High Throughput micro-injecties van Sea Urchin Zygotes

Samenvatting

Microinjectie is een veelgebruikte techniek gebruikt om DNA constructen mRNA, morfolino antisense oligonucleotiden of andere behandelingen te leveren in eieren, embryo's en cellen van verschillende soorten.

Samenvatting

Micro-injectie in cellen en embryo is een veelgebruikte techniek die wordt gebruikt om een ​​groot aantal biologische processen te bestuderen. Bij deze werkwijze wordt een kleine hoeveelheid behandelingsoplossing in een micro-injectie naald die wordt gebruikt fysiek afzonderlijke injecteren geïmmobiliseerde cellen of embryo geladen. Ondanks de behoefte aan initiatieopleiding deze procedure voor high-throughput levering, microinjectie biedt maximale efficiëntie en reproduceerbare levering van een breed scala van behandelende oplossingen (waaronder complexe mengsels van monsters) in cellen, eicellen of embryo's. Toepassingen op micro-injecties bevatten aflevering van DNA-constructen, mRNA, recombinante eiwitten, gain of function, en functieverlies reagentia. Fluorescente of colorimetrische kleurstof wordt toegevoegd aan de geïnjecteerde oplossing directe visualisatie van efficiënte levering en een instrument voor betrouwbare normalisatie van de hoeveelheid van de geleverde oplossing mogelijk. De beschreven methode maakt micro-injectie van 100-400 zee-egel zygotes binnen 10-15 minuten.

Inleiding

Efficiënte en reproduceerbare behandeling levering is een van de belangrijkste methodologische uitdagingen voor onderzoekers. Verscheidene methoden zijn vastgesteld om behandelingsoplossingen tijdelijk te leveren in de eieren, embryo's en cellen. Deze methoden omvatten elektroporatie (gebaseerd op het genereren van tijdelijke poriën in het membraan met behulp van korte elektrische pulsen) ^1,2, lipofectie (leverbaar door de fusie van behandeling met liposomen met het membraan) ^1, bombardement met microdeeltjes ¹ (DNA wordt geprecipiteerd op het micron -sized metalen deeltjes die vervolgens worden gebruikt om de cellen bij hoge snelheid doordringen) en transductie (virus wordt gebruikt als transportmiddel van transgenen). Momenteel, micro-injectie is de enige benadering die het voordeel biedt dat iedere oplossing met 100% rendement met minimale reagentia bezit. Bovendien kan een enkele injectie oplossing bestaat uit een complexe cocktail van behandelingen. Deze techniek is gebruikt om succesvollely microinject de eieren en embryo's uit tal van soorten, zoals zee-egels ^3,4, zebravis ^{5, 6} muis, kikker ^7, en runderen ^8, alsmede enkele cellen in het weefsel cultuur ^9. Single blastomeren injecties in latere ontwikkelingsstadia zijn ook uitgevoerd ^10-12.

De huidige werkwijzen voor micro-injecties zijn gebaseerd op de druk-injectiemethode de aanvankelijk beschreven door Hiramoto ^10, maar heeft grote vooruitgang geboekt optimalisatie van dit proces. Uitstekende micro-injectie technieken zijn elders ¹¹ beschreven, en hier beschrijven we een van de specifieke methoden die momenteel gebruikt wordt om zee-egel (Strongylocentrotus purpuratus) nieuw bevruchte eieren microinject. Al meer dan een eeuw, hebben zee-egels een waardevol experimenteel model ^15,16 geweest. Zee-egels zijn evolutionair nauw verwant aan chordates (waaronder wij) en analyse vanhun genoom onthulde dat ze alle belangrijke gen families als de menselijke ¹⁷ bevatten. Ze produceren een groot aantal synchroon ontwikkelen transparante embryo dat gemakkelijk kan worden gemanipuleerd. Het gebruik van zee-egel als modelorganisme, heeft de zee-egel gemeenschap bijgedragen aan ons begrip van de bevruchting proces ^18-21, celbiologische processen ^22-24, en het gen regulerende netwerken (GRNs) ^25-28.

Micro-injectie in zee-egel zygotes vereist een aantal stappen. Ten eerste moeten de eieren worden geïmmobiliseerd voor injecties (hieronder beschreven). Micro-injectie gerechten worden bekleed met protamine sulfaat (PS), dat een positief geladen oppervlak waarop de negatief geladen eieren kan hechten ³ ontstaat. De eieren worden dejellied door incubatie in zure zeewater (pH 5.15) gedurende 10 minuten, gevolgd door twee wassingen in natuurlijk zeewater of kunstmatig zeewater (pH 8,0). De dejellied eieren worden zorgvuldig geroeid in een rechte lijnin het midden van PS-gecoate schaal in aanwezigheid van 1 mM 3-aminotriazool (3-AT), die nodig is om de activiteit van ovoperoxidase dat wordt afgescheiden uit de corticale korrels van het ei als gevolg van bevruchting remmen ^29. Deze stap is belangrijk om verharding van de bevruchting envelop voorkomen en micro-injectie naald toetreding bewerkstelligen. Als alternatief voor 1 mM 3-AT, kan 10 mM paraminobenzoic zuur (PABA) worden gebruikt. De injectie-oplossing wordt in een micro-injectie naald met behulp van gespecialiseerde microloading pipettip geladen en gemonteerd op een houder bevestigd aan micromanipulator en druk unit (figuur 1). Elke naald kan worden gebruikt om individuele zygoten microinject in meerdere experimenten op verschillende dagen. Micro-injectie kan worden uitgevoerd gedurende 10-15 min tot de zygoten harden. De zygoten worden vervolgens met het zeewater en gekweekte gewassen bij 15 ° C. Wanneer het embryo bereiken uitkomen blastula stadium, geven ze uitbroeden enzym dat onderdelen van de fer verteerttilization envelop ³⁰ en hen in staat stellen om op natuurlijke wijze los te maken van de PS-gecoate schaal. Indien nodig kan de embryo voorzichtig worden losgemaakt van de schaal met een mond pipet of Pasteur pipet zachtjes blazen zeewater op het embryo. De beschreven werkwijze maakt een efficiënte en betrouwbare micro-injectie van 100-400 bevruchte eieren op een schotel, die een high-throughput werkwijze voor downstream analyses.

Protocol

1. Voorbereiding van protaminesulfaat (PS) Coated Gerechten

1. Bereid 1% oplossing van protamine sulfaat (PS) door toevoeging van 0,5 g PS 50 ml gedeïoniseerd, gedestilleerd water (DDH ₂ O) in een 50 ml conische buis. Goed schudden op hoge snelheid op een bank shaker bij kamertemperatuur gedurende 1-2 uur tot volledige oplossing van PS waarborgen. Deze oplossing kan worden bewaard bij 4 ° C gedurende ten minste 3 maanden (zorg ervoor om volledig op te lossen gelachtige neerslag voor elk gebruik) ^3.
2. Neem een ​​koker van 60 mm x 15 mm polystyreen petrischaaltjes en lay-out van beide deksels en bodems op de bank.
3. Giet 1% PS oplossing in elke schaal (zowel bodems en deksels kunnen worden) net genoeg om het oppervlak te bedekken, laat ten minste 2 minuten. De overgebleven PS oplossing kan vele malen hergebruikt worden binnen de 3 maanden indien bewaard bij 4 ° C.
4. Plaats PS-behandelde gerechten in een bekerglas gevuld met gedestilleerd water (dH ₂ O). De beker onder stromend dH ₂ O gedurende tenminste10 min..
5. PS-gecoate gerechten kunnen direct of lucht droog worden gebruikt voor opslag. Dek ze af om stofophoping te voorkomen. Ze kunnen worden bewaard bij kamertemperatuur gedurende 1 maand ^3.

2. Verkrijgen Sea Urchin gameten en Immobiliseer de eieren op een PS-gecoate Schotel voor Microinjection

1. Spawn zee-egels door schudden of intracoelomic injectie tot 1 ml 0,5% KCl tot contractie van gladde spieren bewegen om gameten ³ (figuur 2) los.
2. Als het dier een mannelijk, zoals aangegeven door de witte kleur sperma, verzamel sperma droog van het oppervlak van een dier in een 1,5 ml buis. Droog sperma kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende een week zonder significant verlies van biologische functie.
3. Als het dier een vrouwelijk, zoals aangegeven door de gele kleur door het gehalte aan eigeel, verzamel de gameten door onderdompeling van de gonopores in een beker vol zeewater. De eieren zullen worden vrijgegeven gonopores en settelen door de zwaartekracht.
4. Filter de eieren van puin zoals dierlijke stekels met behulp van 80 micrometer Nylon filter mesh. De beste resultaten worden bereikt als de eieren worden gebruikt binnen 5-7 uur na het kuitschieten.
5. Dejelly de eieren:
   1. Bereid 100 ml zure zeewater ongeveer 1 ml ei. Gebruik 0,5 M citroenzuur om de pH van het zeewater te passen van pH 8,0 tot 5,1-5,2. Een te lage pH zal bevruchting verminderen en een te hoge pH zal niet toestaan ​​dat eieren te hechten aan de PS-beklede platen.
   2. Eieren (niet meer dan 1 ml) toe te voegen aan zure zeewater en laat de eieren om zich te vestigen op ijs gedurende 10 minuten. Als alternatief kan de verwijdering van de gelei coat worden vergemakkelijkt door voorzichtig zwenken van de eieren tijdens de behandeling. Men kan effectief dejelly S. purpuratus eieren in 3-4 min. op deze manier.
   3. Giet voorzichtig zuur zeewater, voeg vers zeewater en laat de eieren af ​​te wikkelen weer op ijs naar beneden. Dejellied eieren kunnen worden opgeslagen op ijs gedurende maximaal 6 uur zonder bevruchting problemen

3. Rij de eieren

1. Bereid 1 M voorraadoplossing van 3-aminotriazool (3-AT, MW = 84,08) door het oplossen van 0,84 g 3-AT in 10 ml DDH ₂ O. Deze oplossing kan worden bewaard bij 4 ° C tot 6 maanden.
2. Bereid 1 mM werkoplossing van 3-AT door toevoeging van 50 ui 1 M voorraadoplossing met 50 ml voorgekoeld zeewater. Bewaar de oplossing op ijs.
3. Bereid mond pipet (figuur 3) voor een zachte behandeling van de eieren:
   1. Pipet wordt handmatig getrokken uit glas micropipetten (100 x OD 1.09 mm). Houd de micropipet met beide handen boven het open vuur. Aangezien het glas begint te smelten, zorgvuldig de uiteinden van de pipet trekken in tegengestelde richtingen.
   2. Sluit de ene trok pipet een plastic buis (ID 1,14 mm), verzegelen strak met Parafilm. De lengte van de buis moet ongeveer 50-70 cm.
   3. Plaats een steriel gefiltreerd P20 of P200 tip aan het einde van de buis tegenover de glazen buis teworden gebruikt als het mondstuk.
   4. Klem het uiteinde van de glazen micropipet met een schaar om de diameter van de tip passen. De optimale diameter enigszins groter dan de diameter van het ei (80 urn).
4. Giet 4 ml van 1 mM 3-AT zeewater in elke PS-gecoate schaal (bodem of deksel).
5. Neem de mond pipet, zet de P20/P200 tip in de mond en zet hem vast met de tanden. Om eieren te zuigen, eerst zuigen een kleine hoeveelheid zeewater. Door het hebben van een kolom van de vloeistof alvorens het laden van de eieren, zal een maximale controle over de mond pipetteertechniek hebben.
6. Plaats de micropipet tip in de buurt van de eieren en Zuig voorzichtig in verscheidene honderden eieren in de pipet. Beperk de eieren in het glas micropipet.
7. Rij dejellied eieren in een rechte lijn op een schotel door hen waait zachtjes uit de mond pipet terwijl u de tip in een rechte lijn. Rij de eieren vlak voor de injectie, omdat bevruchting problemen kunnen optreden als gevolg van prolonged blootstelling aan 3-AT zeewater ^3. Bovendien kunnen kationische hechtmiddelen zoals PS giftig eieren, en is het niet raadzaam om embryo bloot deze reagentia langdurig, vooral als de bevruchting enveloppen zijn verwijderd.
8. Maak een kras op de schotel in de buurt van de lijn van geroeid eieren met behulp van een glazen pipet. Deze scratch zal belangrijk zijn om de injectienaald te breken om de stroom van de oplossing aan te passen als dat nodig is. Als alternatief kan de kras worden gemaakt voor het storten 3-AT zeewater aan het gerecht.

4. Micro-injectie van de Sea Urchin Zygotes

1. Zet micro-injectie station. Hier beschrijven we het gebruik van FemtoJet injectiesysteem.
2. Trek injectie haarvaten behulp van een naald trekker. Een voorbeeld van een goede naald is afgebeeld in figuur 4. Opmerking: Voor RNA-injecties, moet de injectie haarvaten worden voorbehandeld om RNAase besmetting ³¹ te voorkomen:
   1. Plaats injectie haarvaten in 50 ml conischebuizen en voeg 50 ml gefiltreerde methanol / HCl (9:1). Schud goed en laat het een nacht om niet langer dan 10 uur.
   2. Giet het methanol / HCl en spoel de haarvaten 2x met gefilterd methanol in dezelfde buis.
   3. Tap methanol zoveel mogelijk lyofiliseren de haarvaten nachts tot volledige verwijdering van methanol garanderen.
3. Monteer voorzichtig de naald capillair op een naald laad-houder en laad het met <0,5 ul van een monster oplossing met microloader tips. Monsteroplossingen bevatten gewoonlijk 20% glycerol, afhankelijk van het geïnjecteerde materiaal ^3.
4. Zet de schaal met roeide eieren op de microscoop podium (eieren moeten verticaal worden uitgelijnd wanneer bekeken door ooglenzen) en focus op de eieren.
5. Monteer voorzichtig de geladen naald op de naald microinjecting houder en pas de positie van de naald om een ​​haarscherpe tip hebben in het midden van het veld.
6. Druk op de knop om de maximale druk fo toepassingr naald schoonmaken. Oplossing moet uit de naald komen. Stel de druk indien nodig: injectiedruk moet in het bereik van 90-360 hPa, de compensatie druk bij ongeveer 1/3 van de injectiedruk.
7. Pas de oplossing stroom door het injecteren in onbevruchte eicel. Met een joystick micromanipulator, richt de punt van de injectienaald aan de onbevruchte eicel. Om naald binnenkomen, het creëren van een lichte beving door zachtjes te tikken van het podium met een hard voorwerp, zoals een schroevendraaier. Een injectie bolus die in het ei moet worden gezien (figuur 5).
8. Als de injectie bolus niet zichtbaar is, lichtjes verhogen de punt van de naald boven de eieren, zoek de kras op de schotel en stel deze in het midden van het veld worden geplaatst. Tik voorzichtig de naald om de kras aan de punt van de injectienaald breken. Pas de injectie en compensatie druk dat de bolus injectie niet meer dan 1/5 tHij diameter van het ei (1-2 uur).
9. Zodra de injectie bolus is gekalibreerd, bevruchten de eieren door het toevoegen van verdund sperma (1:1000) of 1-2 ul van sperma. Meng goed zorgvuldig om te voorkomen dat loskomen van de rij van eieren.
10. Start injecties direct na de bevruchting envelop zichtbaar (figuur 5) wordt. Bewegen langs de lijn van roeiden eieren met behulp van het podium controller en injecteren zoveel zygoten mogelijk door prikken ze met de naald gecontroleerd door joystick micromanipulator.
11. Na 10-15 minuten, zal de bevruchte eitjes gehard worden en kan niet langer worden geïnjecteerd. Haal de schotel uit het podium en zorgvuldig aspireren uit sperma in 3-AT zeewater met behulp van een plastic Pasteur pipet.
12. Laat de zygotes droog. Voeg snel vers voorgekoeld zeewater om de schotel te dekken. Incubeer de embryo's bij 15 ° C.

Resultaten

GFP en mCherry reporter constructen werden in vitro getranscribeerd en micro-injectie in de bevruchte eieren. Embryo's werden geïncubeerd bij 15 ° C gedurende 24 uur (tot het blastula stadium) en afgebeeld met Zeiss Observer Z1 microscoop. Injectie van reporter constructen leidde niet tot enige defecten in de ontwikkeling (Figuur 6). Voor de kwantificering van fluorescerende signalen, werd beeldaanwinst uitgevoerd bij een lage vergroting (100X) maximaal te vangen fluorescerende pixels

Discussie

Microinjectie is een krachtige techniek voor het leveren van verschillende behandelingen zoals DNA, mRNA, recombinante eiwitten, functieverlies en overexpressie-reagentia, kleurstoffen en combinaties in eieren, embryo's en cellen van verschillende organismen ^1-7. Er moet echter een aantal overwegingen in gedachten worden gehouden bij het ontwerpen van een micro-injectie experiment.

Het is uiterst belangrijk om de oplosbaarheid van de geleverde behandeling en het injectievolume...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Glass Pasteur pipettes	VWR	14673-043
Inverted microscope  Axiovert 40 °C	Zeiss	4109431007990000	Injectiemicroscoop
Microloader tips	Eppendorf	5242 956.003	Injectieoplossing laden
Nylon filter mesh 80 μm	Amazon.com	03-80-37	Eieren filteren om puin te verwijderen
P20 of P200 Aerosol Barrier Pipette Tips	Fisher Scientific	02707432 of 02707430	Onderdeel van een mondpijp
Parafilm	Fisher Scientific	13 374 12	Onderdeel van een mondpijp
Polyethyleen buis	Intramedic	PE-160	Onderdeel van een mondpijp
Protamine sulfaat	MP Biomedicals, LLC	194729	Ontkalkte eieren aan injectiekommen bevestigen
Zee-egels S. purpuratus	Pt. Loma Marine Invertebrate Lab	N/A
Zeewater	elke dierenwinkel	Instant Ocean
Steriele 60 mm x 15 mm polystyreen petrischaal	Fisher Scientific	0875713A	Injectiekommen
Drie-as grove positionering micromanipulator MMN-1	Narishige	9124	Injectienaald manipuleren
Drie-as joystick type oliehydraulische fijne micromanipulator MMO-202ND	Narishige	9212	Injectienaald manipuleren
Transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-9AM
Verticale  naaldtrekker	Narishige	PC-10	Injectienaalden trekken