcium imaging. Methods. 18, 215-221 (1999).
  24. Spruston, N., Johnston, D. Perforated patch-clamp analysis of the passive membrane properties of three classes of hippocampal neurons. J. Neurophysiol. 67, 508-528 (1992).
  25. Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J. Gen. Physiol. 92, 145-159 (1988).
  26. Marty, A., Neher, E. Tight-seal whole-cell recording. Single-channel recording. Sakmann, B., Neher, E. 2, Plenum Press. New York. 31-52 (1995).
  27. Sarantopoulos, C., McCallum, J. B., Kwok, W. M., Hogan, Q. Beta-escin diminishes voltage-gated calcium current rundown in perforated patch-clamp recordings from rat primary afferent neurons. J. Neurosci. Methods. 139, 61-68 (2004).
  28. Hatae, J., Fujishiro, N., Kawata, H. Spectroscopic properties of fluorescence dye fura-2 with various divalent cations. Jap. J. Physiol. 46, 423-429 (1996).
  29. Poenie, M. Alteration of intracellular Fura-2 fluorescence by viscosity: a simple correction. Cell Calcium. 11, 85-91 (1990).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

PatchclampenBis fura 2membraanpotentiaalintracellulair calciumfluorescente probepreparatie van hersensectiessimultane registratie

Gerelateerde artikelen