Eencellige micro-injectie voor mobiele Communicatie Analyse

Summary

We beschrijven hier hoe je een eencellige micro-injectie van Lucifer Yellow uit te voeren om cellulaire communicatie via gap-junctions te visualiseren in levende cellen, en een aantal nuttige tips. We verwachten dat dit artikel iedereen zal helpen om de mate van cellulaire koppeling te evalueren door functionele gap junctions. Alles hier beschreven kan zijn, in principe, aangepast aan andere fluorescente kleurstoffen met een molecuulgewicht onder 1000 Dalton.

Abstract

Gap junctions zijn intercellulaire kanalen die de communicatie van naburige cellen mogelijk maken. Deze communicatie hangt af van de bijdrage van een hemikanaal door elke naburige cel om de gap junction te vormen. In zoogdiercellen wordt het hemikanaal gevormd door zes connexines, monomeren met vier transmembraane domeinen en een C en N terminaal in het cytoplasma. Gap junctions staan de uitwisseling van ionen, tweede boodschappers en kleine metabolieten toe. Bovendien spelen ze een belangrijke rol in vele vormen van cellulaire communicatie binnen fysiologische processen zoals synaptische transmissie, hartcontractie, celgroei en differentiatie. We beschrijven hoe je een micro-injectie van een enkele cel van Lucifer Yellow kunt uitvoeren om cellulaire communicatie via gap-junctions in levende cellen te visualiseren. Het wordt verwacht dat in functionele gap junctions de kleurstof zal diffunderen van de geladen cel naar de verbonden cellen. Het is een zeer nuttige techniek om gap junctions te bestuderen, aangezien je de diffusie van de fluorescentie in real time kunt evalueren. We bespreken hoe je de cellen en de micropipet kunt voorbereiden, hoe je een micromanipulator kunt gebruiken en een laag moleculair gewichtsfluorescente kleurstof in een epitheelcel lijn kunt injecteren.

Introduction

Gap junctions zijn intercellulaire kanalen die de onderlinge communicatie mogelijk maken tussen naburige cellen ^1. Deze mededeling verbindt twee of meer naburige cellen, waarbij elk bijdraagt ​​met een connexon of hemikanaal aan de intercellulaire kanaal te vormen. In zoogdiercellen is de connexon gevormd door zes connexines, monomeren met vier transmembraandomeinen en een C- en N-terminale binnen het cytoplasma ^2. Gap junctions niet alleen mogelijk de stroom van ionen, second messengers en kleine metabolieten, maar ook bij vele vormen van cellulaire communicatie in vele fysiologische processen, zoals synaptische transmissie, hart contractie, celgroei en differentiatie ^{3, 4, 5, 6, 7, 8.} Daarnaast zijn gap junctions geassocieerd metveel ziekten waaronder kanker ^{9, 10, 11} spieratrofie, sommige genetische ziekten en demyelineringsziekten ^12.

Dit type intercellulaire overspraak kan worden geëvalueerd door verscheidene werkwijzen ^{13, 14, 15, 16.} In dit artikel laten we zien hoe een eencellige micro-injectie van Lucifer Yellow uit te voeren om cellulaire communicatie via gap-junctions te visualiseren in levende cellen. We bespreken hoe de cellen en de micropipet, het gebruik van de micromanipulator en de injectie van Lucifer Yellow kleurstof in een thymus epitheelcellijn bereiden. Meestal kan deze experimentele procedure wordt geanalyseerd door de gemiddelde geschakelde cellen met de cel geladen met kleurstof. Bovendien kan deze methode worden gebruikt met andere fluorescente kleurstoffen met een molecuulgewicht onder de spleetknooppunten cut-off die ongeveer 1.000 dalton.

Protocol

1. Bereiding van Cellen

1. Handhaaf een kweek van een thymus epitheelcellijn (IT76M1) of te testen cel in een incubator (37 ° C / 5% CO _2).
2. Was de cellen met PBS 1x (herhaal dit item 3x).
3. Trypsine toevoegen aan de cellen gedurende 5 min.
4. voeg medium (tweemaal de hoeveelheid trypsine toegevoegd punt 1,3) met 10% FBS (foetaal runderserum) aan de cellen met trypsine en gecentrifugeerd (800 xg gedurende 5 minuten).
5. Tel de cellen in een hemocytometer.
6. Pas de dichtheid van cellen volgens het celtype als de cellen in nauw contact met elkaar te koppelen toelaten. Opmerking: In ons geval gebruikten we 3 x 10 ⁵ cellen per 35 mm petrischaal.

2. Micropipet Voorbereiding

1. Trek de micropipet zoals opgegeven in een glazen micropipet capillair (1,5 mm diameter) tot een uiteindelijke diameter 0,2 urn teneinde een uiteindelijke weerstand van ongeveer 30 MQ verwezenlijkenf "> ^{17, 18.}
   LET OP: U kunt de injectie pipetten worden gekocht. De weerstand is afhankelijk van de celgrootte, bijvoorbeeld een hogere weerstand micro-elektrode zou noodzakelijk acinaire cellen, bijvoorbeeld (100-150 MQ) ^19. Een gemeenschappelijk probleem dat kan optreden is het neerslaan van Lucifer Yellow oplossing die vervolgens kan belemmeren de micropipet en kan vóór filtratie of centrifugeren vereisen. Vóór injectie dient de micropipet onder de microscoop worden geanalyseerd om te detecteren of er een obstructie of een soort storing ^13. De micropipet kan worden getest door het injecteren LY met de micropipet tip in een zoutoplossing.

3. Het testen van de Micropipet

1. Bereid de Lucifer Yellow oplossing (5%) in 150 mmol / L LiCI en laadt de micropipet met een injectiespuit of vulmateriaal (gestoken LY Solution).
2. Plaats de micropipette via 35 mm petrischaal met IT76M1 cellen op de micro-injectie werkstation en dompel het uiteinde van de glazen micropipet in het celmedium. Focus op de micropipet en het uitvoeren van een kleurstof stroomt-test door het toepassen van een puls.

4. Single-cell Lucifer Yellow Microinjection

1. Focus de microscoop recht boven de cellaag behulp van een hoge magni fi catie (40X), daarna langzaam de pipet om de cellen met behulp van de micromanipulator.
2. Doorboord doelcel wanneer de punt dicht genoeg bij de celmembraan raken, en breng een kleine hyperpolarizing puls naar de LY introduceren in de cel. De aangelegde spanning is afhankelijk van de netto lading van de kleurstof te injecteren. Alternatief kunnen andere kleurstoffen worden gebruikt met deze techniek zoals getoond in tabel 1.
   Opmerking: In principe kan elk hydrofiel kleurstof met MW lager dan 1 kDa kunnen worden gebruikt. De overdrachtssnelheid kan variëren afhankelijk van het gewicht en hydrofiliciteit. Bovendien, unspecific overdracht van de gebruikte kleurstof worden geëvalueerd.
3. Leg cel beelden 3 minuten na kleurstof injectie of een kleine film met time lapse microscopie (30 fps).
   LET OP: Een soortgelijke benadering kan worden gezien in Hitomi et al (2015) ^20. Om de communicatie van intercellulaire bruggen (incomplete mitose), een co-injectie van rhodamine dextran (2-10 kDa), die niet via gap junctions heen gaan maar gaat door intercellulaire bruggen en bepaalde nanotubules aanbevolen voorkomen zoals weergegeven in figuur 2 .

Results

Thymus epitheel cellijn IT-76MI werden gebruikt om kleurstof koppeling te evalueren door gap junctions als deze cellen werden beschreven functionele gap junctions gevormd door connexine 43 ²¹ uit te drukken. Figuur 1 toont de injectie van Lucifer Yellow wanneer toegepast in een cel onder de punt van de pipet. Na enkele minuten, verbonden cellen fluorescentie (sterretjes) die de diffusie van de fluorescerende kleurstof via gap junctions. Het aantal cellen en de tij...

Discussion

Om de aanwezigheid van functionele intercellulaire gap junction, het gebruik van tracers die ondoorlaatbaar membraan zijn te verifiëren, maar permeabel door intercellulaire kanalen ¹⁶ vereist. Fluoresceïne, de eerste fluorescerende kleurstof te observeren cel-cel koppeling ^22, permeabel tussen niet junctional ³ membranen en is derhalve vervangen door Lucifer Yellow ¹⁵ kleurstof. Op dit moment, op zoek naar de beste keuze uit ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lucifer geel	Sigma	L0259
Lithiumchloride	Sigma	L4408
PBS-tabletten	Sigma	P4417
RPMI	Sigma	R4130
Rund foetaal serum	Cultilab
Trypsine	Sigma	T4799
Vibratiegeïsoleerde tafel	Newport	VH3036W-OPT	Een vibratiegeïsoleerde tafel is nodig om de experimenten te beschermen tegen trillingen en celbeschadiging te voorkomen
Micromanipulator	Narishige	MMO-203	Deze apparatuur maakt nauwkeurige aanpassingen van de micropipet mogelijk, wat nodig is voor cel micro-injectie.
Stroomgenerator	Digitimer	DS2	Om de kleurstofstroom door de micropipet te produceren, werd een stroom onder één nano ampere gegeven met behulp van een stroomgenerator met een elektrode in de micropipet of een versterker met een capacitieve compensatiecircuit (oude electrometer) of stroominjectiefuncties van nieuwe patch clamp versterkers, en de aardedraad ondergedompeld in de plaat. Als alternatief kan de kleurstof worden geïnjecteerd door een pneumatische micro-injector, volgens de fabrieksaanbevelingen.