Membraan-STEKEL: een biochemische Tool om eiwit-eiwit interacties van membraaneiwitten Identificeer In Vivo

Samenvatting

Een biochemische benadering wordt beschreven in vivo eiwit-eiwit interacties (PPI) van membraaneiwitten identificeren. De methode combineert eiwit verknoping, affiniteitszuivering en massaspectrometrie, en is aanpasbaar aan vrijwel elk type cel of organisme. Met deze benadering ook de identificatie van voorbijgaande PPI mogelijk.

Samenvatting

Membraaneiwitten zijn essentieel voor de levensvatbaarheid van de cellen en zijn daarom belangrijke therapeutische doelen ^1-3. Omdat ze functioneren in complexen ^4, methoden om hun interacties te identificeren en karakteriseren nodig ^5. Daarom hebben wij de membraan Strep-eiwitinteractie experiment genoemd Membraan-SPINE ^6. Deze techniek combineert in vivo verknopen met de omkeerbare cross-linker formaldehyde met affiniteit zuivering van een Strep-gelabeld membraan aas eiwit. Tijdens de procedure, verknoopte prooi eiwitten co-gezuiverd met het membraan aas eiwit en vervolgens gescheiden door koken. Daarom kunnen twee grote taken worden uitgevoerd bij de analyse van eiwit-eiwit interacties (PPI) van membraaneiwitten gebruik Membraan-STEKEL: ten eerste, de bevestiging van een voorgenomen interactiepartner door immunoblotting, en ten tweede, de identificatie van nieuwe interactie partners door massaspectrometrie-analyse . Bovendien, zelfs low affiniteit, voorbijgaande PPI's zijn detecteerbaar door deze techniek. Tot slot, Membraan-STEKEL is aanpasbaar aan vrijwel elk type cel, waardoor het van toepassing als een krachtig screening tool om PPI's van membraaneiwitten te identificeren.

Inleiding

Om de functie van een proteïne te begrijpen is het essentieel om de interactiepartners kennen. Verschillende klassieke technieken beschikbaar voor de identificatie van interactiepartners van oplosbare eiwitten. Echter, deze technieken niet gemakkelijk overdraagbaar eiwitten door hun hydrofobe aard ⁴ membraan. Om deze beperking te overwinnen, hebben we de Membraan Strep-eiwit interactie-experiment (Membraan-STEKEL) ⁶ ontwikkeld. Het is gebaseerd op de SPINE methode, die alleen voor oplosbare eiwitten ^7.

Membraan-SPINE profiteert van twee voordelen van het verknopingsmiddel formaldehyde: eerste, formaldehyde gemakkelijk membranen binnendringen en genereert daardoor een nauwkeurige momentopname van de interactoom van een levende cel ^8. Ten tweede, kan formaldehyde dwarsverbanden worden teruggedraaid door koken ^9. Hier worden deze twee voordelen gebruikt om niet alleen vaste maar ook tijdelijke PPI membraan prote identificerenins ^6.

In het kort wordt een Strep-tag gefuseerd met de C-terminus van de integrale membraan eiwitten aas. Cellen die het membraan aas eiwit geïncubeerd met formaldehyde crosslinks prooi eiwitten aan het membraan aas eiwit (Figuur 1). Wijzigingen van prooi eiwitten zijn niet nodig. Vervolgens wordt de membraan fractie bereid. Daarom zijn membraaneiwitten opgelost door detergensbehandeling en aas eiwitten co-gezuiverd met prooi eiwitten met affiniteitszuivering. Vervolgens wordt het verknopen omgekeerd door koken en het aas en de co-elueerde prooi eiwitten gescheiden door SDS-PAGE. Tenslotte kan prooi eiwitten worden geïdentificeerd door immunoblot analyse of massaspectrometrie.

Protocol

Opmerking: Gedetailleerde informatie over buffers in het protocol is in Tabel 1.

1. Fixatie van eiwit-eiwit interacties door Formaldehyde Cross-linking in levende cellen

1. Om te beginnen bereiden groeimedia, stock oplossingen en buffer P1
   1. Bereid 500 ml medium: Het medium moet voorwaarden die de interactie tussen membraan aas eiwit en prooi eiwitten ondersteunen. Daarnaast moet een experiment worden uitgevoerd onder omstandigheden waarbij geen interactie verwacht (bv. zonder cross-linking).
      Opmerking: We vergelijken eiwit-eiwit interacties in gestresst en niet gestresst bacteriën. Daarom bereiden we 500 ml Luria Bertani (LB) medium (tabel 1) die wij vullen met een stress-inducerende middel (bijvoorbeeld 0,5 M NaCl) in een 2 L Erlenmeyer kolf. Voor controle, gebruiken we normaal LB-medium met 0,17 M NaCl (pH 7,0).
   2. Bereid Tris-buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0) en 0,1 M ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), pH 8,0 stockoplossing (tabel 1).
   3. Bereid buffer P1. Los sucrose tot een uiteindelijke concentratie van 0,5 M in Tris-buffer. Steriliseer buffer P1 door filtratie en bewaard bij 4 ° C.
2. Groeien cellen die het membraan aas eiwit met een C-terminale Strep-tag fusie van een vector. Induceren de expressie van membraan lokaas eiwitten gedurende een voldoende tijd.
   Opmerking: We induceren de expressie van bacteriële membraan aas eiwitgehalte bij vroege log-fase ₍₆₀₀ A = 0,3) door toevoeging van 250 gl 1 M isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) tot 500 ml medium (eindconcentratie 0,5 mM) . Om voldoende expressie mogelijk te maken, broeden we de bacteriën tot in de late-log-fase (A ₆₀₀ = 1.2).
3. Bereid je voor elke cultuur twee centrifuge bekers met een minimaal volume van elk 300 ml en leg ze op ijs.
4. Voer formaldehyde verknoping.
   CAUTIE: Formaldehyde is zeer giftig We raden werken onder een veiligheids zuurkast..
   1. Breng de cultuur vat onder een veiligheids zuurkast. Splitsen elk monster in twee monsters, een weglating verknopen (- X) en een met inbegrip van het formaldehyde verknopen (+ X). Voeg 4 ml 37% formaldehyde-oplossing 250 ml cultuur tot een eindconcentratie van 0,6% te bereiken.
5. De cultuur schepen terug te boeken en te groeien cellen voor nog eens 20 minuten als voorheen.
6. Vul uw culturen in de centrifuge buizen onder een veiligheid zuurkast. Verzamel cellen door centrifugeren bij 3000 xg gedurende 30 minuten.
7. Gooi supernatant door voorzichtig pipetteren het omhoog onder een veiligheid zuurkast. Verzamel giftige formaldehyde bevattende supernatant en gooi het goed.
8. Om een ​​optimale opbrengst te bereiken tijdens membraaneiwit voorbereiding, bereiden eerst sferoplasten. Hier bieden we een protocol voor sferoplast vorming van Gram-negatieve bacteriën:
   1. Prepare buffer P2 (tabel 1) van gevriesdroogd poeder. Voorzichtig los 2 mg lysozym in 0,1 M EDTA, pH 8, in een 1,5 ml buis. Bereiden altijd buffer P2 vers voor de dag van het experiment.
   2. Bereid Tris-buffer met proteaseremmer (buffer P3). Aan 10 ml Tris-buffer, voeg 0,1 ml 1 M fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) (tabel 1) tot een eindconcentratie van 10 mM. Gebruik de buffer onmiddellijk een goede werking van PMSF waarborgen proteaseremmer.
   3. Resuspendeer celpellets in 10 ml Tris-buffer met proteaseremmer en transferoplossing een 15 ml conische buis.
   4. Voeg 1 ml buffer P2 en incubeer op ijs gedurende 30 minuten.
   5. Verzamel sferoplasten door centrifugeren bij 3000 xg gedurende 30 minuten en gooi supernatant voorzichtig.
9. Incubeer de sferoplast pellets nacht bij -20 ° C.

2. Zuivering van Strep-tag membraaneiwit (Bait)

1. Plaats sferoplast pellet op ijs.
2. Gedurende de tijd dat de sferoplast pellets ontdooien op ijs, bereiden 10 ml buffer P3 voor elke sferoplast voorbereiding. Voorzichtig los 1 mg DNaseI in 10 ml Tris-buffer. Voeg 0,1 ml 1 M PMSF vlak voor gebruik.
3. Resuspendeer de pellet in 6 ml vers bereid P3. Ultrasone trillingen het monster vier maal gedurende 1 min continu op ijs met 1 min. pauze tussen elke burst, om sferoplasten verstoren.
4. Centrifugeer het monster bij 10.000 xg gedurende 10 min te oogsten celresten. Breng de bovenstaande behulp van een pipet om een ​​ultracentrifuge buis.
5. Pellet de membraanfractie bij 100.000 xg gedurende 30 minuten. Was de pellet voorzichtig in Tris-buffer zonder het op te lossen. Droog de ​​buis met een papieren tissue (bijvoorbeeld Kleenex). Vermijd de pellet te verstoren op elk moment.
6. Resuspendeer de pellet (= membranen) voorzichtig in 1 ml Tris-buffer. Gebruik een 20 pi aliquot de eiwitconcentratie te bepalen, bijvoorbeeld door BCA assay. Bij deze stap worden de membranen shock li bevrorenquid stikstof en bewaard bij -80 ° C.

3. Zuivering van Strep-tag Membraan Bait Eiwit en SDS-PAGE

1. Normaliseren van de eiwitconcentratie van de membraanfractie met 5 mg / ml met Tris-buffer. Neem 2,5 ml membraanfractie (5 mg / ml) in een ultracentrifuge buis en voeg 0,25 ml 20% Triton X-100 tot een eindconcentratie van 2% bedragen, teneinde het membraan eiwitten oplosbaar. Voeg een micro-magnetische staaf en roeren op ijs gedurende 1 uur.
   Noot: Hoewel algemeen hebben we goede resultaten met Triton X-100 als detergens, kan het handig zijn de wasmiddel voor optimalisatie veranderen. In dit opzicht hebben we de beste resultaten met die reinigingsmiddelen voor functionele zuivering van de respectievelijke membraan aas eiwit.
2. Tijdens het uitvoeren van stap 3.1, bereiden 50 ml buffer W en 5 ml buffer E uit (tabel 1). Vul 10 ml 5x buffer W concentraat 50 ml en voeg 150 ul 20% Triton X-100.
   1. Vul 1 ml 5x buffer E concentraat 10 ml en voeg 30 ul 20% Triton X-100. Equilibreer een 1 ml Strep-Tactin superflow zwaartekracht kolom stroom met 8 ml buffer W.
      Opmerking: Het is essentieel om de wasmiddel voor de solubilisatie in een concentratie 10-voudig boven de kritische micel concentratie (CMC) heeft in een buffer tijdens de zuiveringsprocedure te voegen.
3. Verwijder de micro-magnetische staaf van het oplosbaar monster en ultracentrifuge bij 100.000 xg gedurende 30 min, de onoplosbare membraanfractie pelleteren. Verwijder het supernatant met een pipet voor verdere zuivering.
4. Plaats het supernatant op de kolom. Voer de kolom alleen met zwaartekracht. Was de kolom met 5 ml buffer inch Herhaal deze wasstap 5x.
5. Elueren membraan aas eiwitten met 1 ml buffer E. Herhaal deze elutiestap 4x.
6. Concentraat elutiefracties 2, 3, en 4 300 pl met een centrifugale filtereenheid.
7. Meng 200 gl van elk monster met 50 ul 5x SDS-PAGE ladingskleurstof. Split elke bereiding in 125 ul porties. Kook een aliquot van elk preparaat gedurende 20 minuten bij 95 ° C, formaldehyde verknopingen keren. Laat monsters afkoelen tot kamertemperatuur gedurende ten minste 10 minuten op de bank top.
8. Belasting 30 pi van elk monster een enkele rijstrook van een polyacrylamide-gel geschikt voor immunoblotting. Gebruik een voorgekleurde molecuulgewichtsmerker voor de beste oriëntatie en draaien SDS-PAGE ^10.

4. Immunoblotanalyse interactiepartners bevestigen

1. Zodra stap 3.8 is voltooid, overdracht eiwitten aan een nitrocellulose membraan door bijvoorbeeld halfdroge.
2. Blokkeer het membraan niet-specifieke labeling voorkomen. Bereid blokkerende buffer door weging runderserumalbumine (BSA) tot 3% gewicht per volume te bereiken in Tris-gebufferde zoutoplossing aangevuld met een uiteindelijke concentratie van 0,05% Tween-20 (TBS-T). Gebruik een voldoende hoeveelheid blockingbuffer het membraan bedekken. Blokkeer het membraan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
3. Verdun eennd incubeer de prooi eiwit specifieke eerste antilichaam zoals gewoonlijk. Gebruik een HRP-gekoppeld antilichaam als tweede antilichaam.
4. Ontwikkel de immunoblot met een chemiluminescentiedetectie kit met een hoge gevoeligheid. Bekijk het signaal met behulp van een klassieke film veredeling of digitale imaging apparatuur.

5. NanoLC-ESI-MS/MS hoge resolutie Experimenten interactiepartners identificeren

1. Indien er geen specifiek antilichaam beschikbaar voor de prooi eiwit of onbekende interactiepartners worden geïdentificeerd, gebruikt massaspectrometrie (MS) voor identificatie. Om keratine besmetting te voorkomen, gebruiken precasted gels voor scheiding van eiwitten.
2. Zilverkleuring de SDS-PAGE met behulp van een MS-compatibele kleuring kit volgens het protocol van de fabrikant. Voer alle vlekken en wassen stappen in glas tanks.
3. Accijnzen respectievelijke bands en deze analyseren door hoge resolutie LC / MS ^9.

Resultaten

Membraan STEKEL analyse kan de co-zuivering van membraaneiwitten en transient interagerende proteïne partners. De co-zuivering wordt mogelijk door de verknoping middel formaldehyde. Twee parameters zijn cruciaal voor niet-specifieke cross-verbindingen te voorkomen: de formaldehyde concentratie en de verknoping tijd. Het voldoende, maar niet overmatig gebruik van formaldehyde kan eenvoudig worden gecontroleerd door immunoblotting. Formaldehyde verknoopte eiwitcomplexen kunnen worden gescheiden door koken maar niet door S...

Discussie

Membraan STEKEL analyse is een biochemische benadering die men in staat stelt om te bevestigen en om te identificeren om dit punt onbekende interactie partners van membraaneiwitten. Membraan STEKEL combineert in vivo verknoping door formaldehyde met zuivering van een Strep-gelabeld membraan aas eiwit. De combinatie met immunoblotting vergemakkelijkt de bevestiging van voorspelde interactiepartners (figuur 2). Bovendien, de combinatie met MS analyse maakt de identificatie van onbekende interacti...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
37% Formaldehyde	Roth	4979.1	Mag niet ouder zijn dan een jaar
DNaseI	Sigma	DN25
BCA protein assay kit	Pierce	23225
Micromagnetic rod	Roth	0955.2	5 mm in lengte, 2 mm in diameter
Triton X-100	Roth	6683.1	standaard detergent voor solubilisatie
n-Dodecyl-β-maltoside	Glycon	D97002-C	het beste detergent om CpxA te solubiliseren
1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column	IBA	2-1207-050
Strep-tag protein purification buffer set	IBA	2-1002-001	Bevat buffer W en buffer E
Amicon Ultra-4 centrifugal filter	Millipore	UFC803024
SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate	Pierce	34080
SilverQuest Silverstaining kit	Invitrogen	LC6070
FireSilver Staining Kit	Proteome Factory	P-S-2001
Ultracentrifuge