Methodenartikel

Afvalwater Afgeleide Elektroactieve Microbiële Biofilms: Groei, Onderhoud en Basis Karakterisering

16.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50800

⸱

29 december 2013

 , 
1Department of Environmental Microbiology, UFZ - Helmholtz-Centre for Environmental Research

In dit artikel

Samenvatting

Chronoamperometrische groei van anodisch elektroactieve microbiële biofilms in een fed-batch reactor met behulp van een drie-elektrode opstelling, gecontroleerd door een potentiostaat, wordt gedemonstreerd. De extracellulaire elektronenoverdracht wordt gekenmerkt door middel van cyclische voltammetrie in de aanwezigheid van de elektronendonor en in de afwezigheid van de elektronendonor. Fundamentele data-analyse wordt gedemonstreerd.

Samenvatting

De groei van anodisch elektroactieve microbiële biofilms uit afvalwater inocula in een fed-batch reactor wordt gedemonstreerd met behulp van een drie-elektrode opstelling die wordt geregeld door een potentiostat. Hierdoor maakt het gebruik van potentiostaten een exacte aanpassing van het elektrodespotentiaal mogelijk en garandeert het reproduceerbare microbiële kweekomstandigheden. Tijdens de groei wordt de stroomproductie gemonitord met behulp van chronoamperometrie (CA). Op basis van deze gegevens worden de maximale stroomdichtheid (jmax) en de coulombische efficiëntie (CE) besproken als maatstaven voor de karakterisering van de bio-elektrokatalytische prestaties. Cyclische voltammetrie (CV), een niet-destructieve, d.w.z. niet-invasieve, methode, wordt gebruikt om de extracellulaire elektronenoverdracht (EET) van elektroactieve bacteriën te bestuderen. CV-metingen worden uitgevoerd op anodische biofilmelektroden in aanwezigheid van het microbiële substraat, d.w.z. omzetcondities, en in afwezigheid van het substraat, d.w.z. niet-omzetcondities, met behulp van verschillende scannelheden. Vervolgens wordt data-analyse geëxemplifieerd en worden fundamentele thermodynamische parameters van de microbiële EET afgeleid en uitgelegd: piekpotentiaal (Ep), piekstroomdichtheid (jp), formeel potentiaal (Ef) en piekscheiding (ΔEp). Daarnaast worden de beperkingen van de methode en de huidige stand van de data-analyse besproken. Hierdoor moet dit video-artikel een gids zijn voor de basisexperimentele stappen en de fundamentele data-analyse.

Inleiding

De verduidelijking van de fundamenten van microbiële extracellulaire elektronenoverdracht (EET) en de exploitatie ervan in geconstrueerde systemen is een vitaal en snel groeiend onderzoeks- en ontwikkelingsgebied1-3. De studie van deze elektroactieve (of bioelektrokatalytische of elektrochemisch actieve) micro-organismen, inclusief zuivere stammen, maar ook gedefinieerde co-culturen en complexe consortia, vereist een complex arsenaal aan technieken, methoden en protocollen4. Deze methoden zijn afkomstig uit diverse wetenschappelijke disciplines, bijv. elektrochemie, materiaalkunde, microbiologie en bieden inzichten op verschillende hiërarchische niveaus, dwz. van de volledige microbiële biofilm tot enkele moleculen. Daarbij vertegenwoordigen elektrochemie en elektrochemische methoden de basis van alle activiteiten.

Traditioneel werden brandstofcel-achtige opstellen vaak gebruikt voor het groeien en onderhouden van elektroactieve microbiële culturen in het archetype van deze geconstrueerde systemen: microbiële brandstofcellen (MFC's)5. Helaas lieten deze soorten MFC's vaak geen monitoring of zelfs controle toe van het potentieel van een enkele elektrode en dus waren er slechts beperkte inzichten in de elektrodeprocessen mogelijk- alleen de celspanning werd gerapporteerd. Nu wordt steeds meer erkend dat het individueel monitoren en controleren van de potentialen van enkele elektrodes in MFC's een duidelijk voordeel vertegenwoordigt, niet alleen voor fundamenteel onderzoek maar ook voor engineering. Bovendien, met de diversificatie van de toepassingen van microbiële elektrochemische technologieën die nu bijv. sanering, ontzilting, syntheses en zelfs biocomputing omvatten, in zogenaamde microbiële bio-elektrochemische systemen (BES)2,6,7 is een externe controle van individuele elektrodepotentialen vaak substantieel. Deze controle wordt meestal bereikt door externe stroombronnen of potentiostaten te gebruiken. Hierdoor maakt het gebruik van potentiostaten- in tegenstelling tot andere soorten opstellen- een exacte aanpassing van het individuele elektrodepotentieel mogelijk. Dit is van groot belang omdat de elektrode de terminale microbiële elektronenacceptor (voor anoden) of elektronendonor (voor kathoden) van de extracellulaire elektronenoverdracht vertegenwoordigt. Figuur 1 toont de huidige kennisstaat van de microbiële EET bij anoden- zie voor details bijv.2,4,6,8,9 De EET bij de kathode is nog steeds hoofdzakelijk onaangeboord10.

Zo maakt de controle van het elektrodepotentieel niet alleen het gebruik van reproduceerbare microbiële kweekcondities mogelijk, maar ook het afstemmen ervan in termen van EET-thermodynamica11. Binnen dit artikel wordt gedemonstreerd hoe de karakteristieke parameters van elektroactieve microbiële biofilms kunnen worden geëxtraheerd uit fed-batch reactorexperimenten met behulp van chronoamperometrie (CA) en cyclische voltammetrie (CV). Dit omvat de prestatieparameters maximale stroomdichtheid (jmax) en coulombische efficiëntie (CE) evenals EET-kenmerken. Hierbij zal de identificatie van de formele potentialen (Ef) van mogelijke en actuele elektronenoverdrachtsplaatsen in de focus staan. De extractie van deze parameters wordt getoond aan het voorbeeld van uit afvalwater afgeleide gemengde kweekbiofilms die worden gedomineerd door Geobacter spec.12 Deze uit afvalwater afgeleide biofilms worden verkregen door een eenvoudige elektrochemische selectieprocedure zoals aangetoond door talrijke onderzoeksgroepen over de hele wereld13-16.

Dynamische elektrochemische technieken om microbiële extracellulaire elektronenoverdracht te bestuderen

Voor een thermodynamische karakterisering van de EET van elektroactieve microbiële culturen zijn dynamische elektrochemische technieken nodig. In het algemeen omvatten deze technieken potentiaalgestuurde, d.w.z. voltammetrische, en stroomgestuurde, d.w.z. galvanodynamische, technieken17. Hierbij zijn de potentiaalgestuurde technieken meer prevalent en omvatten bijvoorbeeld, vierkante golfvoltammetrie en lineaire veegvoltammetrie18. Het populairst is echter cyclische voltammetrie (CV)19,20. CV is bekend en wijdverbreid in verschillende gebieden van de elektrochemie, variërend van batterijonderzoek via materiaalkunde tot enzymbio-elektrochemie21. De toepassing ervan op levende microbiële cellen kan echter pas meer dan een decennium geleden worden gedateerd22 en neemt de laatste jaren aanzienlijk toe23,24. Vooral de combinatie van CV en spectroscopische methoden heeft ongekende inzichten geboden in de EET-mechanismen en zijn moleculaire aard, bijv.25,26 Parallel hiermee werd het theoretische raamwerk voor de extractie van thermodynamische en theoretische kenmerken van de microbiële EET verbreed en verdiept27-30. Daarentegen echter, belemmeren experimentele verkeerd gebruik of ontoereikende data-analyse vaak de juiste toepassing van CV in het veld van microbiële bio-elektrochemie. Daarom, naast workshops (bijv. op het EU-ISMET 2012) en tutorials19, dient dit video-artikel een basisgids te bieden voor het uitvoeren van cyclische voltammetrische experimenten op elektroactieve bacteriën. Hierbij wordt het zich gericht op de basisexperimentele stappen en de fundamentele data-analyse en is het niet bedoeld om de nieuwste protocollen van kinetische analyse te bieden. De belangrijkste termen voor de volgende discussie zijn samengevat in Box 1 (aangepast van Harnisch en Freguia19 en gewijzigd).

Protocol

Aangezien de selectieprocedure in de bio-elektrochemische fed-batch reactor zeer specifiek is vanwege de keuze van substraat en anaërobe omstandigheden, is werken onder steriele omstandigheden niet noodzakelijk voor het gedemonstreerde voorbeeld.

1. Voorbereiding van groeimedium

  1. Bereid een geschikte hoeveelheid groeimedium voor door gebruik te maken van een fosfaatbuffer volgens Kim et al.13 (zie Tabel 1). Hier dient natriumacetaat (10 mM) als substraat. Het in dit artikel gebruikte groeimedium is slechts een voorbeeld en kan, afhankelijk van het experimentele doel, variëren in zijn componenten.
  2. Voeg 1 ml van primair afvalwater toe per 20 ml van groeimedium als inoculum. Het afvalwatermonster wordt genomen uit een gemeentelijk afvalwaterzuiveringsinstallatie na de mechanische filtratie (zie bijvoorbeeld Figuur 2) en kan tot drie maanden worden bewaard in een gesloten container bij 4 °C.
    (Opmerking: Afhankelijk van het doel van het experiment kan het exacte aantal cellen in het begin belangrijk zijn en moet dan worden bepaald. In het gedemonstreerde voorbeeld is het aantal cellen in het begin niet belangrijk, omdat de biofilm steady-state omstandigheden bereikt.)
  3. Spoel het medium inclusief het inoculum gedurende minimaal 30 min met stikstof om het te de-aereren, door een naald in het medium te steken en de stikstofstroom in te schakelen.  De stroom moet sterk genoeg zijn zodat je een volledige menging van het medium kunt waarnemen.
    (Opmerking: Afhankelijk van het volume van het medium zou men zelfs moeten overwegen de tijd van de-aeratie te verlengen. Tijdens de de-aeratie instelling (stappen 2.1-2.2))

2. Instelling van Fed-batch Reactor

  1. Neem een geschikte reactorvat- hier wordt een gemodificeerde 4-halsige 250 ml ronde bodemfles gebruikt.
    (Opmerking: Over het algemeen moet de vat ten minste vier inlaten hebben. Deze zijn nodig voor de drie elektroden en voor bemonstering/medium uitwisseling. Geproduceerde gasvolumes kunnen worden verwaarloosd wanneer de reactor regelmatig wordt geopend vanwege bemonstering of medium verandering, alternatief zou een bellenteller moeten worden geïnstalleerd. Om ongewenste fototrofe groei te voorkomen, moeten de reactoren worden beschermd tegen directe blootstelling aan licht.)
  2. Plaats voor de drie-elektrode opstelling (zie Figuur 3 en sectie 3 voor details) de referentie-elektrode (RE) (hier Ag/AgCl, verz. KCl, 0,197 V vs. SHE), de werkelektrode (WE) en de tegenelektrode (CE) in de fles door individuele inlaten via siliconen pluggen – luchtdicht afsluiten.
    (Opmerking: Als WE en CE worden grafietstaafjes gebruikt. De draad van de elektroden wordt door de siliconen plug getrokken en extern bevestigd. De referentie-elektrode wordt via een geboord gat door de siliconen plug geplaatst. Om kortsluitingen te voorkomen, zorg ervoor dat er geen fysiek contact is tussen de elektroden, zelfs tijdens het roeren of media recirculatie. Plaats de elektroden zodat ze volledig bedekt zijn met mediumoplossing. Voor afdichting wikkel de siliconen plug van elke inlaat met Parafilm.)
  3. Giet het groeimedium inclusief het inoculum (hier 250 ml) door de bemonsteringspoort in de reactor terwijl met stikstof wordt gespoeld.
  4. Sluit de laatste inlaat af met een siliconen plug en sluit deze luchtdicht af. Opmerking: Zuurstofsporen zullen de gemengde soorten biofilms niet schaden. Ze zijn in staat om lage zuurstofniveaus te weerstaan en zelfs te consumeren, wat op zijn beurt de CE kan verlagen.

3. Chronoamperometrisch Biofilm Groei

  1. Verbind de elektroden met de respectieve kabels van de potentiostat. Plaats het vat in een temperatuur gecontroleerde kamer, hier wordt 35 °C gebruikt31, om constante omgevingsomstandigheden te garanderen.
  2. Open de software om de potentiostat te besturen en kies de techniek: Chronoamperometrie. Stel de parameters bijvoorbeeld als volgt in: Een constant potentiaal EWE van 0,2 V (vs. Ag/AgCl) gedurende een duur t van 500 uur (≈ 20 dagen). De stroom wordt elke minuut opgenomen in tijdsstappen dti.
    Opmerking: De keuze van het toegepaste potentiaal is afhankelijk van het bestudeerde systeem/micro-organisme. Over het algemeen worden anode processen bestudeerd bij positief potentiaal en kathode processen bij negatieve potentiaal. Men kan ook een geschikt potentiaal afleiden uit de standaard potentiaal van de elektron donor/acceptor en formele potentiaal van de verwachte microbiële elektron transfer site, hier als startpunt verwijzen naar recente literatuur.
  3. Start de chronoamperometrie. Een grafiek van de gemeten stroom over tijd wordt door de software geplot, de waargenomen maximale stroom (imax) is een belangrijke online parameter, zoals besproken in secties 4 en 5. 

4. Biofilm Onderhoud

  1. Afhankelijk van de omgevingsomstandigheden, bijv. de temperatuur, begint een oxidatieve stroom te stromen en bereikt een plateau (zie Figuur 4). Nadat de nulstroom weer is bereikt, onderbreek de chronoamperometrische meting en vul het mediumoplossing aan. Voor een snellere biofilm groei, vervang het medium direct nadat het plateau van de maximale stroom is bereikt. Open de bemonsteringspoort en ontlaad voorzichtig, zonder de dunne biofilm te vernietigen, het medium. Terwijl het medium wordt bijgevuld, spoel opnieuw met stikstof. Sluit de bemonsteringspoort en sluit luchtdicht

Resultaten

1. Chronoamperometrie

Uit chronoamperometrische metingen kunnen twee operationele kenmerken worden berekend: de maximale stroomdichtheid (jmax), d.w.z. de maximale elektronenstroom per seconde, en de coulombische efficiëntie (CE), d.w.z. de totale stroomflux in relatie tot het geconsumeerde substraat. Figuur 4 laat een typische chronoamperometrische biofilmgroeicurve zien van meerdere groeicycli met behulp van een fed-batch reactor. Na de initiële lag-fase begint een eerste maximum in de stroomdichtheid. Daarna neemt de stroom weer af door substraatuitputting. Bij een (bijna) nulstroom wordt het medium vervangen, zoals aangegeven. Na deze substraatanvulling stijgt de stroomdichtheid opnieuw en is de volgende maximale stroomdichtheid hoger dan de eerste. Na verschillende groeicycli is jmax constant, wat duidt op een biofilmvorming in steady-state14. Omdat de steady-state jmax-waarde afhangt van verschillende parameters, bijv. elektrodemateriaal, reactortemperatuur en biofilmsamenstelling, wordt deze vaak beschouwd als een kenmerk van een bepaald elektroactief microbiële biofilm/elektrodesysteem. (In het geval van flow-through reactoren wordt niet jmax, maar de constante steady-state stroomdichtheid gebruikt.) Het tweede operationele kenmerk is de coulombische efficiëntie (CE) (Vergelijking 1). Dit is het aantal elektronen dat is geregistreerd als elektrische stroomflux, Qp, per fed-batch cyclus, gerelateerd aan het theoretische maximale aantal elektronen Qth, dat wordt berekend uit het substraatverbruik tijdens deze cyclus.

Statisch evenwichtsformule CE=QP/Qth×100; efficiëntieberekening in procesdiagram.

(Vergelijking 1)

De totale overgedragen lading kan worden verkregen door integratie van de CA-curve (zie ook Figuur 6):

Berekening van de elektrische lading, vergelijking, \( Q_P = \int_0^t i \, dt \), integratiemethode.

(Vergelijking 2)

De theoretisch mogelijke elektrische lading wordt berekend met de wet van Faraday:

Thermodynamische vergelijking Qth=ΔcVzF, chemische potentiaalanalyse, educatief gebruik.

(Vergelijking 3)

Waarbij V het volume van het groeimedium is, F de constante van Faraday (F = 96,485.34 C/mol), z het aantal vrijgekomen elektronen van het geoxideerde substraat (in het geval van acetaat komen er 8 elektronen vrij tijdens oxidatie tot CO2) en Δc = c0-c1, wat het substraatverbruik vertegenwoordigt (wordt bepaald via chemische analysemethoden, bijv. via HPLC).

2. Cyclische voltammetrie:

Cyclische voltammogrammen worden geregistreerd voor niet-turnover condities en voor turnover condities (zoals aangegeven in Figuur 4). In beide gevallen kan verschillende soorten informatie worden verkregen. In het vervolg wordt besproken hoe mogelijke en daadwerkelijke EET-plaatsen kunnen worden geïdentificeerd.

2.1 Niet-omzetcondities – identificeren van mogelijke EET-plaatsen:

Figuur 7 toont typische CV's voor niet-omzetcondities, d.w.z. in afwezigheid van substraat. Figuur 7A toont de CV van een biofilm voor hoge scansnelheden (hier 50 mV/sec) waarbij slechts één piekpaar en dus één formeel potentiaal Ef kan worden geïdentificeerd. Over het algemeen kan het formele potentiaal van een redoxpaar worden berekend uit het piekpotentiaal van de oxidatiepiek EpA en de reductiepiek van de betreffende soort EpC door het rekenkundig gemiddelde te bepalen (zie ook Figuur 7C):

Elektrochemische vergelijking: Ej = (EpA + Epc)/2, analyse van redoxpotentiaal in voltammetrie-studies.

(Vergelijking 4)

Wanneer een voldoende lage scansnelheid wordt toegepast op de identieke biofilm (hier 1 mV/sec), kunnen tot vier redoxparen worden geïdentificeerd (de respectieve formele potentialen zijn aangegeven in Figuur 7B). De reden hiervoor is dat de capacitieve achtergrondstroom afneemt bij het gebruik van lagere scansnelheden, zie ook Kader 1 en bijv.17,21 voor details. De nonturnover CV toont echter alleen alle redox-actieve verbindingen bij de elektrode en dus de Ef van de mogelijke EET-plaatsen. Alleen de analyse van de turnover CV geeft de Ef van de werkelijke EET-overdrachtsplaatsen weer (zie stap 2.2.).

Bij verdere analyse van de nonturnover CV's kunnen verschillende andere karakteristieke parameters worden geanalyseerd, zoals de piekseparatie ΔEp (Vergelijking 5) of de maximale piekstroom ipA en de minimale piekstroom ipC (zie Figuur 7C).

Statische evenwichtsvergelijking ΔEP=EpA-EpC; formuletabel voor educatieve doeleinden.

(Vergelijking 5)

Deze parameters, vooral wanneer ze voor verschillende scansnelheden worden vastgelegd, kunnen worden gebruikt voor mechanistische en kinetische analyse van elektronentransferprocessen bij elektroden. Deze kinetische analyse, die goed is vastgelegd voor chemische systemen, is echter niet eenvoudig voor elektroactieve microbiële biofilms, zie bijv.19,30

  1. Omzettingscondities – identificatie van werkelijke EET-plaatsen:

Wanneer een CV-meting wordt uitgevoerd in aanwezigheid van substraat, wordt een turnover CV verkregen (zie Figuur 8A). Na het uitzetten van de gegevens is de typische s-vormige, zogenaamde bioelektrokatalytische curve zichtbaar17-19. Bij verdere analyse van de gegevens geeft het maximum van de eerste afgeleide, d.w.z. het buigpunt van de CV-curve, het formele potentiaal Ef van de werkelijke EET-plaats(en) weer (zie Figuur 8B). In het geval van een jonge, d.w.z. dunne, door Geobacteraceae gedomineerde biofilm, hier 168 h na het starten van de CA, kunnen twee buigpunten worden waargenomen. Vervolgens vertoont de afgeleide twee maxima die overeenkomen met het formale potentiaal van de bioelektrokatalytisch actieve EET-plaatsen: -0,376 V en -0,295 V vs. Ag/AgCl (sat. KCl, 0,197 V vs. SHE). In Figuur 7B worden deze plaatsen aangeduid als respectievelijk Ef,2 en Ef,3. Deze bevinding laat tevens zien dat de redoxprocessen die geassocieerd zijn met de formele potentialen Ef,1 en Ef,4 (in de nonturnover CV) niet gerelateerd zijn aan bioelektrokatalyse. Naarmate de biofilm groeit en dikker wordt, vertoont de CV slechts één buigpunt, d.w.z. één maximum in de afgeleide curve. Dit formale potentiaal Ef, hier -0,32 V vs. Ag/AgCl (sat KCl), is (ongeveer) gelijk aan het rekenkundig gemiddelde van de twee formele potentialen die zijn toegewezen aan de EET van de dunne biofilm (bijv. hier Ef,2 en Ef,3) – zie Figuur 9. Dit aantoont dat deze zeer fundamentele CV-analyse op een snelle en niet-invasieve manier inzicht geeft in de EET-thermodynamica, maar opmerkelijk genoeg geen verdere mechanistische of kinetische conclusies toelaat.

Opmerkelijk is dat biofilms die zijn verkregen onder de specifieke condities in dit protocol sterk gedomineerd worden door Geobacter soorten (hier niet aangetoond)12,15. Het wijzigen van geselecteerde parameters, bijv. substraat, temperatuur, etc., zal ook de microbiële samenstelling en daarmee de elektrochemische eigenschappen beïnvloeden.

Tabel 1. Groeimedium volgens Kim et al.32

Component(mg/L) / (ml/L)   
NaH2PO4•H2O2,690.00
Na2HPO44,330.00
NH4Cl310.00
KCl130.00
natriumacetaat820.00
metaaloplossing12.50
vitamine-oplossing12.50
Tabel 2. Componenten van de metaal- en vitaminenoplossing33.
Spoorelementoplossing:Vitaminenoplossing:
Componentmg/L   Componentmg/L   
Nitriloazijnzuur1,500.0Biotine2.0
MgSO4•7H2O         3,000.0Foliumzuur2.0
MnSO4•2H2O         500.0Pyridoxinehydrochloride10.0
NaCl  1,000.0Thiaminehydrochloride5.0
FeSO4•7H2O          100.0Riboflavine5.0
CoSO4 of CoCl2     100.0Nicotinezuur5.0
CaCl2•2H2O            100.0DL-Calcium pantothenaat5.0
ZnSO4   130.0Vitamine B120.1
CuSO4•H2O10.0p-Aminobenzoëzuur5.0
AlK(SO4)2               10.0Lipoëzuur5.0
H3BO3 10.0
Na2MoO4•2H2O     10.0
Opmerking: Los nitriloazijnzuur op met KOH tot pH 6,5, en voeg vervolgens de mineralen toe.


Diagram van bioelektrochemische terminologie; bevat vergelijkingen en formules in de elektrochemie.
Gids voor instellingen van parameters bij cyclische voltammetrie en probleemoplossing, met de nadruk op aanpassingen van het potentiaalvenster en de scansnelheid voor optimale CV-experimenten.

Diagram van microbiële elektronentransport; MET-, DET-, MIET- en DIET-routes; analyse van elektronentransport.
Figuur 1. Schema van mogelijke mechanismen voor microbiële extracellulaire elektronentransport. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Waterbemonsteringsproces; emmersampler verzamelt monsters uit de afvalwaterzuiveringsstroom.
Figuur 2. Bemonstering bij de afvalwaterzuiveringsinstallatie na de roostercollector (afvalwaterzuiveringsinstallatie Duitsland). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Diagram en foto van een elektrochemische cel met potentiostaat, elektrode-opstelling; CE, RE, WE gelabeld.
Figuur 3. Opstelling met drie elektroden. (A) Schema, (B) werkelijke reactor; CE = tegenelektrode, RE = referentie-elektrode, WE = werkelektrode met elektroactieve microbiële biofilm, SP = bemonsteringspoort. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Elektrochemische grafiek; CV-analyse; stroom vs tijd; steady-state benadering; gegevens in microampères en uren.
Figuur 4. Plot van chronoamperometrische biofilmgroei op basis van een fed-batch afvalwaterinoculum. De oxidatieve stroom bereikt een steady-state na drie cycli van mediumverversing. Aangegeven zijn de lag-fase en de tijdstippen van mediumverversing en het uitvoeren van turnover cyclische voltammetrie (CV) en nonturnover CV voor steady-state biofilmcondities (ruwe gegevens van Liu14). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Elektrochemische analyse, E-t diagram, cyclische voltammetrie, potentiaal versus tijd, analytische chemie.
Figuur 5. Principe van het potentiaal-tijdverloop tijdens één cyclus van cyclische voltammetrie. CV start bij het beginpotentiaal Ei. De aangelegde spanning wordt vervolgens lineair veranderd in de tijd met een scansnelheid van v. Bij een gekozen toppuntpotentiaal E1 keert de spanning terug naar een eindpotentiaal E2, waarbij hier E2 = Ei. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Elektrochemische analysegrafiek met stroomdichtheid j tegenover tijd t, illustrerend piek jmax.
Figuur 6. Typisch chronoamperogram van één groeicyclus van een uit afvalwater verkregen biofilm; hierin zijn de maximale stroomdichtheid jmax, de gevloeide (praktische) elektrische lading Qp, de bemonstering van de initiële substraatconcentratie c0 en de substraatconcentratie na één groeicyclus c1 aangegeven. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Elektrochemische analysegrafiek; cyclische voltammetrie-diagrammen die resultaten van stroom versus spanning tonen.
Figuur 7. Nonturnover cyclische voltammogrammen van een G. sulfurreducens biofilm. Scanrate: (A) 50 mV/sec, (B) 1 mV/sec 23; (C) uitvergroting van B, die de piekstroomdichtheid (jpA) en het respectievelijke piekpotentiaal (EpA) van de anode bij de maxima demonstreert. Overeenkomstig worden bij de minima de piekstroomdichtheid (jpC) en het respectievelijke piekpotentiaal (EpC) van de kathode getoond. Het formele potentiaal Ef en de piekscheiding ΔEp vloeien respectievelijk voort uit Vergelijking 4 en Vergelijking 5 (zie voor details de onderstaande tekst). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Elektrochemische analyse; voltammetriegrafiek; stroom versus potentiaal; piekdetectie; data-analyse.
Figuur 8. (A) Turnover cyclisch voltammo그램 van een metaboliserende G. sulfurreducens biofilm. De scansnelheid was 5 mV/sec. (B) Eerste afgeleiden van de voltammetrische curve23. Aangegeven zijn de formele potentialen van de feitelijke EET-plaatsen: Ef,2 en Ef,3. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Cyclische voltammetriegrafiek; stroom versus potentiaal; elektrochemische analyse; dataresultaten.
Figuur 9. (A) Turnover cyclisch voltamogram en (B) eerste afgeleiden van een dikkere metaboliserende G. sulfurreducens biofilm. De scansnelheid was 5 mV/sec (vergelijk Figuur 8). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Discussie

Het gepresenteerde protocol toont een eenvoudige en duidelijke manier om elektroactieve microbiële biofilms te kweken van afvalwater inoculaat met behulp van een drie-elektrode opstelling in een fed-batch reactor. Chronoamperometrie maakt de groei en selectie van elektroactieve microbiële biofilms uit diverse inocula mogelijk, evenals de fundamentele karakterisering van de biofilms in termen van maximale stroomdichtheid en coulombische efficiëntie. Cyclische voltammetrie, als een niet-invasieve techniek, maakt fundamentele studies mogelijk over de EET-thermodynamica van de microbiële biofilm en dus om mogelijke en actuele EET-overdrachtsplaatsen te identificeren. Samen laten deze parameters toe i) verschillende microbiële biofilms te karakteriseren en vergelijken onder identieke omstandigheden, alsook ii) de impact van verschillende operationele omstandigheden op identieke elektroactieve microbiële biofilms te bestuderen. Deze experimenten kunnen echter slechts een startpunt zijn. Aan de ene kant vereist het veelzijdige veld van microbiële bio-elektrochemie verdere en diepgaande exploitatie van elektrochemische methoden en protocollen. Dit omvat bijvoorbeeld modellen voor het extraheren van kinetische en mechanistische gegevens, evenals verdere methoden zoals elektrochemische impedantiespectroscopie34,35. Aan de andere kant kunnen elektrochemische methoden geen informatie verschaffen over de moleculaire aard, de microbiële samenstelling, de ruimtelijke microbiële organisatie, etc. Hier zijn verdere technieken nodig die ofwel niet-invasief en gekoppeld zijn aan elektrochemie ofwel invasief zijn4.  Box 2 biedt een korte bespreking van de cruciale stappen bij het uitvoeren van de experimenten evenals de eerste probleemoplossing. 

Vanuit het oogpunt van de techniek moet worden overwogen dat de elektroactieve biofilm-anode slechts één component is van de huidige microbiële bio-elektrochemische systemen en dat een veelvoud aan andere factoren moet worden geanalyseerd voor volledige systemen36. Toch hopen we dat dit video-artikel zal helpen om de kernelementen van BES, d.w.z. de microbiële elektroden, in de toekomst te begrijpen en aan te passen.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

F.H. erkent de ondersteuning van de BMBF (onderzoeksprijs “Next generation biotechnological processes - Biotechnology 2020+”) en de Helmholtz-Association (Young Investigators Group).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Primair afvalwaterAfvalwaterzuiveringsinstallatieGenomen na mechanische filtratie
250 ml Ronde bodemkolven met drie extra inlatenTh.Geyer Berlin GmbH, Duitsland9.011 845Extra inlaten werden aangebracht door onze interne glasblazer
Ag/AgCl referentie-elektrode (sat. KCl, 0.195 V vs. SHE) met keramische membraanSensortechnik Meinsberg, DuitslandSE 11
Grafietroden (Ø=1 cm, l=3 en 5 cm)CP-Handels-GmbH, Wachtberg, DuitslandGebruikt als elektrodemateriaal
Roestvrij staal, Nr. 1.4301, Draad Fe/Cr18/Ni10Goodfellow GmbH, Bad Nauheim, Duitsland155-923-05
Siliconen pluggenTh.Geyer Berlin GmbH, Duitsland9.230 512 en
ParafilmneoLab, Heidelberg, Duitsland3-1011Voor afdichting om anaërobe omstandigheden te handhaven
Potentiostat/ Galvanostat Model MPG2BioLogic Science Instruments, Frankrijk
EC-LabBioLogic Science Instruments, Frankrijksoftware voor het uitvoeren van elektrochemische metingen
Origin 8.6OriginLabdata-analysesoftware

Referenties

  1. Rabaey, K., Angenent, L., Schröder, U., Keller, J. Integrated Environmental Technology Series. Lens, P. , IWA Publishing. London, New York. (2010).
  2. Logan, B. E., Rabaey, K. Conversion of wastes into bioelectricity and chemicals using microbial electrochemical technologies. Science. 337, 686-690 (2012).
  3. Rabaey, K., Rozendal, R. A. Microbial electrosynthesis - revisiting the electrical route for microbial production. Nat. Rev. Microbiol. 8, 706-716 (2010).
  4. Harnisch, F., Rabaey, K. The Diversity of Techniques to Study Electrochemically Active Biofilms Highlights the Need for Standardization. ChemSusChem. 5, 1027-1038 (2012).
  5. Logan, B. E., et al. Microbial Fuel Cells: Methodology and Technology. Environ. Sci. Technol. 40, 5181-5192 (2006).
  6. Harnisch, F., Schröder, U. From MFC to MXC: chemical and biological cathodes and their potential for microbial bioelectrochemical systems. Chem. Soc. Rev. 39, 4433-4448 (2010).
  7. TerAvest, M. A., Li, Z., Angenent, L. T. Bacteria-based biocomputing with Cellular Computing Circuits to sense, decide, signal, and act. Energy Environ Sci. 4, 4907-4916 (2011).
  8. Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nat. Rev. Microbiol. 4, 12 (2006).
  9. Lovley, D. R. Reach out and touch someone: potential impact of DIET (direct interspecies energy transfer) on anaerobic biogeochemistry, bioremediation, and bioenergy. Rev. Environ. Sci. Biotechnol. 10, 101-105 (2011).
  10. Rosenbaum, M., Aulenta, F., Villano, M., Angenent, L. T. Cathodes as electron donors for microbial metabolism: Which extracellular electron transfer mechanisms are involved. Bioresource Technol. 102, 324-333 (2011).
  11. Schröder, U. Anodic electron transfer mechanisms in microbial fuel cells and their energy efficiency. Phys. Chem. Chem. Phys. 9, 2619-2629 (2007).
  12. Harnisch, F., et al. Revealing the electrochemically driven selection in natural community derived microbial biofilms using flow-cytometry. Energy Environ. Sci. 4, 1265 (2011).
  13. Kim, J. R., Min, B., Logan, B. E. Evaluation of procedures to acclimate a microbial fuel cell for electricity production. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 23-30 (2005).
  14. Liu, Y., Harnisch, F., Fricke, K., Sietmann, R., Schröder, U. Improvement of the anodic bioelectrocatalytic activity of mixed culture biofilms by a simple consecutive electrochemical selection procedure. Biosens. Bioelectron. 24, 1006-1011 (2008).
  15. Torres, C. sI., et al. Selecting Anode-Respiring Bacteria Based on Anode Potential Phylogenetic, Electrochemical, and Microscopic Characterization. Environ. Sci. Technol. 43, 9519-9524 (2009).
  16. Virdis, B., Harnisch, F., Batstone, D. J., Rabaey, K., Donose, B. C. Non-invasive characterization of electrochemically active microbial biofilms using confocal Raman microscopy. Energy Environ. Sci. 5, 7017-7024 (2012).
  17. Scholz, F., Bond, A. M. Electroanalytical Methods: Guide to experiments and applications. 2, edn,(2010).
  18. Marsili, E., Rollefson, J. B., Baron, D. B., Hozalski, R. M., Bond, D. R. Microbial biofilm voltammetry: direct electrochemical characterization of catalytic electrode-attached biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 74, 7329-7337 (2008).
  19. Harnisch, F., Freguia, S. A Basic Tutorial on Cyclic Voltammetry for the Investigation of Electroactive Microbial Biofilms. Chemistry. 7, 466-475 (2012).
  20. Marsili, E., et al. Shewanella secretes flavins that mediate extracellular electron transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3968-3973 (2008).
  21. Bard, A. J., Inzelt, G., Scholz, F. Electrochemical Dictionary. , Springer. (2008).
  22. Kim, B. H., et al. Electrochemical activity of an Fe(III)-reducing bacterium, Shewanella putrefaciens IR-1, in the presence of alternative electron acceptors. Biotechnol. Tech. 13, 475-478 (1999).
  23. Fricke, K., Harnisch, F., Schröder, U. On the use of cyclic voltammetry for the study of anodic electron transfer in microbial fuel cells. Energy Environ. Sci. 1, 144 (2008).
  24. Marsili, E., Sun, J., Bond, D. R. Voltammetry and Growth Physiology of Geobacter sulfurreducens Biofilms as a Function of Growth Stage and Imposed Electrode Potential. Electroanalysis. 22, 865-874 (2010).
  25. Busalmen, J. P., Esteve-Núñez, A., Berná, A., Feliu, J. M. C-Type Cytochromes Wire Electricity-Producing Bacteria to Electrodes. Angew. Chem. 120, 4952-4955 (2008).
  26. Millo, D., et al. In Situ Spectroelectrochemical Investigation of Electrocatalytic Microbial Biofilms by Surface-Enhanced Resonance Raman Spectroscopy. Angew. Chem. Int. Edn. Engl. 50, 2625-2627 (2011).
  27. Hamelers, H. V., et al. New applications and performance of bioelectrochemical systems. Applied Microbiol. Biotechnol. 85, 1673-1685 (2010).
  28. Richter, H., et al. Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer. Energy Environ. Sci.. 2, 506 (2009).
  29. Torres, C. I., Kato Marcus, A., Rittmann, B. E. Proton transport inside the biofilm limits electrical current generation by anode-respiring bacteria. Biotechnol. Bioeng. 100, 872-881 (2008).
  30. Torres, C. I., et al. A kinetic perspective on extracellular electron transfer by anode-respiring bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 34, 3-17 (2010).
  31. Patil, S. A., Harnisch, F., Kapadnis, B., Schröder, U. Electroactive mixed culture biofilms in microbial bioelectrochemical systems: The role of temperature for biofilm formation and performance. Biosens. Bioelectron. 26, 803-808 (2010).
  32. Kim, J. R., Min, B., Logan, B. E. Evaluation of procedures to acclimate a microbial fuel cell for electricity production. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 23-30 (2005).
  33. Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. Methanogens: Reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43, 260-296 (1979).
  34. He, Z., Mansfeld, F. Exploring the use of electrochemical impedance spectroscopy (EIS) in microbial fuel cell studies. Energy Environ. Sci. 2, 215-219 (2009).
  35. Ter Heijne, A., et al. Identifying charge and mass transfer resistances of an oxygen reducing biocathode. Energy Environ. Sci. 4, 5035-5043 (2011).
  36. Logan, B. Scaling up microbial fuel cells and other bioelectrochemical systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 85, 1665-1671 (2010).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Afvalwaterinoculumcyclische voltammetriechronoamperometrieextracellulaire elektronentransportfed batchreactordrie elektrodenopstellingmaximale stroomdichtheidcoulombisch rendementformeel potentiaal
Afvalwater Afgeleide Elektroactieve Microbiële Biofilms: Groei, Onderhoud en Basis Karakterisering
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.