Method Article

Systematische analyse van In Vitro Cel Rolling Met behulp van een multi-well plaat Microfluidic System

DOI:

10.3791/50866

⸱

October 16th, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Division of Biomedical Engineering, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, 2Center for Regenerative Therapeutics, Brigham and Women's Hospital, 3Harvard Medical School, Harvard University, 4Harvard Stem Cell Institute, Harvard University, 5Harvard-MIT Division of Health Sciences and Technology, 6Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie gebruikte een multi-well plaat microfluïdische systeem aanzienlijk verhogen doorvoer cel rollen studies onder fysiologisch relevante schuifkracht. Gezien het belang van cel rollen in het multi-step cel homing cascade en het belang van cel homing na systemische toediening van exogene populaties van cellen bij patiënten, biedt dit systeem potentieel als een screening platform om celtherapie verbeteren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een belangrijke uitdaging voor celtherapie is het onvermogen om systemisch doel een grote hoeveelheid levensvatbare cellen met een hoge efficiëntie weefsels van belang na intraveneuze of intra-arteriële infusie. Bijgevolg toenemende cel homing wordt momenteel bestudeerd als een strategie om celtherapie verbeteren. Cel rollen op het vasculaire endotheel is een belangrijke stap in het proces van cel homing en kan worden gesondeerd in vitro met een parallelle plaat stroming kamer (PPFC). Echter, dit is een uiterst vervelend, lage throughput assay, met slecht gecontroleerde stroming. In plaats daarvan, gebruikten we een multi-well plaat microfluïdische systeem bestuderen van cellulaire roleigenschappen maakt een hogere doorvoer onder nauwkeurig gecontroleerde, fysiologisch relevante schuifstroom 1,2. In dit artikel laten we zien hoe de roleigenschappen van HL-60 (menselijke promyelocytenleukemie) cellen op P-en E-selectine-gecoate oppervlakken, alsmede op cel-monolaag gecoate oppervlakken readil kan zijny onderzocht. Om beter te simuleren ontstekingen, werd de microfluïdische kanalen oppervlak bedekt met endotheelcellen (EC), die vervolgens werden geactiveerd met tumornecrosefactor-α (TNF-α), aanzienlijke verhoging interacties met HL-60 cellen onder dynamische omstandigheden. De verbeterde doorvoer en geïntegreerde multi-parameter software analyse platform, dat een snelle analyse van parameters zoals het rollen snelheden en glooiende pad maakt, zijn belangrijke voordelen voor de beoordeling cel rollen woningen in-vitro. Waardoor een snelle en nauwkeurige analyse van technische oplossingen ontwikkeld om cellen rollen en homing beïnvloeden, kan dit platform helpen vooraf exogene celtherapie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een van de belangrijkste uitdagingen in de succesvolle klinische vertaling van cel-gebaseerde therapie is de inefficiënte levering of targeting van systemisch toegediend cellen aan gewenste locaties 3,4. Bijgevolg is er een voortdurende zoektocht naar benaderingen cel homing verbeteren, en in het bijzonder cel rollen, als een strategie voor celtherapie verbeteren. Cel rollen op de bloedvaten is een belangrijke stap in de cel homing cascade, klassiek gedefinieerd voor leukocyten die zijn aangeworven om ziekteplaatsen 5. Deze stap wordt geregeld door specifieke interacties tussen endotheliale selectine namelijk P-en E-selectine (P-en E-se....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Celkweek

  1. Human promyelocytenleukemie (HL-60) cellen
    1. Cultuur HL-60 cellen in 75 cm2 flessen met 15 ml van Iscove's gemodificeerd Dulbecco's medium (IMDM), aangevuld met 20% (v / v) foetaal runderserum (FBS), 1% (v / v) L-glutamine en 1 % (v / v) Penicilline-streptomycine.
    2. Opnieuw media om de 3 dagen met afzuigen helft van de celsuspensie volume en vervangen door volledig IMDM medium.
    3. Voor carboxyfluoresceïne diacetaat, succinimidylester (CFSE) kleuring centrifuge HL-60 celsuspensie (400 xg, 5 min.), resuspendeer in een 1 uM CFSE-oplossing (bereid in voorverwarmde PBS) en incubeer gedurende 15 minuten bij 37....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HL-60 cellen rollen op P-en E-selectine oppervlakken, maar niet op fibronectine

HL-60 cellen beschouwd gouden standaard "rollen" of drukken zij diverse doelzoekende liganden, waaronder de rollen liganden P-sel glycoproteïne ligand-1 (PSGL-1) en Sialyl-Lewis X (SLEX) 5,14 (figuur 1A ). Het oppervlakte-eiwit PSGL-1 werkt als een steiger voor de tetra-saccharide SLEX, bemiddelen specifieke interactie met P-en E-sel, die up-gereguleerd op het endotheel tijdens .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een van de belangrijkste uitdagingen succesvolle vertaling van exogeen celtherapie is het onvermogen om cellen efficiënt te leveren aan plaatsen van verwonding en ontsteking met een hoog rendement engraftment 3. Cell rollen is een cruciale stap in het proces van cel homing, de vertraging van cellen vergemakkelijken op de wanden van bloedvaten, uiteindelijk leidend tot de stevige adhesie en transmigratie door het endotheel in het weefsel 5. Beter begrip van het walsen verkregen voor kandidaat celtyp.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CHO-P cellen waren een soort geschenk van Dr Barbara Furie (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School). Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Health subsidie ​​HL095722 aan JMK Dit werk werd mede ondersteund door een Movember-Prostaatkanker Stichting Challenge Award naar JMK

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Human Lung Microvascular Endothelial CellsLonzaCC-2527
P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P)Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12
HL-60 CellsATCCCCL-240
Cell Culture Reagents
Endothelial Basal MediumLonzaCC-3156
EBM-2 MediaLonzaCC-3156
Endothelial Basal Medium SupplementsLonzaCC-4147
EGM-2 MV SingleQuotsLonzaCC-4147
IMDM - Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1xGibco12440
F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham)Gibco11765-054
Penicillin Streptomycin (P/S)Gibco15140
L-Glutamine (L/G) 200 mMGibco25030
Fetal Bovine Serum (FBS)Atlanta BiologicalsSa550
Petri DishesBD FalconBD-353003
100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene
Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes)MedSupply PartnersTC1500
T75 FlasksBD Falcon353136
Gelatin Solution (2%)SigmaG1393
dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride)SigmaD8537
Trypsin-EDTA Solution (10x)SigmaT4174
Antibodies
Anti-hE-Selectin/CD62ER&D SystemsBBA21
FITC Conjugated Mouse IgG1R&D SystemsBBA21
Anti-hP-SelectinR&D SystemsBBA34
FITC Conjugated Mouse IgG1R&D SystemsBBA34
FITC Mouse IgG­1 κ Isotype ControlBD Bioscience555748
Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18Santa CruzSC70545
FITC ConjugatedSanta CruzSC70545
Normal Mouse IgM-FITC Isotype ControlSanta CruzSC2859
PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1BD Pharmingen556055
PE Mouse IgG1 k Isotype ControlBD Pharmingen550617
Anti-P-Selectin Ab (AK4)Santa CruzSC19996
Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3MilliporeMAB2150
Mouse IgG1 Isotype ControlSanta CruzSC3877
Other Reagents
Recombinant Human TNF-alphaPeproTech300-01A
Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit - For Flow CytometryInvitrogenC34554
Human P-selectin-FC recombinant proteinR&D Systems137-PS-050
Human E-selectin-FC recombinant proteinR&D Systems724-ES-100
Fibronectin Human, PlasmaInvitrogen33016-015
Equipment
Bioflux 1000Fluxion BiosciencesBioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data
BioFlux 48-well platesFluxion Biosciences
BD Accuri C6 Flow CytometerBD BioscienceCFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data
Nikon Eclipse Ti-SNikon
CoolSnap HQ2 CCD cameraPhotometrics

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Conant, C. G., et al. Well plate microfluidic system for investigation of dynamic platelet behavior under variable shear loads. Biotechnol. Bioeng. 108, 2978-2987 (2011).
  2. Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell RollingMicrofluidic SystemHL 60 CellsP SelectinE SelectinTNF AlphaEndothelial CellsShear FlowRolling VelocityParallel Plate Flow Chamber

Related Articles