Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Redding van recombinant Newcastle Disease Virus uit cDNA

20K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50830

⸱

11 oktober 2013

 ,  , 
1Department of Microbiology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Global Health and Emerging Pathogens Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Department of Medicine, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine and Dentistry, University of Rochester

In dit artikel

Samenvatting

Newcastle Disease Virus (NDV) is uitgebreid bestudeerd in de afgelopen jaren om nieuwe vectoren te ontwikkelen voor vaccinatie en therapie, onder anderen. Deze studies zijn mogelijk gemaakt door technieken om recombinant virus te redden van cDNA, zoals hier beschreven.

Samenvatting

Newcastle disease virus (NDV), het prototype lid van de Avulavirus geslacht van de familie Paramyxoviridae 1, is een niet-gesegmenteerde negatieve-sense, enkelstrengs, omhuld RNA-virus (Figuur 1) met potentiële toepassingen als vector voor vaccinatie en behandeling van menselijke ziekten. Een grondige verkenning van deze toepassingen is pas na de oprichting van reverse genetics technieken om recombinante virussen van plasmiden die hun volledige genoom als cDNA 2-5 te redden mogelijk geworden. Virale cDNA kan gemakkelijk worden gemodificeerd in vitro met gebruikmaking van standaard klonering procedures om het genotype van het virus te veranderen en / of nieuwe transcriptie-eenheden omvatten. Redding van dergelijke genetisch gemodificeerde virussen een waardevol hulpmiddel om factoren die verschillende stadia van de infectie, en maakt de ontwikkeling en verbetering van vectoren voor de expressie en afgifte van antigenen begrijpenvoor vaccinatie en therapie. Hier beschrijven we een protocol voor de redding van recombinant NDVs.

Inleiding

Newcastle Disease Virus (NDV), een aviaire paramyxovirus die behoren tot het genus Avulavirus 1, is een economisch relevant en dus op grote schaal onderzocht en bewaakt zoönoseverwekker, die ernstig kan beïnvloeden pluimveehouderij over de hele wereld. Hoewel het niet een menselijk pathogeen, NDV is ook grondig bestudeerd buiten het veld dierenarts zowel als model paramyxovirus en vanwege zijn zeer interessant, natuurlijke oncolytic eigenschappen 6. Onderzoek naar NDV sterk geprofiteerd van de ontwikkeling van reverse genetics technieken voor enkelstrengs, niet-gesegmenteerde negatieve-sense RNA-virussen, voor het eerst beschreven voor hondsdolheid virus door Conzelmann en coleagues 2. Een verscheidenheid van genetisch gemodificeerde NDVs, dragen vreemde genen of aanpassingen van hun wild-type genoom zijn uitgebreid bestudeerd sinds die tijd. Werken met deze recombinante virussen is cruciaal geweest om verschillende virulentiefactoren karakteriseren niet alleen van NDV, maar ook van andere relevante human ziekteverwekkers zoals influenza A virus 7 - of de opkomende Nipah virus 8. Voorts zijn verschillende studies het gebruik van deze technieken voor de aangeboren antitumorale activiteit van NDV 6,9,10 verbeteren, meestal door het verbeteren van de immunostimulerende eigenschappen van het virus onderzocht. Andere betrokken onderzoeksgebied op recombinante NDVs heeft de generatie van kandidaat-vaccins tegen andere virale ziekten zoals influenza geweest 5,11,12, 13 HIV, mazelen 14, SARS 15 of dat door de respiratoire sincytial virus (RSV) 16. Tussen de verschillende opmerkelijke voordelen van NDV zijn het gebrek aan reeds bestaande immuniteit in humane populaties, de stabiliteit van het vreemde genetische inserts, weinig recombinatory activiteit en de hoge veiligheidsprofiel combinatie met de bovengenoemde natuurlijke immunostimulerende eigenschappen 17. Opvallend is ook het potentiële gebruik van recombinant bivalente vaccins in poultry, beschermend tegen zowel NDV en hoogpathogene aviaire influenza virussen 11,12. Dit kan een uitstekende manier om de kansen van de laatste verspreiding van wilde naar gedomesticeerde dieren, ook als bijdrage aan een mogelijke inter-specifieke sprong van de gevreesde vogelgriep bij de mens te voorkomen te verminderen zijn. Ten slotte heeft reporter expressie NDV gebruikt voor de evaluatie van aangeboren immuunresponsen evenals de identificatie van interferon antagonist gecodeerd door meerdere virussen 18-27.

Het proces van terugwinning van een recombinant, niet-gesegmenteerde negatieve RNA virus bestaat hoofdzakelijk op kunstmatig dwingen een virale replicatiecyclus in een producerende cel door transfectie van cDNA dat codeert voor de minimale infectieuze moleculaire machinerie, bekend als ribonucleoproteïne of RNP (figuur 2). De RNP's bestaan ​​uit het virale polymerase (P en L eiwitten), de nucleoproteïne (NP) en de volledige lengte antigenoom RNA van het virus. Dit RNA + antigenoom the template nodig voor het genereren van de complementaire RNA-genomen, die ook samen met de rest van de eiwitten van het virale RNP, recapituleert hetzelfde infectieuze complex dat een natuurlijk virus zou vrijgeven aan het cytoplasma van de cel na infectie (Figuur 2A ). Vanaf deze stap verder, kan de virale cyclus natuurlijk doorgaan en recombinante virions, inkapselen de gemodificeerde genomen, worden gegenereerd (Figuur 2B). Opmerkelijk, transfectie van de genomische cDNA in plaats van het antigenome cDNA sterk vermindert of volledig afschaft redding efficiëntie 2,28-30. Zelfs wanneer antigenome cDNA getransfecteerd, de efficiëntie van de inkapseling van recombinante RNA in RNP's in getransfecteerde cellen is waarschijnlijk erg laag. Hierdoor redding protocollen voor NDV bevatten vaak verschillende stappen voor de amplificatie van het aantal virale deeltjes die vrijkomen uit de oorspronkelijk getransfecteerde cellen door coculturing hen permissieve cellen en / of deinfectie van bebroede eieren.

Vóór de redding, kan het cDNA worden gemanipuleerd met standaard kloneringswerkwijzen om de gewenste wijzigingen genereren. Hoewel specifieke mutaties van de verschillende genproducten en regulerende sequenties van het virus onomwonden worden bereikt Zo veel gepubliceerde werk recombinant NDV is de toevoeging van een nieuwe transcriptie-eenheid vereist in het NDV genoom. Net als andere leden van de familie paramyxovirus, het NDV-genoom codeert acht verschillende eiwitten in zes transcriptionele eenheden die differentieel uitgedrukt afhankelijk van hun locatie ten opzichte van het 3'-uiteinde in een dalende helling kritiek voor de virale levenscyclus 1. Hierdoor moet de locatie van de nieuwe transcriptie-eenheid in het genoom zorgvuldig worden gekozen om een ​​evenwicht tussen expressie van het transgen en aantasting van virale replicatie te bereiken. Insertie van P en M-genen is het meest gebruikt, though andere sites zijn ook getest 13,31.

Ongeacht het inzetstuk, het klonen in NDV-cDNA moet een aantal regels om een ​​rescuable construct gegenereerd: (i) nieuwe gen worden opgenomen in de NDV-genoom onder controle van de geschikte signalen voor het virale RNA-afhankelijke RNA polymerase. Deze sequenties moeten stroomopwaarts van de nieuwe open leesraam (ORF) worden toegevoegd zodat de polymerase kan het einde van de vorige gen (GE) en het begin van de nieuwe transgen (GS) herkent, gescheiden door een nucleotide sequentie intergene (IG) . Toevoeging van een geldige Kozak (K) sequentie eukaryotische ribosomale translatie verbeteren wordt ook aanbevolen voor een betere vreemde eiwit expressie 32, (ii) de efficiënte replicatie van NDV, zoals voor de meeste leden van de familie Paramyxoviridae, is afhankelijk van de lengte genoom wordt veelvoud zes 33, daarom elke inbrengen in de NDV heeft deze "regel van zes" te volgen. Eventueel required extra nucleotiden kunnen stroomafwaarts worden toegevoegd de nieuwe ORF, en (iii) de volgorde van de transgen moet worden gecontroleerd om te vinden mogelijke GE en GS achtige sequenties die redding efficiëntie, transgene expressie en / of levensvatbaarheid virus zou kunnen schaden. Indien aanwezig moet deze sequenties worden verwijderd door stille mutagenese. Het genereren van recombinant volledige lengte cDNA volgende genoemde regels is de eerste stap om efficiënt produceren genetisch gemodificeerde NDV zoals hier beschreven.

In het systeem alle DNA constructen onder controle van de T7 RNA polymerase promoter (Figuur 3). Deze cytoplasmatische polymerase in trans door co-infectie met een recombinant gemodificeerd Vaccinia Ankara virus (MVA-T7) 34. Figuur 3A tonen de pNDV-B1 plasmide, dat de volledige lengte antigenome cDNA 5 codeert. Figuur 3B toont pTM1 plasmiden die NP, P en L ORF. Plasmiden pCITE-GFP, dat codeert, under de T7-promoter, het Green Fluorescent Protein (GFP) en pCAGGS GFP 18, die dezelfde ORF codeert onder de kippen beta-actine promotor 35, worden gebruikt als controles. In dit protocol tonen we de procedure te redden recombinant NDV uit het cDNA van de lentogene NDV-stam Hitchner B1 5 (figuur 4).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereiding van zoogdiercellen (Figuur 4A, dag 1)

Split HEp-2-cellen of A549 de dag voor transfectie in platen met 6 putjes. Dichtheid van de cellen moet 80-90% confluentie bereikt de volgende dag. Meestal kan een confluente 100 mm schaal worden verdeeld in 8 putjes (ongeveer 1 x 10 6 cellen per well). Voor elk virus worden gered, moet 2-4 verschillende bronnen zijn mogelijk en 2 extra bronnen voor de besturing pCAGGS-GFP en pCITE-GFP 18, gericht op transfectie en MVA-T7 infectie-efficiënties bewaken, respectievelijk.

2. Infectie van zoogdiercellen met de recombinante Modified Vaccinia Ankara virus dat het bacteriofaag T7 RNA polymerase (MVA-T7) (Figuur 4A, Dag 2)

  1. Warmen PBS 1x/BA/PS en media bij 37 ° C.
  2. Was de cellen tweemaal met 1 ml PBS 1x/BA/PS.
  3. Infect gekweekte zoogdiercellen met het MVA-T7 virus bij een multipliciteit van infectie (MOI) Van 1 pfu / cel in een eindvolume van 200 ul in PBS / BA / HS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
  4. Tijdens virale infectie incubatie bereiden de transfectie mix zoals beschreven in 3.

3. Transfectie van zoogdiercellen (Figuur 4A, Dag 2)

  1. Bereiding van Lipofectamine: Meng 1-2 ug LPF2000 met 250 ul per OptiMEM reddingspoging en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
  2. Voorbereiding van DNA: Maak een plasmide cocktail voor elke redding in 50 ul van OptiMEM. Voeg 0,4 ug pTM1-NP, 0,2 ug pTM1-P en 0,2 ug pTM1-L per buis. Voeg 1 pg van de volledige lengte cDNA kloon van NDV worden gered aan elke buis. Bereiden ook twee controle transfecties, een met 2 ug pCAGGS-GFP (tot transfectie-efficiëntie te controleren) en de andere met 2 ug pCITE-GFP (om te controleren T7 polymerase gedreven expressie door de MVA-T7).
  3. Na de LPF2000-OptiMEM oplossing werd 5 min voorgeïncubeerd (stap 3.1), voeg 250pl van de oplossing van het DNA buizen (stap 3.2) en incubeer gedurende 20-30 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Na incubatie met MVA-T7, verwijder de virusinoculum door aspiratie en te vervangen door de DNA-LPF2000 transfectiemengsel (stap 3.3).
  5. Voeg 1 ml DMEM 10% FBS / PS elk gerecht.
  6. Incubeer de geïnfecteerde / getransfecteerde cellen gedurende 6-8 uur (of overnacht) bij 37 ° C, 5% CO2 en vervang de transfectie media met 1,5 ml vers DMEM 10% FBS / PS.
  7. Op 24 uur na transfectie, kan controleputjes onder een fluorescentie microscoop worden waargenomen transfectie efficiëntie (pCAGGS-GFP) en T7 polymerase activiteit (pCITE-GFP) (figuur 5A) beoordelen. Ga verder met de co-cultuur van de geïnfecteerde / getransfecteerde cellen met aviaire fibroblasten zoals hieronder beschreven.

4. Co-cultuur van zoogdiercellen met vogelcellen (Figuur 4A, Dag 3)

Meestal een confluente 100 mm weefselkweek schotel van kip (CEF) or eend (DEFS) fibroblasten wordt gebruikt per twee getransfecteerd putten. Zorg ervoor dat u voor te bereiden, op voorhand, genoeg 100 mm weefselkweek gerechten van vogelcellen per alle reddingspogingen. Voor doeltreffende redding van het virus wordt DMEM 10% FBS / HS medium aangevuld met 5% van allantoïsvloeistof en 30 mM MgCl2. Op dit moment, 24 uur pi, zoogdiercellen kan beginnen met cytopathisch effect (CPE) door MVA-T7 infectie asevident in figuur 5A.

  1. Warmen PBS 1x en media tot 37 ° C.
  2. Was zoogdiercellen, 2x met 1 ml PBS 1x.
  3. Trypsinize zoogdiercellen met 0,2 ml EDTA-trypsine tot ze losgemaakt. Resuspendeer de cellen in 1 ml DMEM 10% FBS / PS, 5% allantoïsvloeistof, 30 mM MgCl2 en overbrengen in een 100 mm weefselkweekplaat. Voeg 3 ml van dezelfde media.
  4. Was vogelcellen, tweemaal met 4 ml PBS 1x.
  5. Trypsinize aviaire cellen met 1 ml trypsine-EDTA en incubeer gedurende 1-2 minuten bij 37 ° C tot cellen los. Hersuspenderen the cellen toevoegen van 8 ml DMEM 10% FBS / PS, 5% allantoïsvloeistof, 30 mM MgCl2 en 4 ml van de cellen getrypsiniseerd de zoogdiercellen in de co-gekweekt 100 mm weefselkweekplaat een totaal volume van 8 ml (4 ml zoogdieren, 4 ml vogelcellen).
  6. Schud de hand van de co-gekweekte cellen in de 100 mm schaal teneinde een gelijkmatige en dan weer in de incubator bij 37 ° C gedurende 3-4 dagen. De criteria voor het infecteren eieren 3 of 4 dagen na co-cultuur van zoogdiercellen en vogelcellen afhankelijk van hoeveel cytopathisch effect (celronding, dood, loslating van het oppervlak, enz..) Waargenomen in het MVA-T7 virale infectie.

5. Infectie van de kip met embryo's Eieren (Figuur 4A, Dagen 6-7)

  1. Na 3-4 dagen co-cultuur van zoogdiercellen en vogelcellen, verwijdert 1 ml van de weefselkweek supernatant en toevoegen aan een Eppendorf buis.
  2. Centrifugeer de weefselkweek supernatant gedurende 1 min bij 12.000 rpm in een benchtop centrifuge om cellulair afval te verwijderen.
  3. Kaars de eieren met behulp van een lichte candling box om de interface tussen de luchtzak en de allantoïsholte zien. Maak een merkteken op het raakvlak grens vermijden bloedvat lokalisatie. Spray 70% ethanol over de eieren om steriele omstandigheden vast te stellen. Maak voorzichtig een gat in de eierschaal op de gemarkeerde plaats en beënt 500 pl van de supernatant met een insuline (1 ml) spuit, richten de naald verticaal en direct in de allantoïsholte. (Figuur 4B).
  4. Dicht de nick in de eischaal met gesmolten was of paraffine.
  5. Incubeer de eieren gedurende 2-3 dagen bij 37 ° C.

6. Oogst van allantoïsvocht van besmette kip met embryo's Eieren (Figuur 4A, Dagen 8-10)

  1. Incubeer de besmette eieren 2-4 uur of overnacht bij 4 ° C om kippenembryo's te doden en stollen van het bloed.
  2. Spuit de eieren met 70% ethanol (tot steriele omstandigheden te handhaven).
  3. Tik op de apicale gedeelte van het ei, over de luchtspouw, met een lepel zorgvuldig. Zodra de eierschaal wordt gekraakt, verwijdert u de fragmenten met een tang en volledig het allantoïs membraan bloot.
  4. Expose de allantoïsholte door het uitsnijden van het allantoïs membraan met een tang en schaar, schade aan de bloedvaten en de dooier vermijden.
  5. Duw onderaan de embryo met een spatel en het verzamelen van de omhoog stromende allantoïsvloeistof (8-12 ml per ei) met een pipet 10 ml. Voorkom beschadiging van de dooier membraan. Breng de allantoïsvocht om een ​​15 ml centrifugebuis op ijs (gebruik een tube per ei).
  6. Verduidelijken allantoïsvloeistof door centrifugeren gedurende 5 min bij 1500 rpm. Breng het supernatant naar een nieuwe buis zonder de pellet te verstoren.
  7. WINKEL monsters bij 4 ° C gedurende 1 week, tot controle ervan aanwezigheid van NDV bij hemagglutinatie assay.

7. Hemagglutinatie (HA) Assay

De aanwezigheid van virus in de Allantoic vloeistof uit besmette eieren kunnen macroscopisch worden bepaald door hun vermogen om kalkoen rode bloedcellen (RBC) hemagglutinate. Bij NDV ongeveer 10 6 plaque vormende eenheden (pfu) per ml nodig zijn om een positief signaal in de HA test geven. HA assays zijn in V-bodem 96-putjes uitgevoerd. Negatieve (PBS 1x, niet-geïnfecteerde allantoïsvloeistof) als positief (allantoïsvocht van elke NDV virus) controlemonsters moet altijd worden opgenomen in een HA-test te valideren. Om een ​​HA-test uit te voeren:

  1. Pipetteer 50 ul PBS 1x per putje in een V-bodem 96-well plaat.
  2. Pipetteer 50 ul van de allantoïsvloeistof monsters in de putjes van de eerste kolom van de plaat. Voer 2-voudige seriële verdunningen door de rest van de plaat en de laatste extra 50 ul van putten in de laatste kolom verwijderen.
  3. Doseer 50 ul van 0,5% kalkoen RBC in PBS 1x per well. Schud de plaat door te tikken.
  4. Incubeer de plaat staan ​​bij 4 ° C (of ijs) fof 30-45 minuten of totdat een heldere pellet wordt gevormd in de negatieve controle wells.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Redding van NDV is een gevestigde procedure routinematig uitgevoerd in laboratoria die toegang tot de volledige cDNA van het virus. De intrinsieke stochastische aard van de methode maakt het moeilijk om 100% rescue efficiëntie. Controle op de eerste stappen van de werkwijze, speciaal de transfectie-efficiëntie en infectie met MVA-T7, helpt mogelijke problemen. Figuur 5A toont standaard transfectie en transfectie / infectie-efficiënties die genoeg om succesvol NDV redding zijn identificeren. Na het ronde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Verschillende factoren moeten worden beschouwd om goede resultaten te bereiken, terwijl het redden van NDV. Ten eerste, de volledige lengte cDNA construct voor gebruik moet worden ontworpen om de functionele integratie van de nieuwe transgenen / wijzigingen in het NDV genoom toestaan. Dat betekent, zoals hierboven vermeld, dat (i) geschikte gen uiteinde (GE), intergene (IG) en gen start (GS) sequentie worden toegevoegd indien nodig, (ii) er zijn geen vermeende GE of GS sequenties in de vreemde gen, en (iii) de volledige...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Adolfo García-Sastre is een uitvinder van octrooien op recombinante NCD-virussen die eigendom zijn van de Icahn School van Geneeskunde bij de berg Sinaï.

Dankbetuigingen

Auteurs willen graag naar het verleden en de huidige leden te bedanken in de laboratoria van Drs. Peter Palese en Adolfo García-Sastre voor de ontwikkeling van NDV reverse genetics technieken en voor technische ondersteuning. Onderzoek in Newcastle disease-virus in AG-S laboratorium wordt gedeeltelijk gefinancierd door NIAD verlenen R01AI088770 en door het Department of Homeland Security Science & Technology Center of Excellence voor opkomende en Zoonotic dierziekten (CEEZAD, award nummer 2010-ST-061-AG001). Onderzoek in LM-S laboratorium wordt gefinancierd door de NIH subsidies RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, de NIAID Centers of Excellence voor Influenza Onderzoek en Surveillance (HHSN266200700008C), en de Universiteit van Rochester Centrum voor Biodefense Immune Modeling (HHSN272201000055C) .

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DMEMCORNING Cellgro10-013-CVElke leverancier
OptiMEMGIBCO31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000)Invitrogen11668-019
35% Bovine Albumine (BA)Sigma232-936-2Elke leverancier
Trypsine-EDTACORNING Cellgro25-052-CIElke leverancier
Penicilline/Streptomycine (PS) 100xCORNING Cellgro30-002-CIElke leverancier
Fetaal bovien serum (FBS)HycloneSH30070.03Elke leverancier

Cellijnen
A549-cellen (catalogusnummer CRL-185), HEp-2-cellen (catalogusnummer CRL-185), kippenembryofibroblasten (catalogusnummer CRL-12203) en eendenembryofibroblasten (catalogusnummer CCL-141) zijn verkrijgbaar bij de American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). Alle cellijnen worden onderhouden in een 37 °C incubator met 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS.
Bevruchte kippeneieren
Bevruchte kippeneieren kunnen worden verkregen bij Charles River Laboratories, Specific Pathogen Free Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) en worden op 37 °C bewaard. De levensvatbaarheid van de embryo's wordt beoordeeld met een eierkaars. Eieren worden geïnfecteerd wanneer ze 8-10 dagen oud zijn. Zowel infectie als oogst van de allantoïsche vloeistof gebeurt onder steriele omstandigheden. Alle eieren worden geautoclaveerd en weggegooid volgens standaard bioveiligheidsprotocollen in het laboratorium.
Turkse rode bloedcellen (RBC)
Turkse RBC kunnen worden gekocht bij Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA) en worden bewaard bij 4 °C. Om RBC voor HA-test voor te bereiden, was je 5 ml van de commerciële stock met 45 ml PBS 1x in een 50 ml conische buis. Centrifugeer gedurende 5 min bij 1.000 rpm en gooi voorzichtig het supernatant weg. Verdun het gepelletiseerde RBC 1:1.000 in PBS 1x voor een uiteindelijke concentratie van 0,5-1,0%. Gewassen RBC kunnen enkele dagen worden bewaard bij 4 °C.
Plasmiden
Plasmidenpreparaten worden verkregen met elk commercieel verkrijgbaar maxiprep-kit volgens de instructies van de fabrikant, verdund in ddH20 tot een uiteindelijke concentratie van 1 μg/µl en bewaard bij -20 °C. DNA-concentratie en -zuiverheid worden beoordeeld door spectrofotometrie bij 260 en 280 nm. Preparaten met een 260/280-verhouding hoger dan 1,8 worden beschouwd als van acceptabele kwaliteit voor het redden. Plasmide-DNA-kwaliteit wordt ook routinematig gecontroleerd door agarosegelchromatografie.
Virussen
Het beschreven protocol voor het redden van de lentogeen NDV-stam Hitchner B1 kan worden uitgevoerd onder bioveiligheidsniveau (BSL) 2-omstandigheden. De gemodificeerde Vaccinia Ankara die de T7 RNA-polymerase (MVA-T7) tot expressie brengt, werd beschreven34 en verkregen van Dr. Bernard Moss. Dit virus wordt gekweekt in confluente monolagen van kippenembryofibroblasten en getiteerd in zoogdier (A549 of HEp-2) cellen. NDV-stammen worden gekweekt in bevruchte kippeneieren en getiteerd door IFA met behulp van polyklonaal serum dat is opgewekt tegen gezuiverde virionen. Al het besmette materiaal moet veilig worden gesteriliseerd en worden weggegooid volgens standaard bioveiligheidsprocedures.
Weefselkweekmedia en oplossingen:
DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco's gemodificeerd Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal bovien serum (FBS) en Penicilline/Streptomycine (P/S): 445 ml van DMEM, 50 ml van hitte-geïnactiveerd FBS, 5 ml van 100x commerciële P/S-oplossing. Bewaar bij 4 °C.
10x Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS): 80 g van NaCl, 2 g van KCl, 11,5 g van Na2HPO4.7H2O, 2 g van KH2PO4. Voeg ddH2O toe tot 1 L. Stel de pH in op 7,3. Sterieliseer door autoclavering. Bewaar bij kamertemperatuur.
1x PBS: Verdun 10x PBS 1:10 met ddH2O. Sterieliseer door autoclavering en bewaar bij kamertemperatuur.
100x Ca/Mg : 1,327 g CaCl2.2H2O, 2,133 g MgCl2.6H2O en voeg ddH2O toe tot 100 ml. Autoclaveer en bewaar bij kamertemperatuur.
1x PBS/BA/PS: 50 ml van 10x Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclaveer en wanneer afgekoeld tot kamertemperatuur, voeg 5 ml 100x Penicilline/Streptomycine 3 ml 35% Bovine en 5 ml van 100x Ca/Mg toe. Bewaar bij 4 °C.

Referenties

  1. Lamb, R. A., Parks, G. D. Fields Virology. Howley, P. H., Knipe, D. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1689 (2007).
  2. Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. EMBO J. 13, 4195-4203 (1994).
  3. Peeters, B. P., de Leeuw, O. S., Koch, G., Gielkens, A. L. Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA: evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence. J. Virol. 73, 5001-5009 (1999).
  4. Romer-Oberdorfer, A., Mundt, E., Mebatsion, T., Buchholz, U. J. Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA. J. Gen. Virol. 80 (Pt 11), 2987-2995 (1999).
  5. Nakaya, T., et al. Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector. J. Virol. 75, 11868-11873 (2001).
  6. Zamarin, D., Palese, P. Oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy: old challenges and new directions. Future Microbiol. 7, 347-367 (2012).
  7. Park, M. S., Garcia-Sastre, A., Cros, J. F., Basler, C. F. Newcastle disease virus V protein is a determinant of host range restriction. J. Virol. 77, 9522-9532 (2003).
  8. Park, M. S., et al. Newcastle disease virus (NDV)-based assay demonstrates interferon-antagonist activity for the NDV V protein and the Nipah virus V, W, and C proteins. J. Virol. 77, 1501-1511 (2003).
  9. Zamarin, D., et al. Enhancement of oncolytic properties of recombinant newcastle disease virus through antagonism of cellular innate immune responses. Mol. Ther. 17, 697-706 (2009).
  10. Vigil, A., et al. Use of reverse genetics to enhance the oncolytic properties of Newcastle disease virus. Cancer Res. 67, 8285-8292 (2007).
  11. Swayne, D. E., et al. Recombinant paramyxovirus type 1-avian influenza-H7 virus as a vaccine for protection of chickens against influenza and Newcastle disease. Avian Dis. 47, 1047-1050 (2003).
  12. Park, M. S., Steel, J., Garcia-Sastre, A., Swayne, D., Palese, P. Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8203-8208 (2006).
  13. Carnero, E., et al. Optimization of human immunodeficiency virus gag expression by newcastle disease virus vectors for the induction of potent immune responses. J. Virol. 83, 584-597 (2009).
  14. Kim, D., et al. Induction of type I interferon secretion through recombinant Newcastle disease virus expressing measles virus hemagglutinin stimulates antibody secretion in the presence of maternal antibodies. J. Virol. 85, 200-207 (2011).
  15. DiNapoli, J. M., et al. Newcastle disease virus, a host range-restricted virus, as a vaccine vector for intranasal immunization against emerging pathogens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9788-9793 (2007).
  16. Martinez-Sobrido, L., et al. Protection against respiratory syncytial virus by a recombinant Newcastle disease virus vector. J. Virol. 80, 1130-1139 (2006).
  17. Bukreyev, A., Collins, P. L. Newcastle disease virus as a vaccine vector for humans. Curr. Opin. Mol. Ther. 10, 46-55 (2008).
  18. Martinez-Sobrido, L., Zuniga, E. I., Rosario, D., Garcia-Sastre, A., de la Torre, J. C. Inhibition of the type I interferon response by the nucleoprotein of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 80, 9192-9199 (2006).
  19. Jennings, S., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weber, F., Kochs, G. Thogoto virus ML protein suppresses IRF3 function. Virology. 331, 63-72 (2005).
  20. Kochs, G., Garcia-Sastre, A., Martinez-Sobrido, L. Multiple anti-interferon actions of the influenza A virus NS1 protein. J. Virol. 81, 7011-7021 (2007).
  21. Munoz-Jordan, J. L., et al. Inhibition of alpha/beta interferon signaling by the NS4B protein of flaviviruses. J. Virol. 79, 8004-8013 (2005).
  22. Cardenas, W. B., et al. Ebola virus VP35 protein binds double-stranded RNA and inhibits alpha/beta interferon production induced by RIG-I signaling. J. Virol. 80, 5168-5178 (2006).
  23. Mibayashi, M., et al. Inhibition of retinoic acid-inducible gene I-mediated induction of beta interferon by the NS1 protein of influenza A virus. J. Virol. 81, 514-524 (2007).
  24. Kopecky-Bromberg, S. A., Martinez-Sobrido, L., Frieman, M., Baric, R. A., Palese, P. Severe acute respiratory syndrome coronavirus open reading frame (ORF) 3b, ORF 6, and nucleocapsid proteins function as interferon antagonists. J. Virol. 81, 548-557 (2007).
  25. Rose, K. M., Elliott, R., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. Murine coronavirus delays expression of a subset of interferon-stimulated genes. J. Virol. 84, 5656-5669 (2010).
  26. Roth-Cross, J. K., Martinez-Sobrido, L., Scott, E. P., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. Inhibition of the alpha/beta interferon response by mouse hepatitis virus at multiple levels. J. Virol. 81, 7189-7199 (2007).
  27. Andersson, I., et al. Crimean-Congo hemorrhagic fever virus delays activation of the innate immune response. J. Med. Virol. 80, 1397-1404 (2008).
  28. Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).
  29. Kato, A., et al. Initiation of Sendai virus multiplication from transfected cDNA or RNA with negative or positive sense. Genes Cells. 1, 569-579 (1996).
  30. Durbin, A. P., et al. Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA. Virology. 235, 323-332 (1997).
  31. Zhao, H., Peeters, B. P. Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication. J. Gen. Virol. 84, 781-788 (2003).
  32. Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. J. Mol. Biol. 196, 947-950 (1987).
  33. Calain, P., Roux, L. The rule of six, a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA. J. Virol. 67, 4822-4830 (1993).
  34. Wyatt, L. S., Moss, B., Rozenblatt, S. Replication-deficient vaccinia virus encoding bacteriophage T7 RNA polymerase for transient gene expression in mammalian cells. Virology. 210, 202-205 (1995).
  35. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  36. Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W. A. Product review. New mammalian expression vectors. Nature. 348, 91-92 (1990).
  37. Conzelmann, K. K. Reverse genetics of mononegavirales. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 283, 1-41 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Recombinant virusreddingreverse geneticatransfectie van zoogdiercellenco-cultuur van aviaire cellengeëmbryoneerde kippeneierenhemagglutinine-assayT7-polymerasesysteemplasmid-DNA-transfectievirusamplificatie
Redding van recombinant Newcastle Disease Virus uit cDNA
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.