Procedures worden beschreven om gelijktijdige opnamen van membraanpotentiaal of stroom en veranderingen in intracellulaire calciumconcentratie uit te voeren. Suprachiasmatische nucleus-neuronen worden gevuld met de calciumindicator bis-fura-2 met behulp van een patch clamp-elektrode in de whole cell patch clamp-configuratie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gelijktijdige elektrofysiologisch registratie en calciumbeeldvorming van neuronen in de suprachiasmatische kern
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Gelijktijdige elektrofysiologische en fluorescerende beeldvormingsmethoden werden gebruikt om de rol van veranderingen in membraanpotentiaal of stroom in het reguleren van de intracellulaire calciumconcentratie te bestuderen. Veranderende omgevingsomstandigheden, zoals de licht-donkercyclus, kunnen neuronale en neurale netwerkactiviteit en de expressie van een familie van circadiane klokgenen binnen de suprachiasmatische kern (SCN), de locatie van de master circadiane klok in de zoogdierhersenen, aanpassen. Excitatorische synaptische transmissie leidt tot een toename van de post-synaptische Ca2+-concentratie waarvan wordt aangenomen dat deze de signaalroutes activeert die de ritmische expressie van circadiane klokgenen verschuiven. Hypothalamische plakjes die de SCN bevatten, werden patch-clamped met behulp van micro-elektroden gevuld met een interne oplossing die de calciumindicator bis-fura-2 bevat. Nadat er een verzegeling was gevormd tussen de micro-elektrode en de neuronale membraan van de SCN, werd het membraan verbroken met behulp van zachte zuiging en diffuseerde de calciumprobe in de neuronen waarbij zowel het soma als de dendrieten werden gevuld. Kwantitatieve ratiometrische metingen van de intracellulaire calciumconcentratie werden gelijktijdig opgenomen met het membraanpotentiaal of de stroom. Met behulp van deze methoden is het mogelijk om de rol van veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie, geproduceerd door synaptische activiteit en actiepotentiaalvuren van individuele neuronen, te bestuderen. In deze presentatie demonstreren we de methoden om gelijktijdig elektrofysiologische activiteit samen met intracellulair calcium op te nemen van individuele SCN-neuronen die worden behouden in hersensneden.
Inleiding
Veranderingen in genexpressie zijn bekend als ze optreden in neuronen als gevolg van synaptische signalering. Signalering door het excitatoire neurotransmitter glutamaat kan het neuronale membraanpotentiaal depolariseren, wat uiteindelijk leidt tot gentranscriptie en translatie1,2. Activering van ionotropische receptoren door glutamaat laat extracellulaire calciumionen de cel binnen, wat wordt gedacht een kritische rol te spelen als tweede boodschapper bij het activeren van gentranscriptie. Het evalueren van de relatie tussen membraan elektrische activiteit, zoals de frequentie van actiepotentiaalvuren, en veranderingen in intracellulaire calciumconcentrati....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Preparatie van hypothalamus hersensneden
- Verkrijg vooraf goedkeuring van de Institutionele Commissie voor Dierenwelzijn en -gebruik (IACUC) voor alle procedures waarbij dieren betrokken zijn. De hier beschreven dierprocedures zijn in overeenstemming met de AVMA Richtlijnen voor het Euthanaseren van Dieren 2013 en werden vooraf goedgekeurd door de IACUC van de Oregon Health & Science University.
- Bereid 500 ml van de snijbuffer zonder de MgCl2 en CaCl2 voor (Tabel 1). Belucht de oplossing met 95% O2 en 5% CO2 op kamertemperatuur en voeg dan de MgCl2 e....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van hypothalamus-hersensecties hebben we gelijktijdig veranderingen in het intracellulaire calcium gemeten in whole-cell modus onder zowel voltage- als current-clamp condities. De micro-elektrode die wordt getoond in Figuur 1A wordt bij hoge vergroting (40X of 63X UV-objectieven) met een kleine hoeveelheid aangebrachte positieve druk in positie gebracht. Na contact met het neuron wordt er door middel van zachte zuiging een gigaohm-seal gevormd. In voltage-clamp modus, nadat het membraanpotenti.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De hierboven beschreven methoden bieden een krachtige tool om gelijktijdig de link tussen elektrische activiteit van neuronmembranen en de intracellulaire calciumconcentratie op te nemen. De methode heeft een aantal sterke punten omdat het twee zeer goed gekarakteriseerde methoden combineert - whole cell patch clamp opname en meting van intracellulair calcium met behulp van fluorescerende kleurstoffen. Onze aanpak is vergelijkbaar met die beschreven door andere onderzoekers6,23.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Het werk werd gefinancierd door een subsidie van het National Institute of General Medical Sciences (GM096972).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| NaCl | Fisher Scientific Co. | S271-3 | |
| KCl | Fisher Scientific Co. | P217-500 | |
| NaH2PO4•H2O | Sigma Chemical Co. | S-9638 | |
| MgCl2•6H2O | Fisher Scientific Co. | M33-500 | |
| CaCl2•2H2O | Fisher Scientific Co. | C79-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific Co. | D16-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific Co. | S233-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific Co. | S5-500 | |
| Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Guanosine 5′-triphosphate tris salt | Sigma-Aldrich | G9002 | |
| Agarose (ultrapure) | Life Technologies | 15510-027 | Gel pored into sterile Petri dish 6 mm thick layer |
| KOH | Sigma-Aldrich | P-6310 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S-5881 | |
| Bis-fura-2, hexapotassium salt | Invitrogen | B6810 | Cell impermeant |
| Naam van apparatuur | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Microtoom | Leica | VT1000S | Weefselsnijden |
| Cyanoacrylaatlijm (Roti-Coll1) | Carl Roth GmbH+Co | Art-Nr. 0258.1 | |
| Micro-elektrode-trekker | Narshige International USA | PP-83 | |
| Micro-elektrode capillaire buizen | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Microfil 34 g | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Spuitfilter | Corning | #431212 | |
| Microscoop | Leica | DM LFS | Met 4X, 40X UV en 63X UV objectieven, en epifluorescentie |
| CCD-camera | Hamamatsu | ORCA ER | 12 bit CCD |
| Fura-2 Filter Cube | Chroma | 71500A | Set met UG11 filter |
| Polychrome IV | Till Photonics GmBH | Monochroom | |
| Ultraviolet blokkerende veiligheidsbril | Ultra-Violet Products | ||
| EPC-9 versterker | HEKA Elektronik | ||
| Metafluor | Molecular Devices | Beeldverwerkingssoftware | |
| Patchmaster | HEKA Elektronik | Dataverzamelingsoftware | |
| Igor versie 6 | Wavemetrics | Elektrofysiologie & Ca2+ Data Analyse | |
| VAPRO 5520 | Westcor | Vapor pressure osmolmeter |
Referenties
- Bading, H., Ginty, D. D., Greenberg, M. E. Regulation of gene expression in hippocampal neurons by distinct calcium signaling pathways. Science. 260, 181-186 (1993).
- Ghosh, A., Ginty, D. D., Bading, H., Greenberg, M. E. Calcium regulation of gene expression in neuronal cells.....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
