Cytoplasmatisch stromen visualiseren tijdens wondgenezing van één cel in Stentor coeruleus

Samenvatting

De gigantische ciliaat Stentor coeruleus is een klassiek systeem voor het bestuderen van regeneratie en wondgenezing in enkele cellen. Door Stentor-cellen gelijktijdig bij lage en hoge vergroting te beeldhouwen, is het mogelijk om cytoplasmatische stromingen voor, tijdens en na verwonding te meten.

Samenvatting

Hoewel wondgenezing vaak wordt aangepakt op het niveau van hele weefsels, zijn in veel gevallen individuele cellen in staat om wonden binnen zichzelf te helen, waarbij ze een beschadigd celmembraan repareren voordat de celinhoud eruit lekt. Het gigantische eencellige organisme Stentor coeruleus, waarin cellen meer dan een millimeter groot kunnen zijn, is een klassiek modelorganisme geweest voor het bestuderen van wondgenezing in enkele cellen. Stentor-cellen kunnen in tweeën worden gesneden zonder verlies van levensvatbaarheid, en kunnen zelfs worden gesneden en getransplanteerd. Maar deze hoge tolerantie voor snijden roept de vraag op waarom het cytoplasma niet eenvoudigweg uit de grootte van de snede stroomt. Hier presenteren we een methode voor het snijden van Stentor-cellen terwijl we tegelijkertijd de beweging van cytoplasma in de nabijheid van de snede met hoge ruimtelijke en temporele resolutie bekijken. De sleutel tot onze methode is om een ​​'dubbeldekker' microscoopconfiguratie te gebruiken waarbij de operatie wordt uitgevoerd onder een dissectiemicroscoop die gefocust is op een kamer die tegelijkertijd van onderen met hoge resolutie wordt bekeken met behulp van een omgekeerde microscoop met een hoge NA-lens. Deze opstelling biedt een hoog niveau van controle over de chirurgische procedure terwijl nog steeds hoge resolutietracking van cytoplasma mogelijk is.

Inleiding

Regeneratie en wondgenezing zijn belangrijke biologische processen waarvan de mechanismen nog steeds onderwerp van actieve onderzoek zijn. Inderdaad, het vermogen om wonden te helen en beschadigde delen te regenereren, is een van de kenmerken die levende wezens onderscheidt van niet-levende objecten. Normaal gesproken wordt aangenomen dat regeneratie wordt bemiddeld door differentiatie van stamcellen in verschillende celtypen die nodig zijn om een beschadigd of afgesneden deel van een dier opnieuw op te bouwen, terwijl wondgenezing wordt gezien in termen van nieuwe cellen die een wond binnendringen om een intact epitheel opnieuw op te bouwen. Beide processen lijken dus te worden bemiddeld door collectieven van individuele cellen, en lijken daarom typische meercellige processen te zijn. Het is daarom mogelijk verrassend dat individuele cellen in sommige gevallen in staat zijn om wonden te repareren en verloren componenten te regenereren¹. Wondgenezing binnen enkele cellen kan meerdere routes omvatten, waaronder actine-myosine-kettingcontractie rond de wond en membraanpatching door snelle fusie van exocytotische vesicles^1-3. Hoewel veel celtypen in staat zijn tot een zekere mate van wondgenezing^4-6, is misschien het meest dramatische voorbeeld de gigantische ciliaat Stentor coeruelus⁷, getoond in Figuur 1. Individuele Stentor-cellen zijn 1 mm lang en zijn bedekt met rijen cilia. Stentor-cellen zijn kegelvormig met een oraal apparaat, bestaande uit duizenden cilia, aan het ene uiteinde, en een smalle houd-vaststructuur aan het andere uiteinde. Stentor was een klassiek modelorganisme voor het bestuderen van regeneratie omdat als een deel van de cel werd afgesneden, het zich kon regenereren⁷. Bijvoorbeeld, in een klassieke reeks experimenten, toonde Thomas Hunt Morgan⁸ aan dat een Stentor-cel in tweeën kon worden gesneden en dat elke helft binnen enkele uren een normaal proportioneel cel zou regenereren⁸. De moleculaire routes die verantwoordelijk zijn voor regeneratie in Stentor zijn volledig onbekend.

Het vermogen van Stentor-cellen om als regeneratiemodelsysteem te dienen, is gebaseerd op het verbazingwekkende vermogen van deze cellen om zichzelf te genezen na het snijden. Waarom lekt het cytoplasma van een Stentor-cel niet uit wanneer de cel wordt gesneden? Wondgenezing is niet te wijten aan onmiddellijke contractie van de celcortex, omdat het mogelijk is om twee Stentor-cellen te nemen, deze te snijden en vervolgens de twee gesneden cellen in verschillende configuraties samen te voegen⁷. Tijdens dergelijke graftexperimenten moet het cytoplasma van de twee cellen blootgesteld blijven, omdat het fuseert wanneer de cellen tegen elkaar worden geduwd. Op de een of andere manier is het cytoplasma voldoende blootgesteld aan de omringende media om graften mogelijk te maken, maar toch stroomt het niet uit de cel. Is het cytoplasma van Stentor voldoende elastisch dat het zelfs niet kan stromen wanneer er een groot gat in het plasmamembraan wordt gemaakt? Verhogen cellen de viscositeit van cytoplasma lokaal rond een wond om te voorkomen dat het cytoplasma stroomt? Cytoplasma is een zeer complex actief materiaal^9-11, en de Stentor-wondgenezingsreactie vormt een unieke gelegenheid om cytoplasmastromingen en mechanica tijdens wondgenezing van enkele cellen te bestuderen. Het gebruik van chirurgische methoden om wonden in Stentor te induceren, vormt echter een technische uitdaging. Om een 1 mm lange cel met glazen naalden te snijden, het conventionele chirurgische paradigma, is het noodzakelijk om te werken met een lage vergroting en lange werkafstand. Onder deze beeldvormingscondities is het niet mogelijk om de stroom van cytoplasma te volgen, en alles wat men kan bepalen is of het cytoplasma binnen de cel blijft of niet. De echte vraag die we willen stellen is hoe de beweging en viscositeit van cytoplasma kunnen veranderen tijdens het snijden en genezen. Dit vereist beeldvorming met hoge resolutie. Hier presenteren we een aanpassing van Tartar's protocol voor het snijden van Stentor⁷ die het mogelijk maakt om het snijden uit te voeren onder lagere vergrotingsoptiek om de hele cel te zien terwijl tegelijkertijd het cytoplasmastroom met hoge resolutie wordt waargenomen, waardoor dit systeem kan worden gebruikt als een platform voor het verkennen van de mechanismen van wondgenezing van enkele cellen.

Protocol

1. Cell Culture and Collection

1. Verkrijg Stentor coeruleus cellen, hetzij uit natuurlijke vijvers zoals beschreven door Tartar⁷, of van een commerciële leverancier (zie Reagents).
2. Houd culturen in stand door ze in het donker te laten groeien bij 20 ºC in gemodificeerd Stentor Medium (MSM), dat is aangepast van recepten beschreven door Tartar⁷ en De Terra¹² en bevat 0,75 mM Na₂CO₃, 0,15 mM KHCO₃, 0,15 mM NaNO₃, 0,15 mM KH₂PO₄, 0,15 mM MgSO₄, 0,5 mM CaCl₂ en 1,47 mM NaCl.
3. Suppleer het MSM medium met een koolstofbron door levende prooi toe te voegen aan het medium. Laat culturen van Chlamydomonas reinhardtii groeien in TAP medium met standaard kweekmethoden¹³. Voor het voeren, spoel Chlamydomonas cellen in MSM. Voer 300 ml Stentor culturen ongeveer 3 x 10⁷ Chlamydomonas cellen 2-3x per week.
4. Verzamel Stentor cellen voor chirurgie met behulp van een pipette. Stentor hechten zich meestal aan de bodem en zijkanten van de kweekschaal en dus, om cellen te verzamelen, agiteer de cultuur door lucht door een pipette tip te blazen tot de cellen loslaten en vrij zwemmen.
5. Vangt zwemmende cellen met een pipette uitgerust met een wijdboring tip om scheur van de cellen te voorkomen.
6. Was de verzamelde cellen in vers MSM.

2. Voorbereiding van gereedschap voor microchirurgie

1. Houd twee glazen roerstokken boven een Bunsenbrander of andere vlam tot de uiteinden beginnen te smelten.
2. Raak de uiteinden van de twee staven aan zodat het gesmolten glas fuseert.
3. Na het maken van een kleine druppel gesmolten glas tussen de twee staven, verwijder ze uit de vlam, laat afkoelen gedurende 1-2 sec en trek ze dan uit elkaar om een schone breuk te maken. Ideaal is dat het glas uitrekt tot dunne draden en glad breekt terwijl het glas afkoelt, wat resulteert in een naald van ongeveer 1-2 cm lengte met een fijne punt aan het eind (Figuur 2).
4. Als de resulterende naald suboptimaal is, kunnen de punten in glasafval worden gebroken en kunnen de staven opnieuw worden gebruikt.

3. Monteren van cellen voor microchirurgie en observatie (normale chirurgie)

1. Bereid een vierkante Vaseline-wandkamer voor met behulp van een vierkante rubberen stempel bedekt met Vaseline en op een glazen deksel gedrukt.
2. Voeg MSM met 2% Methylcellulose toe aan het Vaseline vierkant.
3. Plaats het deksel in een plastic adapter, die het deksel laat plaatsen op een microscoop met een standaard slide houder (Figuur 3).
4. Voeg gewassen cellen uit stap 1.6 toe aan de MSM plus methylcellulose om de beweeglijkheid van de Stentor cellen te belemmeren zodat ze tijdens de chirurgie op hun plaats blijven.
5. Schik cellen in de methylcellulose zodat ze gelijkmatig verdeeld zijn en dicht genoeg bij het oppervlak van het deksel om in focus te blijven tijdens het beeldvormen.

4. Hoge resolutie beeldvorming van wondgenezing in levende Stentor

Om tegelijkertijd een Stentor cel met hoge resolutie te beeldvormen terwijl het chirurgisch onder lage vergroting wordt gesneden, bouw een "dubbeldekker" microscoop met een dissectiescoop bevestigd aan de oogstukkop van de omgekeerde scope zodat deze gericht is op de bovenkant van de slide terwijl de omgekeerde scope van onder de slide gericht is.

1. Plaats een slide op de omgekeerde scope (gebruik ofwel een Zeiss Axiovert 200M of een Olympus IX80).
2. Verwijder de dissectiemicroscoop van zijn standaard en bepaal de geschatte positie boven de oogstukkop van de omgekeerde microscoop voor het plaatsen van de dissectiescoop om de slide bij lage vergroting te visualiseren.
3. Pas een kartonnen doos aan om dezelfde dikte te hebben als de gewenste afstand tussen de oogstukkop van de omgekeerde scope en de dissectiescope, en plak deze vervolgens in de omgekeerde scope met behulp van lab tape die gemakkelijk kan worden verwijderd wanneer het experiment is voltooid. Pas de dikte van de doos aan volgens de exacte configuratie van de oogstukkop van de omgekeerde microscoop en de grootte van de dissectiemicroscoop, zodat het monster in het gezichtsveld zal zijn zonder dat de dissectiescope na bevestiging hoeft te worden verplaatst.
4. Houd de dissectiescope tegen de doos en beweeg deze tot de slide in focus is, en plak deze vervolgens opnieuw op de doos met behulp van lab tape. De uiteindelijke configuratie wordt getoond in Figuur 4.
5. Beeld cellen af via de omgekeerde scope met behulp van DIC-optica en een 20X luchtobjectief. Gebruik een DIC-condensor met lange werkafstand om voldoende ruimte te bieden om de microchirurgie van bovenaf uit te voeren.
6. Verkrijg beelden met een frame rate van 2 beelden/sec met behulp van een 512 x 512 CCD camera.
7. Begin met de acquisitie voordat u begint met het snijden van de cellen om het aanvankelijke cytoplasmatische stromingspatroon vast te leggen en alle stadia van het wondproces en wondgenezing te observeren.
8. Beëindig de acquisitie wanneer de cel het normale uiterlijk en/of actieve beweeglijkheid heeft hervat, om cytoplasmatische bewegingen gedurende het regenera

Resultaten

Met behulp van de hierboven beschreven protocollen werd vastgesteld dat het cytoplasma van Stentor opmerkelijk dynamisch is, zowel voor als na het snijden. Video 1 toont de uitgebreide cytoplasmastroom die aanwezig is in ongesneden cellen. Ondanks onze oorspronkelijke verwachting dat Stentor's vermogen om snijden te overleven een verharding of vergeling van het cytoplasma zou omvatten, is het in feite zo dat wanneer Stentor-cellen met voldoende geweld worden gesneden om het cytoplasma uit de cel te trekken, het cytoplasma hoogst dynamisch blijft en erin slaagt om op een zeer gerichte manier terug in de cel te stromen (Video 2).

Naast het demonstreren van een voorheen onvermoed graad van cytoplasmabeweging tijdens wondgenezing, kan de hoge resolutie van beeldvorming in de test worden gebruikt om de stroomsnelheden te kwantificeren met behulp van deeltjesbeeldsnelheidsmeting. De mogelijkheid om dergelijke metingen uit te voeren, zal het mogelijk maken om het effect van chemische remmers rigoureus te testen.

Figuur 1. Morfologie van een levende Stentor-cel. Darkfield-afbeelding van een levende Stentor-cel die is gevoed met Chlamydomonas zoals beschreven in Procedure 1.3, zichtbaar als groen materiaal in voedsellevacuolen. Het orale apparaat waardoor de cel eet, is zichtbaar als een rand van trilharen aan de bovenkant van de afbeelding. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Figuur 2. Bereiding van een glazen naald voor chirurgie. (A) Naald wordt getrokken uit het uiteinde van een massieve glazen staaf. (B) Uitzicht op hoge vergroting van de naaldtip dat de lengte en scherpte aangeeft die nodig zijn voor chirurgie. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Figuur 3. Aangepaste dekglashouder voor microchirurgie. Om open toegang voor chirurgie mogelijk te maken terwijl optimale beeldvormingsomstandigheden worden geboden, worden cellen op een dekglas gemonteerd in plaats van een dikke klasse-slide. Om het dekglas in de microscoopstandaard te laten passen, kan een kunststof houder worden vervaardigd met behulp van een 3D-printer. De houder heeft dezelfde afmetingen als een standaard microscoopslide, terwijl de verdieping in het midden overeenkomt met de afmetingen van het dekglas. Een gat in een hoek maakt het mogelijk het dekglas uit de houder te halen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Figuur 4. Dubbeldeks microscoopconfiguratie. Een dissectiemicroscoopkop is gemonteerd op de oculaire kop van een omgekeerde microscoop. Labtape maakt het mogelijk om het apparaat snel te monteren en demonteren wanneer het experiment is voltooid. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Video 1. Voorbeeld van cytoplasmabeweging waargenomen in een levende Stentor-cel. Cel afgebeeld met een 10X objectief met darkfield-optica met een snelheid van 2 frames/sec.

Video 2. Beeldvorming van een Stentor-cel terwijl deze wordt gesneden en verstoord met een glazen naald. Na het snijden is een aanzienlijke hoeveelheid cytoplasma uit de hoofdcel is getrokken, maar het stroomt snel terug in de cel.

Discussie

De belangrijkste toepassing van deze methode zal zijn om het te gebruiken om de moleculaire routes te bepalen die de cytoplasmatische stroming reguleren tijdens wondgenezing in Stentor. Er is een breed scala aan chemische remmer die motoreiwitten en componenten van het cytoskelet targeten. Remmers van calciumsignalering zouden ook waarschijnlijke kandidaten zijn. Het zou ook interessant zijn om de pigmentkorrels (extrusomen) die het blauwe pigment Stentorin bevatten, te verwijderen of te reduceren, waarvan de afgifte uit de cel onder stress wordt geactiveerd, en te vragen hoe de exocytotische afgifte van Stentorin de stroming van het nabijgelegen cytoplasma kan beïnvloeden. Het pigment kan worden afgebroken met behulp van een eenvoudige blekingsbehandeling¹⁵ die net voor het snijden kan worden gedaan. Er lijkt geen eenvoudige manier te zijn om de wondgenezingstest parallel uit te voeren, omdat de cellen een voor een moeten worden gesneden en geïmager. Met behulp van een enkele microscoop zou het dus mogelijk zijn om cellen te behandelen en te meten met een snelheid van ongeveer 1 per 0,5 uur, zodat het tijdens een enkele werkdag mogelijk zou moeten zijn om genoeg datapunten voor een enkele verbinding te verkrijgen om te bepalen of deze een statistisch significant effect op het proces heeft. Hoewel de methode dus in geen enkele zin hoogdoorvoerig is, zal het absoluut haalbaar zijn om een geselecteerde set kandidaatverbindingen te screenen die specifiek zijn voor een paar zorgvuldig gekozen doelroutes.

Een belangrijke beperking van de huidige aanpak is de relatief grove methode voor het samenstellen van de dubbeldeksmicroscoop. Ervan uitgaande dat de gebruikte geïnverteerde microscoop een algemeen gebruiksinstrument is dat andere onderzoekers voor andere doeleinden moeten gebruiken, is een belangrijke overweging de gemak waarmee het apparaat kan worden gedemonteerd en weer in elkaar gezet. Hoewel de huidige methode met labtape inderdaad snel en eenvoudig te demonteren is, vereist deze zorgvuldige uitlijning door de gebruiker tijdens het samenstellen elke keer. Een belangrijke wijziging zou daarom zijn om een aangepaste verwijderbare houder te construeren met slots voor de oogoplashoed van de geïnverteerde scope en het lichaam van de disserperende scope. Dit zou gemakkelijk te fabriceren zijn met moderne 3D-printertechnologie.

Een tweede beperking van de aanpak is de afhankelijkheid van DIC-beeldvorming van intracellulaire organellen als markers voor stroming. Omdat de identiteit van deze organellen die in de microscoop worden waargenomen momenteel niet bekend is, is het niet mogelijk om hun grootte of mogelijke interacties met andere cellulaire componenten te kennen. Het zou daarom voordelig kunnen zijn om extrinsieke tracers zoals fluorescente kralen te injecteren en deze te gebruiken om de stroming te volgen. Dit zou echter een extra stap - micro-injectie - vereisen voordat het experiment zou kunnen worden gedaan, waardoor de test verder zou worden vertraagd.

De laatste belangrijke beperking is de afhankelijkheid van een enkel beeldvlak voor data-acquisitie. Het primaire belang van deze test is dat het verder gaat dan alleen vragen of een wond geneest of niet, en het mogelijk maakt om een gedetailleerde analyse van het stromingspatroon te verkrijgen. In dit opzicht zal het uitermate belangrijk zijn om de beeldvorming uit te breiden naar driedimensionale beeldvorming. De huidige methode beeldt een enkel brandpuntsvlak af en dus wanneer de PIV-analyse wordt uitgevoerd, is het resultaat een doorsnede door het volledige driedimensionale stromingsveld. Dit is informatief maar onvolledig. Door 3D-beelden te verkrijgen bij elke tijdstap, zou het mogelijk moeten zijn om een volledig driedimensionale stromingsveld te verkrijgen. Dit zal vooral van cruciaal belang zijn om precies waar te nemen hoe het cytoplasma in de onmiddellijke omgeving van de wondplaats beweegt.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Stentor coeruleus levend cultuur	Carolina Biological	131598
Methyl Cellulose, 1.500 cP	Sigma	M0387
EQUIPMENT:
Materiaalnaam	Bedrijf	Catalogusnummer
Zachte glazen roerstaaf 5 inch lang	Fisher Scientific	11-380A
Kweekschaal 4,5 inch 250 ml glas	Carolina Biological	741004
IX81 omgekeerd microscoop	Olympus
Axiovert 200M omgekeerd microscoop	Zeiss
Stemi 2000 Stereo Microscoop	Zeiss
Evolve 512 x 512 EMCCD camera	Photometrics
Plan Apo 20X objectief	Olympus	UPLSAPO