Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Testsystemen voor de identificatie van nieuwe antivirale middelen tegen Bluetongue virus

13.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50820

⸱

11 oktober 2013

 ,  , 
1Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 2Molette Laboratory for Drug Discovery, Department of Chemistry and Biochemistry, Auburn University

In dit artikel

Samenvatting

Drie assays, zoals de cytopathische effect (CPE) gebaseerde bepaling, dosis-respons assay en tijd-van-toevoeging (ToA) assay ontwikkeld, geoptimaliseerd, gevalideerd en toegepast op nieuwe antivirale middelen tegen Bluetongue virus (BTV) identificeren alsmede zoals het bepalen van de mogelijke mechanisme-van-actie (MoA) voor nieuw geïdentificeerde antivirale middelen.

Samenvatting

Om potentiële antivirale middelen tegen BTV identificeren, hebben we ontwikkeld, geoptimaliseerd en gevalideerd drie assays hier gepresenteerd. De CPE-assay was de eerste test ontwikkeld om te evalueren of een verbinding vertoonde antivirale werkzaamheid en werden gebruikt voor het screenen grote samengestelde bibliotheek. Ondertussen cytotoxiciteit van antivirale kan worden geëvalueerd met de CPE gebaseerde test. De dosis-respons test werd ontworpen om het bereik van werkzaamheid van de gekozen antivirale bepalen, namelijk 50% remmende concentratie (IC50) of effectieve concentratie (EC50), alsook het gamma cytotoxiciteit (CC50). De ToA test werd gebruikt voor de eerste MoA onderzoek naar de onderliggende mechanismen van de nieuwe antivirale middelen tijdens BTV virale levenscyclus of het mogelijke effect op de gastheer cellulaire machinerie bepalen. Deze testen zijn van vitaal belang voor de evaluatie van antivirale effectiviteit in celcultuur systeem en zijn gebruikt voor onze recente onderzoeken leidening tot de identificatie van een aantal nieuwe antivirale middelen tegen BTV.

Inleiding

BTV is een prototype double-stranded RNA-virus in het geslacht Orbivirus, familie Reoviridae. BTV is een van de belangrijkste ziekten van vee, zoals schapen, geiten, runderen en andere huisdieren, met $ 3000000000 / jaar verlies wereldwijd 1,2. De exotische BTV serotype is een belangrijke verwekker van dierziekten in de beursgenoteerde "USDA High Consequence Vee Ziekteverwekkers." Onlangs heeft de re-opkomst van BTV is een grote uitbraak van de ziekte bij runderen en schapen veroorzaakt in verschillende landen in Noord-Europa 3,4. Als gevolg van de economische waarde en als modelsysteem is BTV het onderwerp van uitgebreid moleculaire, genetische en structurele studies, en verscheidene vaccins ontwikkeld. Echter, vanwege het gebrek aan goede assays voor antivirale medicijnontwikkeling, er geen antivirale middelen beschikbaar tegen BTV.

In een recente high throughput screening (HTS) campagne met behulp van BTV als modelsysteem, we developed, geoptimaliseerd en gevalideerd een-CPE-gebaseerde test om potentiële breed-spectrum antivirale middelen tegen arboviruses 5 identificeren. CPE-gebaseerde test is een goed erkende test die is gebruikt in antivirale medicijnontwikkeling tegen een aantal virussen die snelle en waarneembare CPE / apoptose geïnduceerd 5-7. In ons systeem, post BTV infectie, CPE is duidelijk in cellen van gewervelde dieren, met inbegrip van HeLa, BSR, en HEK 293T 8. BTV-geïnduceerde CPE zou kunnen worden gecontroleerd en gekwantificeerd met behulp van diverse cel levensvatbaarheid detectiemethoden, waaronder de CellTiter Glo celuitvoerbaarheid reagentiakit (CTG kit) 9. Deze set bepaalt het aantal levensvatbare cellen in kweek op basis van kwantificering van cellulaire ATP gepresenteerd, waarbij de aanwezigheid van metabolisch actieve levende cellen signalen. Onder optimale omstandigheden, de CPE-gebaseerde test hier gepresenteerde toonde de haalbaarheid met de "mix en meet" een stap protocol, en flexibiliteit met stabiele lichtgevende signalen. Ondertussen, toxische verbindingen reducing cellevensvatbaarheid zal deze CPE-assay worden uitgesloten. De CPE assay toonde de robuustheid en betrouwbaarheid antivirale medicijnontwikkeling tegen BTV, en is gebruikt voor het screenen NIH Molecular Libraries Small Molecule Repository (MLSMR), wat leidt tot de identificatie van zes nieuwe cluster potentiële antivirale loodverbinding (s ) 5.

Wanneer een potentiële antivirale verbinding is geïdentificeerd met de CPE-gebaseerde test, zal het moeten worden onderworpen aan de tien-concentratie dosis-respons bepaling om het bereik van antivirale werkzaamheid en cytotoxiciteit 2 bepalen. De antivirale werkzaamheid, weergegeven als de 50% remmende concentratie (IC50) en de 50% effectieve concentratie (EC50), is de concentratie van een drug die virus-geïnduceerde CPE halverwege tussen de basislijn en de maximale remt. De cytotoxiciteit van de antivirale middelen, namelijk de 50% cytotoxiciteit concentratie (CC50), de concentratievan een geneesmiddel induceren 50% cytotoxiciteit tussen de basislijn en maximum. De selectieve index (SI), aangeduid als 50% SI (SI 50) wordt berekend op basis van CC 50 / IC 50 die de specificiteit van het antivirale tegen virus-geïnduceerde CPE bepaalt. De IC50 (of EC 50), CC50 en SI 50 waarden essentieel maatregelen te bepalen of een antivirale verbinding krachtige en selectieve verdere ontwikkeling van geneesmiddelen.

Wanneer een antiviraal vertoonden geen openlijke toxiciteit in vitro, maar voorkomen virus-geïnduceerde CPE en productieve virale levenscyclus is belangrijk de MoA 2 karakteriseren. We begonnen deze karakterisering door middel van ToA test om eventuele stap (pen) van virale levenscyclus die wordt beïnvloed door de antivirale bepalen. Algemeen antivirale verbinding werden toegevoegd aan cellen op verschillende tijdstippen vóór of na virusinfectie. Indien de antivirale toegevoegd aan de geïnfecteerde cellen posten zijn doel sTEP tijdens infectie, zou dit resulteren in lagere activiteit vergeleken met die van vóór de stap toegevoegd. Aldus ToA studie is kritiek voor het bepalen van de antivirale effectiviteit van een verbinding, en het potentieel doel, hetzij op virale levenscyclus of de ontvangende machine betrokken bij de virale levenscyclus.

Voor alle drie testen, werd levensvatbaarheid van de cellen bepaald met behulp van de CTG-kit volgende fabrikant instructie 5. Dit detektiestelsel voert adequate fluorescentie signalen die kunnen worden geanalyseerd met behulp van diverse in-house software. Elke test werd gevalideerd en uitgevoerd ten minste in drievoud met acht replica. Voor alle verkregen gegevens werden drie parameters, waaronder gemiddelde waarde (AVE), standaarddeviatie (STDEV) en coëfficiënt variatie (CV) geanalyseerd om de robuustheid van de test te bepalen. Zodra de robuustheid van de test is vastgesteld, worden de gegevens verder worden geanalyseerd en uitgezet met verschillende Biostatistiek en grac onderdelen 2.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Cellen, Virus en de antivirale verbindingen

  1. Handhaaf BSR cellen, een derivaat van baby-hamster (BHK) cellen 10 in gemodificeerd Eagle's medium van Dulbecco (DMEM) dat 5% foetaal kalfsserum (FCS), 100U/ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine.
  2. Voor alle drie assays plaat cellen in DMEM met 1% FCS, 100U/ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine, zoals eerder geoptimaliseerde 5. Dit medium wordt aangeduid als voedingsbodem voor alle drie testen.
  3. Incubeer alle cellen in de incubator bij 37 ° C met 5% CO2 en 80-95% vochtigheid.
  4. Plaque-zuiveren en propageren het type 10 BTV (BTV-10) zoals eerder beschreven 8. Verdun BTV-10 in assaymedium voor elke aangewezen assays.
  5. Ontbinden alle testen verbindingen in DMSO om een ​​voorraad met concentratie ontstaan ​​op 10 mm. Bewaar de voorraden bij -20 ° C.
  6. Verdun verbindingen gewenste concentraties met voedingsbodem voor het aanwijzend assays 2.

2. CPE-gebaseerde test met behulp van CTG Kit

  1. Zaad BSR cellen in een 384-wells microtiterplaat (zwart; formaat van 16 x 24) via Microflo select dispenser. Het zaaien dichtheid is 5.000 cellen / putje, en het zaaien volume is 20 ul voor antivirale effectiviteit analyse.
  2. Incubeer de cellen gedurende 2-3 uur tot cellen krijgen aanhanger van de plaat grondig.
  3. Voeg antivirale verbinding met een eindconcentratie van 10 pM in elk putje. Meng het geheel.
  4. Verdun BTV naar de gewenste titer en voeg 5 pl BTV met Aangeduid MOI aan elk putje. Voor de controle goed, voeg 5 pl assay media. Incubeer de geïnfecteerde cellen gedurende 72 uur bij 37 ° C met 5% CO2 en 80-95% vochtigheid.
  5. Op 72 HPI, ontdooien en evenwicht CTG buffer en gevriesdroogd CTG substraat tot kamertemperatuur vóór gebruik. Los het homogene CTG reagensoplossing door mengen van de gevriesdroogde enzym / substraat en buffer reagens volgens einstructies e fabrikant.
  6. Equilibreer de assay platen tot kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
  7. Voeg een gelijk volume (25 pl) van CTG reagentia aan elk putje met een dispenser. Na incubatie gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker, meten luminescentiesignalen een multi-mode lezer een integratietijd van 0,1 sec.

3. Dosis-respons Assay

  1. Zaad BSR cellen in een 384-well microplaat (zwart; formaat van 16 x 24) via een dispenser met een zaaidichtheid van 5.000 cellen / putje in een volume van 20 seeding ui antivirale werkzaamheid assay en 25 ul cytotoxiciteit assay, respectievelijk .
  2. Incubeer cellen gedurende 2-3 uur bij 37 ° C met 5% CO2 en 80-95% luchtvochtigheid tot cellen goed op de plaat.
  3. Werkwijze assay een kwart gedeelte van het 384-wells plaat voor elke verbinding (equivalent aan een 96-well plaat), zoals weergegeven in Tabel 1. Toewijzen acht replica's voor elke concentratiein een enkele assay. Wijs de eerste kolom als positieve controle zonder toevoeging van verbinding en virus, en de laatste kolom (12e) als negatieve controle door toevoeging virus alleen zonder verbindingen.
  4. Verdun verbindingen 50 uM in testmedium en toevoegen aan de kolom 2 de in 20 ul / putje voor antivirale werkzaamheid assay. Meng de verbinding vijfmaal met 8 kanalen semi-automatische pipet een concentratie van 25 uM.
  5. Met 8 kanalen semi-automatische pipet 20 pi mengsel in 2e kolom naar de kolom (3e), goed mengen tot een concentratie van 12,5 uM vormen. Herhaal dit proces overdracht 20 pi mengsel van 3e kolom naar de andere kolom (4e) nog twee-voudige verdunning met een concentratie van 6,25 uM vormen. Herhaal deze tweevoudige seriële verdunning tot de kolom 11 ste. Zuig gooi 20 pi van het mengsel in 11 de kolom na het toevoegen en mengen van het compond.
  6. Add BTV-10, op basis MOI van 0,01, aan elk putje van kolom 2 naar kolom 11 met een volume van 5 pl / putje. Na toevoeging van het virus, moet de uiteindelijke concentratie van de verbinding in elke kolom zijn: 20 uM in kolom 2, 10 uM in kolom 3 en verder met een tweevoudige verdunning tot kolom 11 met een eindconcentratie van 0,04 uM.
  7. Voeg 5 ul van medium tot kolom 1 als cel alleen controle (positief) en 5 ul / putje van BTV naar kolom 12 als BTV infectie enige controle (negatief).
  8. Verdun verbindingen een initiële concentratie van 200 uM cytotoxiciteit assay. Evenzo, voeg 25 ul / putje van verbinding naar kolom 2 en gemengd met 5x 8-kanaals semi-automatische pipet een concentratie van 100 uM. Heeft BTV niet toevoegen.
  9. Voer de tweevoudige serie verdunning door opzuigen 25 ul van kolom 2 naar het naburige kolom 3, en bleef tot de laatste kolom (12 e). In kolom 12, na het mengen, aspireren en gooi 25 pl mixture. De eindconcentratie in kolom 2 moet 100 uM en de kolom 12 ste moeten bij 0,2 uM. De kolom 1 is de cel enige controle.
  10. Voor zowel antivirale werkzaamheid en cytotoxiciteit assays Incubeer de platen bij 37 ° C met 5% CO2 en 80-95% luchtvochtigheid gedurende 72 uur na behandeling. Meet cellevensvatbaarheid met de CTG kit zoals hierboven beschreven (stap protocol 2,5-2,7).

4. Time-of-toevoeging (ToA) Assay

  1. Zaad BSR cellen uit kolom 1-24 in een 384-wells microtiterplaat (zwart; formaat van 16 x 24) via een automaat bij 5.000 cellen / putje en het zaaien volume 15 ul / putje.
  2. Voor elke verbinding, gebruik maken van alle vierentwintig kolommen met acht replica voor elk tijdpunt in een helft van de 384-well plaat (Tabel 2). Kolom 1 als cellen alleen controle toewijzen door toevoeging van 10 ul / putje assaymedium. Mark kolom 24 als BTV infectie alleen controle (negatieve controle) door toevoeging van 5 ul / putje assaymedium eend 5 ul / putje virus bij MOI van 0,01 tot een eindvolume van 25 pl / putje.
  3. Selecteer de even kolommen uit kolom 2-22 als antivirale kolom werkzaamheid evaluatie op verschillende tijdstippen na infectie (hpi). In deze kolommen, infecteren cellen met 5 gl / putje BTV MOI van 0,01. Op verschillende hpi, ook 5 gl / putje verdunde verbinding toe aan elk putje tot een eindvolume van 25 ul / put vormen. Voor de aangegeven -2 en -1 hpi voegen verbinding om BSR cellen voorafgaand aan BTV infectie. Voor 0 HPI, voeg de verbinding en BTV aan de cultuur tegelijk.
  4. Daarnaast wijzen de oneven kolommen kolom 3-23 als verbinding controleert alleen van welke verbinding werden op verschillende tijdstippen zoals aangegeven (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48 hpi). In deze kolommen, voeg 5 ul / putje assaymedium en 5 gl / putje verdunde verbinding aan een eindvolume van 25 ul / put vormen.
  5. Na behandeling incubeer cellen bij 37 ° C, 5% CO2 met 80-95% vochtigheid.
  6. Bepaal levensvatbaarheid van de cellen bij 72 hpi met de CellTiter-Glo kit zoals eerder (protocol stappen 2,5-2,7) beschreven.

5. Data Analysis

  1. Verwerken alle gegevens voor het eerst gebruik van de juiste in-house software gebaseerd op de lichtgevende signalen verkregen via de multi-mode lezer. Bepaal de gemiddelde waarde (gemiddeld), standaarddeviatie (STDEV) voor elke behandeling en de coëfficiënt variatie (CV), die een waarde hebben van maximaal 10% vereist.
  2. Breng de verwerkte gegevens uit bovenstaande software om een ​​biostatische en grafische software tool. Voer de niet-lineaire regressieanalyse om de waarden van EC50 en CC50 bepalen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

1. Antivirale werkzaamheid van verbinding

De cel-gebaseerde CPE test werd ontwikkeld, geoptimaliseerd en gevalideerd in vitro met behulp van de lichtgevende gebaseerde CTG kit om nieuwe antivirale middelen te identificeren tegen BTV zoals eerder 2,5 beschreven. De tien-dosisrespons assay werd toegepast om de antivirale werkzaamheid en cytotoxiciteit van een geïdentificeerd loodverbinding door meting van het aantal metabolisch levensvatbare cellen in kweek op basis van kwanti...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Voor de initiële identificatie van antivirale hits, een van de belangrijkste stappen voor antivirale ontdekking en ontwikkeling van geneesmiddelen is om robuuste assays te ontwikkelen, waaronder het selecteren van een kwantificeerbare marker, het ontwikkelen van een eenvoudig protocol, om voldoende signalen en minder dan 10% CV. De meeste biochemische of celgebaseerde schermen zijn ontworpen om een ​​chemische startpunt gebaseerd op de meest robuuste, eenvoudige en goedkope test verschaffen vanwege de vereiste reproduce...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Dit project werd ondersteund door subsidie ​​1R03MH08127-01 en 7R03MH08127-02 van NIH naar Q. Li, en door de impact fondsen van afdeling Geneeskunde aan UAB Q. Li. De steun van de Molette Fonds en Auburn University wordt gewaardeerd. We danken ook de technische handreikingen van Ms Pulin Che en de heer Volodymyr Musiienko in de loop van het werk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DMEM mediumGibco1134218Voor celkweek
FBSGibco16000044Voor celkweek
0.05% Trypsin-EDTAGibco1000185Voor celkweek
DPBSGbico1049769Voor celkweek
CellTiter-Glo (CTG) kitPromegaTB288Voor celviabiliteitsmeting
70% ethanolFisherS25309BVerdund van 95%
Antivirale huashilcompoundsNIH MLSMR en de novo synthese
BTV-10ATCCVR-187
BSR-celOntwikkeld in eigen beheer
Synergy-II multi-mode microplaatlezerBioTekVoor luminescent signaalabellezing
MicroFlo select dispenserBioTekToevoegen van cellen, virus en reagentia
384-well vlakbodem microplaatCORNING28908031Voor celkweek
Gen. 5 softwareBioTekVoor analyse van uitlezingen van Synergy-II multi-mode microplaatlezer
GraphPad Prism 5GraphPadVersie 5Voor biostatische analyse en plot

Referenties

  1. Hemati, B., et al. Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph. J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).
  2. Gu, L., et al. Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus. PLoS ONE. 7, e43341(2012).
  3. Meiswinkel, R., et al. The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe--the entomological perspective. Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).
  4. Szmaragd, C., et al. Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007. Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).
  5. Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus. Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).
  6. Noah, J. W., et al. A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals. Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).
  7. Che, P., Wang, L., Li, Q. The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus. Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).
  8. Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis. Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).
  9. Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
  10. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
  11. Phillips, T., Jenkinson, L., McCrae, C., Thong, B., Unitt, J. Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds. J. Virol. Methods. 173, 182-188 (2011).
  12. Harvey, T. J., et al. Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivirus replicon particles. J. Virol. 78, 531-538 (2004).
  13. Puig-Basagoiti, F., et al. High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).
  14. Puig-Basagoiti, F., et al. Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 1320-1329 (2006).
  15. Duan, M., et al. In vitro and in vivo protection against the highly pathogenic H5N1 influenza virus by an antisense phosphorothioate oligonucleotide. Antivir. Ther. 13, 109-114 (2008).
  16. Ray, D., Shi, P. Y. Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development. Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).
  17. Severson, W. E., et al. High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2). J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).
  18. Severson, W. E., et al. Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library. J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).
  19. Bolken, T. C., et al. Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses. Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).
  20. Van Loock, M., et al. A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors. J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).
  21. Kampmann, T., et al. In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses. Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).
  22. Kirchmair, J., et al. Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques. Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

CPE-gebaseerde assaydosis-respons assaytime-of-addition assaycytopathisch effectcelviabiliteitsassayantivirale screeningEC50-bepalingCC50-metingwerkingsmechanisme
Testsystemen voor de identificatie van nieuwe antivirale middelen tegen Bluetongue virus
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.