Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Optische detectie van E. coli Bacteriën door Mesoporous Silicon biosensoren

16.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50805

⸱

20 november 2013

 ,  , 
1Department of Biotechnology and Food Engineering, Technion - Israel Institute of Technology, 2The Inter-Departmental Program of Biotechnology, Technion - Israel Institute of Technology, 3The Russell Berrie Nanotechnology Institute, Technion - Israel Institute of Technology

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

A-label-free optische biosensor voor de snelle detectie van bacteriën wordt geïntroduceerd. De biosensor is gebaseerd op een nanogestructureerde poreuze Si, die is ontworpen om direct vastleggen van de doelbacteriën cellen op het oppervlak. Wij gebruiken monoklonale antilichamen geïmmobiliseerd op de poreuze transducer als capture probes. Onze studies tonen de toepasselijkheid van deze biosensoren voor de detectie van lage bacteriële concentraties binnen enkele minuten zonder voorafgaande monster verwerking (zoals mobiele lysis).

Samenvatting

A-label-free optische biosensor gebaseerd op een nanogestructureerde poreuze Si is ontworpen voor een snelle capture en detectie van Escherichia coli K12 bacteriën, als model micro-organisme. De biosensor gebaseerd op directe binding van de doelbacteriën cellen op het oppervlak, terwijl er geen voorbehandeling (bijvoorbeeld door cellysis) van de onderzochte steekproef is vereist. Een mesoporeuze Si dunne film wordt gebruikt als de optische omzetter onderdeel van de biosensor. Onder wit licht verlichting, de poreuze laag geeft goed opgelost Fabry-Perot franje patronen in de reflectiviteit spectrum. Toepassing van een snelle Fourier transformatie (FFT) om reflectievermogengegevens resulteert in een enkele piek. Veranderingen in de intensiteit van de FFT piek bewaakt. Aldus doelbacteriën vangen op de biosensor oppervlak, door middel van antilichaam-antigen interacties induceert meetbare veranderingen in de intensiteit van de FFT pieken, waardoor een 'real time' observatie bacteriën bevestiging. nt '> De mesoporeuze Si film, vervaardigd door een elektrochemische anodisatie proces wordt geconjugeerd met monoklonale antilichamen specifiek voor de doelbacteriën. de immobilisatie, immunoactiviteit en specificiteit van de antilichamen worden bevestigd door fluorescentie labeling experimenten. Nadat de biosensor is blootgesteld aan de doelbacteriën, worden de cellen direct gevangen op het antilichaam gemodificeerde poreuze Si oppervlak. Deze specifieke vastleggen van gebeurtenissen resulteren in intensiteit veranderingen in de dunne-film optische interferentie spectrum van de biosensor. We tonen aan dat deze biosensoren relatief lage concentraties kan detecteren bacteriën (detectie maximaal aantal 10 4 cellen / ml) in minder dan een uur.

Inleiding

Vroege en nauwkeurige identificatie van pathogene bacteriën is van groot belang voor de veiligheid van voedsel en water, milieu-monitoring, en point-of-care diagnostiek 1. Als traditionele microbiologie technieken zijn tijdrovend, arbeidsintensief, en niet de mogelijkheid om micro-organismen te detecteren in "real-time" of buiten het laboratorium omgeving worden biosensoren evolueren om deze uitdagingen 2-5 te voldoen.

In de afgelopen jaren, poreus Si (PSI) is ontstaan ​​als een veelbelovend platform voor het ontwerpen van sensoren en biosensoren 6-20. De afgelopen tien jaar tal van studies met betrekking tot overheidsinformatie gebaseerde optische sensoren en biosensoren werden gepubliceerd 21,22. De nanogestructureerde pSi laag wordt meestal vervaardigd door elektrochemische anodische ets van een monokristallijn Si wafer. De resulterende PSI nanomaterialen vertonen vele voordelige kenmerken, zoals grote oppervlak en vrij volume, poriegrootten die worden gecontroleerd en afstembare optimaalcal eigenschappen 10,16. De optische eigenschappen van de PSI-laag, zoals fotoluminescentie 8,11 en wit licht-reflectie gebaseerde interferometrie 7,19, worden sterk beïnvloed door omgevingsfactoren. Vangst van gasmoleculen / doelanalyten binnen de poreuze laag resulteert in een verandering van de gemiddelde brekingsindex van de film, waargenomen als een modulatie in het fotoluminescentiespectrum of golflengteverschuiving in de reflectie spectrum 10.

Hoewel de overgrote innovatie in pSi optische biosensor technologie, zijn er slechts enkele meldingen op overheidsinformatie gebaseerde platforms voor bacteriën detectie 6,8,20,23-29. Bovendien zijn de meeste van deze proof-of-concept studies hebben "indirecte" bacteriën die aangetoond. Aldus wordt meestal vooraf lysis van de cellen nodig is om de beoogde eiwit / DNA-fragmenten, kenmerkend voor de bestudeerde bacteriën 29 extraheren. Onze aanpak is om de doelbacteriën direct vast te leggencellen op de PSI-biosensor. Daarom zijn monoklonale antilichamen die specifiek voor bacteriën richten zijn geïmmobiliseerd op het poreuze oppervlak. Binding van bacteriecellen via antilichaam-antigen interacties op het oppervlak van de biosensor veranderingen in de amplitude (intensiteit) van de reflectiviteit spectrum 24-26 induceren.

In dit werk, doen we verslag van de bouw van een optische overheidsinformatie gebaseerde biosensor en demonstreren de toepassing ervan als een label-vrije biosensoren platform voor de detectie van Escherichia coli (E. coli) K12 bacteriën (als model micro-organisme). De bewaakte optisch signaal is het licht dat weerkaatst wordt door de PSI-nanostructuur gevolg van Fabry-Perot dunne film interferentie (Figuur 1A). Veranderingen in het licht amplitude / intensiteit gecorreleerd aan specifieke immobilisatie van het doel bacteriecellen op de biosensor oppervlak, waardoor een snelle detectie en kwantificering van de bacteriën.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereiding van geoxideerde poreuze SiO2

  1. Etch Si wafers (een zijde gepolijst op de <100> gezicht en zwaar gedoteerde, p-type, 0.0008 Ω · cm) in een 3:1 (v / v) waterige HF en absolute ethanol gedurende 30 seconden bij een constante stroom dichtheid van 385 mA / cm 2. Let op HF is een zeer bijtende vloeistof, en het moet met uiterste zorg worden behandeld.
  2. Spoel het oppervlak van de resulterende poreuze Si (PSI) film met absolute ethanol meerdere malen, drogen de film onder een droge stikstofgas.
  3. Oxideren de vers-geëtst pSi monsters in een buis oven bij 800 ° C gedurende 1 uur in de lucht (plaats het monster in de oven op kamertemperatuur, verwarm de oven tot 800 ° C, laat in de oven gedurende 1 uur, schakel de oven en verwijder de monsters uit de oven Pas bij kamertemperatuur).

2. Biofunctionalization van PSiO 2 Stellingen

  1. Incubeer een geoxideerde PSi (PSIO 2) monster gedurende 1 uur in mercaptopropyl (trimethoxysilane-3) 95% (MPTS) oplossing (108 mM in tolueen).
  2. Spoel de silaan behandelde PSiO 2 monster met tolueen, methanol en aceton droog onder een droge stikstofgas.
  3. Incubeer de silaan-gemodificeerde PSiO 2 monster gedurende 30 min in 1 ml 100 mM PEO-joodacetyl biotine oplossing.
  4. Spoel de biotine behandelde PSiO 2 monster met 0,1 M fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing meerdere keren.
  5. Incubeer de biotine gemodificeerde PSiO 2 monster gedurende 30 min in 1 ml van 100 ug / ml streptavidine (SA) oplossing.
  6. Spoel de SA-behandelde PSiO 2 monster met 0,1 M PBS-oplossing meerdere malen.
  7. Incubeer de verkregen SA-gemodificeerde PSiO 2 monster gedurende 30 min in 1 ml van 100 ug / ml gebiotinyleerd E. coli monoklonaal antilichaam (Immunoglobuline G, IgG) oplossing of 100 ug / ml gebiotinyleerd konijnen-IgG (als model voor een monoklonaal antilichaam).

3. Fluorescentielabelling en fluorescentiemicroscopie

  1. Incubeer de IgG-gemodificeerde oppervlakken met 15 ug / ml fluoresceïne (FITC) gelabeld anti-konijn-IgG gedurende 40 min met 15 ug / ml fluoresceïne (FITC) gelabeld anti-muis IgG als controle.
  2. Spoel de gemodificeerde monsters met 0,1 M PBS oplossing meerdere malen.
  3. Onderzoek de monsters onder een fluorescentiemicroscoop.

4. Bacteriën Cultuur

  1. Cultiveren E. coli K12 bacteriën in een 10 ml buis met 5 ml Luria Bertani (LB) medium (gemiddeld samenstelling in 1 L gedeïoniseerd water: 5 g NaCl, 5 g gistextract en 10 g trypton). Incubeer de bacteriën overnacht schudden bij 37 ° C.
  2. Controleer de bacterie concentratie door het lezen van de optische dichtheid (OD) bij een golflengte van 600 nm. Na een nacht groei in LB-medium, lees de OD 600 met behulp van een spectrofotometer om de bacteriële concentratie te bepalen. Het aantal cellen is directly evenredig met de OD600 metingen (1 OD 600 = 10 8 cellen / ml).

5. Bacteriën Sensing

  1. Plaats de IgG-gemodificeerde PSiO 2 en netjes PSiO 2 (als controle) monsters in een op maat gemaakte plexiglas stroom cel. Bevestig de doorstroomcel zodat het monster reflectiviteit gemeten op dezelfde plaats tijdens alle metingen.
  2. Incubeer de monsters met E. coli K12 suspensie (10 4 cellen / ml) gedurende 30 min bij kamertemperatuur geroerd. Verwijder de bacterie suspensie door spoelen van de cellen met 0,85% w / v zoutoplossing gedurende 30 minuten.
  3. Controleer de veranderingen in de reflectie data gedurende het experiment. Alle optische metingen moeten plaatsvinden in een waterige omgeving te worden uitgevoerd. Spectra moet met een CCD spectrometer verzameld en door het toepassen snelle Fourier transformatie (FFT), zoals eerder beschreven 25,26 geanalyseerd.
  4. Bevestigen de aanwezigheid van de bacteriën op debiosensor oppervlak, door waarneming van de monsters onder een rechtopstaande lichtmicroscoop onmiddellijk na de biosensoren experiment.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Geoxideerd psi (PSiO 2) films worden bereid zoals beschreven in de sectie protocol tekst. Figuur 1B toont een hoge-resolutie scanning electron micrograaf van het resulterende PSi film na thermische oxidatie. De PSiO 2 laag wordt gekenmerkt door goed gedefinieerde cilindrische poriën met een diameter in het bereik van 30-80 nm.

Het monoklonale antilichaam (IgG) moleculen geënt op de PSiO 2 oppervlakken met een gevestigde silaneren technologie ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Een label-vrije optische immunosensor, gebaseerd op een PSiO 2 nanostructuur (a Fabry-Perot dunne film) wordt vervaardigd, en de mogelijke toepasbaarheid als biosensor bacteriën detectie bevestigd.

Wijzigingen en probleemoplossing

Een van de grootste problemen bij het ​​ontwerpen van een immunosensor is de gevoeligheid van antilichamen tegen ongewenste conformatie veranderingen ondergaan tijdens de depositie en patroonvorming op het vaste substraat, wat k...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Israel Science Foundation (subsidie ​​nr. 1118-1108 en subsidie ​​nr. 1146/12) en de Minna Kroll Fonds Memorial Research. ES zeer erkentelijk voor de financiële steun van de Russell Berrie Nanotechnologie Instituut.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Si waferSiltronix Corp.Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm weerstand, <100> georiënteerd
Aqueous HF (48%)Merck101513
Ethanol absoluutMerck818760
PBS bufferoplossing (pH 7,4)bereid door 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4 en 68 mM NaCl op te lossen in Milli-Q water (18,2 MΩ)
Zoutoplossing 0,85% w/vbereid door 0,85 g NaCl op te lossen in 100 ml Milli-Q water (18,2 MΩ)
95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilaan (MPTS)Sigma Aldrich Chemicals175617
PEO-iodoacetyl biotinSigma Aldrich ChemicalsB2059
Streptavidine (SA)Jackson ImmunoResearch Labs Inc.016-000-114
Fluoresceïne (DTAF)-streptavidineJackson ImmunoResearch Labs Inc.016-010-084
Biotinyleerde-konijn IgGJackson ImmunoResearch Labs Inc.011-060-003
Fluorescent gelabelde anti-konijn IgGJackson ImmunoResearch Labs Inc.111-095-003
Fluorescent gelabelde anti-muis IgGJackson ImmunoResearch Labs Inc.115-095-003
Biotinyleerde E. coli antilichaamJackson ImmunoResearch Labs Inc.1007
E. coli (K-12)werd vrijgevig geleverd door Prof. Sima Yaron, Technion

Referenties

  1. Velusamy, V., et al. An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors. Biotechnol. Adv. 28 (2), 232-23 (2010).
  2. Food Microbiol.: Fundamentals and Front. Doyle, M. P., Beuchat, L. R., Montville, T. J. 2, ASM Press. Washington. (2001).
  3. Radke, S. M., Alocilja, E. C. A microfabricated biosensor for detecting foodborne bioterrorism agents. IEEE Sens. J. 5 (4), 744(2005).
  4. Glynn, B., et al. Current and emerging molecular diagnostic technologies applicable to bacterial food safety. Int. J. of Dairy Technol. 59 (2), 126(2006).
  5. Leonard, P., et al. Advances in biosensors for detection of pathogens in food and water. Enzyme Microb. Technol. 32 (1), 3(2003).
  6. Alvarez, S. D., et al. Using a porous silicon photonic crystal for bacterial cell-based biosensing. Physica Status Solidi a-Applications and Materials Science. 204 (5), 1439(2007).
  7. Archer, M., et al. Electrical porous silicon microarray for DNA hybridization detection. Micro- and Nanosystems. 782, 385(2004).
  8. Chan, S., Horner, S. R., Fauchet, P. M., Miller, B. L. Identification of Gram Negative Bacteria Using Nanoscale Silicon Microcavities. J. Am. Chem. Soc. 123, 11797(2001).
  9. Dancil, K. -P. S., Greiner, D. P., Sailor, M. J. Development of a Porous Silicon Based Biosensor. Canham, L. T., Sailor, M. J., Tanaka, K., Tsai, C. C. Proceedings of the Mat. Res. Soc. Symp, Boston, MA, 536, 557-562 (1999).
  10. D'Auria, S., et al. Nanostructured silicon-based biosensors for the selective identification of analytes of social interest. J Phys - Condens Matter. 18 (33), S2019(2006).
  11. de Leon, S. B., et al. Neurons culturing and biophotonic sensing using porous silicon. Appl Phys Lett. 84 (22), 4361(2004).
  12. Janshoff, A., et al. Macroporous p-type silicon Fabry-Perot layers. Fabrication, characterization, and applications in biosensing. J. Am. Chem. Soc. 120 (46), 12108(1998).
  13. Orosco, M. M., Pacholski, C., Miskelly, G. M., Sailor, M. J. Protein-coated porous silicon photonic crystals for amplified optical detection of protease activity. Adv. Mater. 18, 1393(2006).
  14. Pacholski, C., et al. Biosensing using porous silicon double-layer interferometers: reflective interferometric Fourier transform spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 127 (33), 11636(2005).
  15. Pacholski, C., et al. Reflective Interferometric Fourier Transform Spectroscopy: A Self-Compensating Label-Free Immunosensor Using Double-layers of Porous SiO2. J. Am. Chem. Soc. 128, 4250(2006).
  16. Sailor, M. J., Link, J. R. Smart Dust: nanostructured devices in a grain of sand. Chem. Comm. , 1375(2005).
  17. Schwartz, M. P., Alvarez, S. D., Sailor, M. J. Porous SiO2 interferometric biosensor for quantitative determination of protein interactions: Binding of protein a to immunoglobulins derived from different species. Anal. Chem. 79 (1), 327(2007).
  18. Schwartz, M. ichaelP., et al. The smart petri dish: A nanostructured photonic crystal for real-time monitoring of living cells. Langmuir. 22, 7084(2006).
  19. Stewart, M. P., Buriak, J. M. Chemical and biological applications of porous silicon technology. Adv. Mater. 12 (12), 859(2000).
  20. Zhang, D., Alocilja, E. C. Characterization of nanoporous silicon-based DNA biosensor for the detection of Salmonella enteritidis. IEEE Sens J. 8 (5-6), 775(2008).
  21. Bonanno, L. M., Segal, E. Nanostructured porous silicon-polymer-based hybrids: from biosensing to drug delivery. Nanomedicine. 6 (10), 1755(2011).
  22. Jane, A., Dronov, R., Hodges, A., Voelcker, N. H. Porous silicon biosensors on the advance. Trends Biotechnol. 27 (4), 230(2009).
  23. Li, S., Huang, J., Cai, L. A porous silicon optical microcavity for sensitive bacteria detection. Nanotechnology. 22 (42), 425502(2011).
  24. Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Segal, E. Nano Bio-Technology for Biomedical and Diagnostics Research. Zahavy, E., Ordentlich, A., Yitzhaki, S., Shafferman, A. 733, Springer. Netherlands. (2012).
  25. Massad-Ivanir, N., et al. Engineering Nanostructured Porous SiO2 Surfaces for Bacteria Detection via "Direct Cell Capture". Anal. Chem. 83 (9), 3282-32 (2011).
  26. Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Zeidman, T., Segal, E. Construction and characterization of porous SiO2/hydrogel hybrids as optical biosensors for rapid detection of bacteria. Adv Funct Mater. 20 (14), 2269-22 (2010).
  27. Mathew, F. P., Alocilja, E. C. Porous silicon-based biosensor for pathogen detection. Biosens. Bioelectron. 20 (8), 1656(2005).
  28. Ouyang, H., Archer, M., Fauchet, P. M. Frontiers in Surface Nanophotonics. 133, 49(2007).
  29. Ouyang, H., DeLouise, L. A., Miller, B. L., Fauchet, P. M. Label-free quantitative detection of protein using macroporous silicon photonic bandgap biosensors. Anal. Chem. 79 (4), 1502-15 (2007).
  30. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , 1st, Academic Press. (1996).
  31. Piervincenzi, R. T., Reichert, W. M., Hellinga, H. W. Genetic engineering of a single-chain antibody fragment for surface immobilization in an optical biosensor. Biosensors and Bioelectronics. 13 (3-4), 305(1998).
  32. Saerens, D., Huang, L., Bonroy, K., Muyldermans, S. Antibody Fragments as Probe in Biosensor Development. Sensors. 8 (8), 4669(2008).
  33. Shtenberg, G., et al. Picking up the Pieces: A Generic Porous Si Biosensor for Probing the Proteolytic Products of Enzymes. Anal. Chem. 85 (3), 1951(2013).
  34. Bonanno, L. M., DeLouise, L. A. Steric Crowding Effects on Target Detection in an Affinity Biosensor. Langmuir. 23 (10), 5817(2007).
  35. Banada, P. P., Bhunia, A. K. Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. Mohammed, E., Zourob, S., Turner, A. P. F. , Springer. 567(2008).
  36. Poma, A., Whitcombe, M., Piletsky, S. Designing receptores for the next generation of biosensors. Whitcombe, M. J., Piletsky, S. A. , Springer. 105(2013).
  37. Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Development of an immunosensor based on surface plasmon resonance for enumeration of Escherichia coli in water samples. Food Res. Int. 40 (7), 803(2007).
  38. Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Rapid and label-free bacteria detection by surface plasmon resonance (SPR) biosensors. Biotechn J. 4 (7), 1003(2009).
  39. Skottrup, P. D., Nicolaisen, M., Justesen, A. F. Towards on-site pathogen detection using antibody-based sensors. Biosens. Bioelectron. 24 (3), 339(2008).
  40. Taylor, A. D., Ladd, J., Homola, J., Jiang, S. Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. , Springer. 83(2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Mesoporeuze silicium biosensoroptische biosensordetectie van E. colilabelvrije biosensorporeuze siliciumfilmimmobilisatie van antilichamensnelle Fourier-transformatiereflectiespectrumbacterievangstfluorescentielabeling
Optische detectie van E. coli Bacteriën door Mesoporous Silicon biosensoren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.