Redding van recombinant Newcastle Disease Virus uit cDNA

Samenvatting

Newcastle Disease Virus (NDV) is uitgebreid bestudeerd in de afgelopen jaren om nieuwe vectoren te ontwikkelen voor vaccinatie en therapie, onder anderen. Deze studies zijn mogelijk gemaakt door technieken om recombinant virus te redden van cDNA, zoals hier beschreven.

Samenvatting

Newcastle disease virus (NDV), het prototype lid van de Avulavirus geslacht van de familie Paramyxoviridae ^1, is een niet-gesegmenteerde negatieve-sense, enkelstrengs, omhuld RNA-virus (Figuur 1) met potentiële toepassingen als vector voor vaccinatie en behandeling van menselijke ziekten. Een grondige verkenning van deze toepassingen is pas na de oprichting van reverse genetics technieken om recombinante virussen van plasmiden die hun volledige genoom als cDNA ^2-5 te redden mogelijk geworden. Virale cDNA kan gemakkelijk worden gemodificeerd in vitro met gebruikmaking van standaard klonering procedures om het genotype van het virus te veranderen en / of nieuwe transcriptie-eenheden omvatten. Redding van dergelijke genetisch gemodificeerde virussen een waardevol hulpmiddel om factoren die verschillende stadia van de infectie, en maakt de ontwikkeling en verbetering van vectoren voor de expressie en afgifte van antigenen begrijpenvoor vaccinatie en therapie. Hier beschrijven we een protocol voor de redding van recombinant NDVs.

Inleiding

Newcastle Disease Virus (NDV), een aviaire paramyxovirus die behoren tot het genus Avulavirus ^1, is een economisch relevant en dus op grote schaal onderzocht en bewaakt zoönoseverwekker, die ernstig kan beïnvloeden pluimveehouderij over de hele wereld. Hoewel het niet een menselijk pathogeen, NDV is ook grondig bestudeerd buiten het veld dierenarts zowel als model paramyxovirus en vanwege zijn zeer interessant, natuurlijke oncolytic eigenschappen ^6. Onderzoek naar NDV sterk geprofiteerd van de ontwikkeling van reverse genetics technieken voor enkelstrengs, niet-gesegmenteerde negatieve-sense RNA-virussen, voor het eerst beschreven voor ....

Protocol

1. Bereiding van zoogdiercellen (Figuur 4A, dag 1)

Split HEp-2-cellen of A549 de dag voor transfectie in platen met 6 putjes. Dichtheid van de cellen moet 80-90% confluentie bereikt de volgende dag. Meestal kan een confluente 100 mm schaal worden verdeeld in 8 putjes (ongeveer 1 x 10 ⁶ cellen per well). Voor elk virus worden gered, moet 2-4 verschillende bronnen zijn mogelijk en 2 extra bronnen voor de besturing pCAGGS-GFP en pCITE-GFP ^18, gericht op transfectie en MVA-T7 infectie-efficiënties bewaken, respectievelijk.

2. Infectie van zoogdiercellen met de recombinante Modifi....

Resultaten

Redding van NDV is een gevestigde procedure routinematig uitgevoerd in laboratoria die toegang tot de volledige cDNA van het virus. De intrinsieke stochastische aard van de methode maakt het moeilijk om 100% rescue efficiëntie. Controle op de eerste stappen van de werkwijze, speciaal de transfectie-efficiëntie en infectie met MVA-T7, helpt mogelijke problemen. Figuur 5A toont standaard transfectie en transfectie / infectie-efficiënties die genoeg om succesvol NDV redding zijn identificeren. Na het ronde.......

Discussie

Verschillende factoren moeten worden beschouwd om goede resultaten te bereiken, terwijl het redden van NDV. Ten eerste, de volledige lengte cDNA construct voor gebruik moet worden ontworpen om de functionele integratie van de nieuwe transgenen / wijzigingen in het NDV genoom toestaan. Dat betekent, zoals hierboven vermeld, dat (i) geschikte gen uiteinde (GE), intergene (IG) en gen start (GS) sequentie worden toegevoegd indien nodig, (ii) er zijn geen vermeende GE of GS sequenties in de vreemde gen, en (iii) de volledige.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
DMEM	CORNING Cellgro	10-013-CV	Elke leverancier
OptiMEM	GIBCO	31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019
35% Bovine Albumine (BA)	Sigma	232-936-2	Elke leverancier
Trypsine-EDTA	CORNING Cellgro	25-052-CI	Elke leverancier
Penicilline/Streptomycine (PS) 100x	CORNING Cellgro	30-002-CI	Elke leverancier
Fetaal bovien serum (FBS)	Hyclone	SH30070.03	Elke leverancier
Cellijnen A549-cellen (catalogusnummer CRL-185), HEp-2-cellen (catalogusnummer CRL-185), kippenembryofibroblasten (catalogusnummer CRL-12203) en eendenembryofibroblasten (catalogusnummer CCL-141) zijn verkrijgbaar bij de American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). Alle cellijnen worden onderhouden in een 37 °C incubator met 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS. Bevruchte kippeneieren Bevruchte kippeneieren kunnen worden verkregen bij Charles River Laboratories, Specific Pathogen Free Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) en worden op 37 °C bewaard. De levensvatbaarheid van de embryo's wordt beoordeeld met een eierkaars. Eieren worden geïnfecteerd wanneer ze 8-10 dagen oud zijn. Zowel infectie als oogst van de allantoïsche vloeistof gebeurt onder steriele omstandigheden. Alle eieren worden geautoclaveerd en weggegooid volgens standaard bioveiligheidsprotocollen in het laboratorium. Turkse rode bloedcellen (RBC) Turkse RBC kunnen worden gekocht bij Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA) en worden bewaard bij 4 °C. Om RBC voor HA-test voor te bereiden, was je 5 ml van de commerciële stock met 45 ml PBS 1x in een 50 ml conische buis. Centrifugeer gedurende 5 min bij 1.000 rpm en gooi voorzichtig het supernatant weg. Verdun het gepelletiseerde RBC 1:1.000 in PBS 1x voor een uiteindelijke concentratie van 0,5-1,0%. Gewassen RBC kunnen enkele dagen worden bewaard bij 4 °C. Plasmiden Plasmidenpreparaten worden verkregen met elk commercieel verkrijgbaar maxiprep-kit volgens de instructies van de fabrikant, verdund in ddH20 tot een uiteindelijke concentratie van 1 μg/µl en bewaard bij -20 °C. DNA-concentratie en -zuiverheid worden beoordeeld door spectrofotometrie bij 260 en 280 nm. Preparaten met een 260/280-verhouding hoger dan 1,8 worden beschouwd als van acceptabele kwaliteit voor het redden. Plasmide-DNA-kwaliteit wordt ook routinematig gecontroleerd door agarosegelchromatografie. Virussen Het beschreven protocol voor het redden van de lentogeen NDV-stam Hitchner B1 kan worden uitgevoerd onder bioveiligheidsniveau (BSL) 2-omstandigheden. De gemodificeerde Vaccinia Ankara die de T7 RNA-polymerase (MVA-T7) tot expressie brengt, werd beschreven34 en verkregen van Dr. Bernard Moss. Dit virus wordt gekweekt in confluente monolagen van kippenembryofibroblasten en getiteerd in zoogdier (A549 of HEp-2) cellen. NDV-stammen worden gekweekt in bevruchte kippeneieren en getiteerd door IFA met behulp van polyklonaal serum dat is opgewekt tegen gezuiverde virionen. Al het besmette materiaal moet veilig worden gesteriliseerd en worden weggegooid volgens standaard bioveiligheidsprocedures. Weefselkweekmedia en oplossingen: DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco's gemodificeerd Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal bovien serum (FBS) en Penicilline/Streptomycine (P/S): 445 ml van DMEM, 50 ml van hitte-geïnactiveerd FBS, 5 ml van 100x commerciële P/S-oplossing. Bewaar bij 4 °C. 10x Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS): 80 g van NaCl, 2 g van KCl, 11,5 g van Na2HPO4.7H2O, 2 g van KH2PO4. Voeg ddH2O toe tot 1 L. Stel de pH in op 7,3. Sterieliseer door autoclavering. Bewaar bij kamertemperatuur. 1x PBS: Verdun 10x PBS 1:10 met ddH2O. Sterieliseer door autoclavering en bewaar bij kamertemperatuur. 100x Ca/Mg : 1,327 g CaCl2.2H2O, 2,133 g MgCl2.6H2O en voeg ddH2O toe tot 100 ml. Autoclaveer en bewaar bij kamertemperatuur. 1x PBS/BA/PS: 50 ml van 10x Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclaveer en wanneer afgekoeld tot kamertemperatuur, voeg 5 ml 100x Penicilline/Streptomycine 3 ml 35% Bovine en 5 ml van 100x Ca/Mg toe. Bewaar bij 4 °C.