Extractie en analyse van Cortisol van de mens en de Monkey Hair

Samenvatting

Cortisol (CORT) hoopt zich op in de groeiende haarschacht van mensen en niet-humane primaten. We beschrijven methoden voor de extractie en analyse van haar CORT met hoge precisie en gevoeligheid. Meting van haar CORT is bijzonder geschikt voor het beoordelen van chronische spanning gedurende een periode van weken tot maanden.

Samenvatting

Het stresshormoon cortisol (CORT) wordt langzaam opgenomen in de groeiende haarschacht van mensen, niet-humane primaten en andere zoogdieren. We ontwikkeld en gevalideerd in een werkwijze voor CORT extractie en analyse van resusaap haar en vervolgens paste deze methode voor gebruik met menselijke hoofdhaar. In tegenstelling tot CORT "point samples" verkregen uit plasma of speeksel, haren CORT biedt een geïntegreerde meting van de hypothalamus-hypofyse-bijnierschors (HPA)-systeem activiteit, en dus fysiologische stress, tijdens de periode van hormoon oprichting. Omdat de menselijke hoofdhaar groeit met een gemiddelde snelheid van 1 cm / maand, CORT niveaus verkregen van haar segmenten enkele cm in lengte kan mogelijk dienen als een biomarker van stress ervaren gedurende een aantal maanden.

In onze methode wordt elke haar monster eerst tweemaal gewassen in isopropanol elk CORT van de buitenkant van de haarschacht, dat is afgegeven door zweet of talg verwijderen. Na droging bevatte demonster wordt gemalen tot een fijn poeder te breken van het haar eiwitmatrix en verhoging van de oppervlakte voor extractie. CORT uit het inwendige van de haarschacht wordt in methanol geëxtraheerd, wordt de methanol afgedampt en het extract wordt opgelost in assaybuffer. Gewonnen CORT, samen met standaarden en kwaliteitscontroles wordt vervolgens geanalyseerd met behulp van een gevoelige en specifieke commercieel beschikbare enzym-immunoassay (EIA) kit. Uitlezing van de EIA wordt omgezet in pg CORT per mg gepoederd haar gewicht. Deze werkwijze is gebruikt in ons laboratorium haren CORT analyseren mensen verschillende soorten makaken, zijdeaapjes, honden en ijsberen. Veel studies zowel vanuit ons lab en van andere onderzoeksgroepen hebben de brede toepasbaarheid van haar CORT voor de beoordeling van chronische blootstelling aan stress in zowel natuurlijke als laboratorium instellingen aangetoond.

Inleiding

Meting van CORT in plasma, speeksel, of nu in urine of ontlasting is gebruikt als een index van fysiologische stress sinds ontdekking van de functie van de HPA-as stress ¹ Selye's. Hoewel talrijke artikelen gepubliceerd met betrekking HPA activiteit acuut stressvolle situaties, is het gebied belemmerd door het gebrek aan een eenvoudige en betrouwbare index van chronische fysiologische stress. Dit probleem doet zich voor omdat het plasma en speeksel zowel opbrengst "punt" schattingen van HPA activiteit die onderworpen zijn aan circadiane variatie zijn en kan worden verstoord door verstoringen van het milieu. Urine en fecale monsters leveren metingen van CORT en / of metabolietenuitscheiding dat een aantal uren tot een volledige dag in sommige gevallen overspannen. Verzamelen van meerdere monsters met een van deze matrices kunnen een ruwe samengestelde index van CORT niveau leveren; maar geen van deze benaderingen verschaft een werkelijk langdurige index HPA activiteit en de gevoeligheid van deze SYstengel tot chronische stressoren.

Meten CORT in het haar is begonnen om deze belangrijke behoefte te vullen in de stress literatuur. Aanvankelijke studies van verschillende laboratoria toonde de aanwezigheid van CORT in menselijk haar maar niet onderzocht of haar CORT niveaus veranderd als een functie van spanning ^2. Aangezien ons laboratorium is geïnteresseerd voor vele jaren in de regulatie van de resusaap HPA-as door verschillende sociale en gedragsmatige factoren ³ hebben we besloten om methoden voor extractie en analyse van resusaap haar ⁴ vast te stellen en te valideren. Ervan uitgaande dat bloed overgedragen CORT langzaam en continu in groeiend haar wordt opgenomen, de toepassing van deze nieuwe methode was het niveau van haar afgeleide CORT als een geïntegreerde index van HPA activiteit gedurende een periode van weken tot maanden.

Verschillende methodologische problemen werden ondervonden bij het ontwikkelen van het huidige protocol. Eerste, had vorige studies dat kleine hoeveelheden o getoondf circulerende CORT worden uitgescheiden in het zweet en talg en dus kon de vacht van de buitenkant van de haarschacht ^2. Om dit potentieel te verwarren elimineren, we een milde wasbeurt procedure die lijkt op externe CORT verwijderen terwijl het hebben van een minimaal effect op CORT aanwezig binnen de groeiende haarschacht ontwikkeld. Aldus aap haar onderworpen aan deze procedure (bijvoorbeeld twee 3-min wassen met isopropanol) verloor ongeveer 7-8% van het totaal haar CORT inhoud, en een derde was verwijderd minder dan 1% meer steroïde uit het monster ^4. Er blijkt meer externe CORT in menselijk haar, aangezien dezelfde procedure verwijderd gemiddeld 27% totale CORT inhoud van de monsters (K. Rosenberg J. Meyer, ongepubliceerd). Zoals aap haar echter een aanvullend wassen die minder CORT (ongeveer 7%) dan de eerste twee wasbeurten. Daarom resultaten van beide aap en menselijk haar ondersteunen de stelling dat de meeste (zo niet alle) externe CORT verwijderd kan worden met behoud van een grote fractietie van CORT binnen de interne haarmatrix. Ten tweede, onze pilot-studies toonden ook aan dat het malen van het haar vóór de extractie aanzienlijk toegenomen CORT herstel van het monster, vermoedelijk door het openbreken van het complex eiwitachtige matrix van de haarschacht evenals het verhogen van de beschikbare oppervlakte voor penetratie oplosmiddel. Twee verschillende malen methoden ontwikkeld, elk met voor-en nadelen. Methode 1, die een kogelmolen gebruikt, heeft het voordeel van het produceren van de fijnste poeder. Echter, een kogelmolen is een relatief dure apparatuur item, indien gebruikt met standaard maalpotten en ballen, het kan slijpen slechts twee monsters tegelijk. Kleine monsters zijn ook moeilijk te verwerken met behulp van een kogelmolen met standaard slijpen potten. Methode 2, die een BeadBeater gebruikt, minder effectief in het malen vermogen. Hierdoor gemiddelde CORT herstel ongeveer 10% lager deze methode ten opzichte van de kogelmolen (ongepubliceerde gegevens). Anderzijds, een BeadBeateris aanzienlijk goedkoper dan een kogelmolen, kan 16-24 monsters worden gemalen in een keer, afhankelijk van het model en de methode is zeer geschikt voor kleine steekproeven. Vanwege de bovengenoemde differentiële herstel, is het raadzaam om dezelfde maalwerkwijze gebruiken voor alle monsters binnen een bepaalde studie.

Zodra het haar monsters zijn verwerkt, worden zij geëxtraheerd met methanol en CORT in extracten geanalyseerd door middel van een gevoelige en specifieke commerciële EIA-kit oorspronkelijk ontworpen om speeksel CORT meten. De extractie en analyse procedures zijn gedeeltelijk gevalideerd door aan te tonen dat seriële verdunningen van uittreksels uit de aap haar monsters leverde EIA lezingen die nauw parallel verkregen uit authentieke CORT normen lezingen. Vervolgens bleek dat haar CORT (naast plasma en speeksel CORT) was gevoelig voor grote levensduur stressor een administratief opdracht verplaatsing van de apen nieuwbouw wijken ^4,5. De presentatiet papier zorgt voor een gedetailleerd verslag van de routinematig gebruikt in ons laboratorium voor mens en aap haar monsters te verwerken en te extraheren en te analyseren CORT van dergelijke monsters methoden.

Protocol

1. Sample Collection en opslag

1. Menselijk haar
   1. Zet de gehele lengte van het haar te bemonsteren (tot een potlood breedte diameter) met een rubberen band of clip. Geknipt haar zo dicht mogelijk bij de hoofdhuid mogelijk (maar zorg er voor nick de huid) met een schone schaar. Opmerking: De standaard sampling gebied is de achterste vertex van de schedel.
   2. Sommige onderzoekers hebben een afname in menselijk haar CORT niveaus gemeld afstand tussen de hoofdhuid ^6, die het gevolg kan zijn afgespoeld herhaalde blootstelling aan water en shampoo ⁷ (maar zie Manenschijn et al.. ⁸ en Thomson et al.. ⁹ tegendraadse resultaten waarvoor geen gesegmenteerde daling werd waargenomen) Om de gevolgen van deze mogelijke "wash-out effect" zoveel mogelijk te beperken, raden we het verzamelen van haar segmenten dichtbij de hoofdhuid met een lengte van niet meer dan 3 cm (uitgaande van een gemiddelde groei van 1 cm / maand ^10, een 3 cm segment bevat CORT dat is gedeponeerd gedurende ongeveer de laatste 3 maanden). Om dit te bereiken, gebruik een liniaal tot 3 cm van de eerste snede te meten en snijd opnieuw om de 3 cm monster opleveren. Let op: Zodra het haar is op lengte gesneden, is het niet langer nodig om de strengen op een lijn te houden, tenzij de studie omvat het snijden van het monster in afzonderlijke 1 cm lang segmenten een retrospectieve kalender van CORT depositie te vestigen over de periode vóór de bemonstering ^6.
   3. Leg het haar monster in een zakje gemaakt van aluminium folie, een schone papieren envelop, of een 15 ml schroefdop van polypropyleen centrifugebuis van het type dat wordt gebruikt voor het monster wassen. Zoals CORT is zeer stabiel in haar ² kunnen monsters onbeperkt worden bewaard bij -20 ° C en, indien nodig, verzonden overnacht bij omgevingstemperatuur.
   4. Het haar incassoprocedure moet worden beoefend op vrijwilligers en de praktijk monsters moeten worden afgewogen alvorens een volledige studie. Opmerking: Haar monsters als small zoals 5-10 mg worden geanalyseerd volgens de hieronder beschreven werkwijzen, hoewel het wenselijk om monsters> 10 mg verzamelen om de kans op het verkrijgen van de laagste CORT EIA metingen minimaliseren.
2. Aap haar
   1. Scheren haar (100-250 mg) van de nek van de hals met een standaard dier klipper. Scheren zo dicht mogelijk bij de huid mogelijk, zorg dat u nick de huid en veroorzaken bloeden omdat het bloed CORT niveaus zijn zeer hoog in vergelijking met die gevonden in het haar. Opmerking: De hals gebied werd gekozen voor routinebemonstering omdat het over het algemeen een goede bron van haar en kan gemakkelijk worden waargenomen voor haargroei voorafgaand aan resampling.
   2. Leg het haar monster in een zakje gemaakt van aluminiumfolie of een 15 ml schroefdop polypropyleen centrifugebuis. Aap haar stalen worden en op dezelfde wijze als hierboven beschreven voor menselijk haarsteekproeven verzonden.
   3. Omdat aap haar tegenstelling menselijk hoofdhaar, groeit tot een bepaalde lengte en stops groeit ^11, is het meestal niet mogelijk in dit geval om afstand te gebruiken uit de huid als een kalender voor CORT depositie. Indien een dier kan worden bemonsterd meerdere malen (bijvoorbeeld tijdens periodieke routine gezondheidsexamens), is het wenselijk om een ​​eerste scheren uitvoeren om een ​​basislijn tijdstip instellen en vervolgens reshave hetzelfde gebied na de gewenste tijd verstreken is. CORT in het tweede monster werd afgezet tijdens de scheerbeurt-reshave interval, die een nauwkeurige toerekening van CORT inhoud van het monster te HPA activiteit over dat interval ⁵ toelaat.

2. Monster Wassen en drogen

1. Het wassen
   1. Plaats elke haar monster in een 15 ml schroefdop polypropyleen centrifugebuis.
   2. Voeg 5 ml van high performance vloeistofchromatografie (HPLC)-grade isopropanol aan elke buis gevolgd door herhaalde inversie gedurende 3 min met een rotator.
   3. Giet het isopropanol in een afvalcontainer, waarbij czijn geen van de monster verliezen.
   4. Herhaal de stappen 2.1.2 en 2.1.3 nog eens.
2. Drogen
   1. Droog het haar gedurende ten minste 2-3 dagen om volledige verdamping te waarborgen isopropanol.

3. Monster Maal-en CORT Extraction - Methode 1 voor grote steekproeven

1. Monster slijpen
   1. Plaats maximaal 250 mg gedroogd haar in een 10 ml roestvrij staal slijpen pot samen met een enkele 12 mm roestvrij staal slijpen bal.
   2. Wrijf gedurende 6 min bij een snelheid van 25 Hz met behulp van een kogelmolen.
   3. Wegen tot 50 mg gepoederd haar op een analytische balans en vervolgens overbrengen naar een schone 2,0 ml polypropyleen microcentrifugebuis voor volgende CORT extractie.
2. CORT extractie
   1. Voeg 1,0 ml HPLC kwaliteit methanol aan de microcentrifugebuis met poedervormig monster.
   2. Cap de buis en incubeer het monster gedurende 18-24 uur bij kamertemperatuur met constant inversie met behulp van een rotator.
   3. Centrifugeer de buisjes bij 14.000 rpm gedurende 1 min bij kamertemperatuur om het poedervormige haar pellet.
   4. Breng 0,6 ml van de bovenstaande vloeistof om een ​​schone 1,5 ml microcentrifugebuis, verzorgen de pellet poedervormig haar niet te verstoren.

4. Monster Maal-en CORT Extraction - Methode 2 voor kleine steekproeven

1. Monster slijpen
   1. Plaats maximaal 60 mg van haar in een vooraf gewogen 2 ml microcentrifugebuis versterkt voor kraal pak slaag.
   2. Weeg het flesje om het monster gewicht te verkrijgen.
   3. Voeg drie 3,2 mm verchroomd staal kralen om elke flacon en vervolgens vermalen het monster gedurende ten minste 2 min in een kraal klopper. Als visuele inspectie blijkt dat het monster onvoldoende wordt verpulverd, dan voert de aanvullende slijpen voor 0,5 of 1 min. Opmerking: Overdrachten van de grond haar is in dit geval nodig omdat CORT extractie wordt uitgevoerd in hetzelfde flesje slijpen.
2. CORT extractie
   1. Voeg 1,5 ml HPLC kwaliteit methanol aan de microcentrifugebuis met poedervormig monster.
   2. Cap de buis en incubeer het monster gedurende 18-24 uur bij kamertemperatuur onder constant inversie met een rotator.
   3. Centrifugeer de buisjes bij 10.000 rpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om het poedervormige haar pellet. Opmerking: De chroomstaal kralen blijven in de buis met het haar tijdens de winning en centrifugeren stappen, die goed is voor de lagere centrifugeersnelheid vergelijking met methode 1.
   4. Breng 1,0 ml van de bovenstaande vloeistof om een ​​schone 1,5 ml microcentrifugebuis, verzorgen de pellet poedervormig haar niet te verstoren.

5. Oplosmiddel Verdamping en Sample Reconstructie

1. Droog vaststelling van methanol met behulp van een vacuüm verdamper of een stroom stikstofgas als een vacuüm verdamper is niet beschikbaar. Als een vacuüm verdamper wordt gebruikt, kan de methanoldamp worden gevangen door middelvan een koude val of chemische val uitgerust met een geactiveerde kool cartridge.
2. Na verwijdering van de methanol, los het CORT extract in een geschikt volume van EIA testbuffer (verdunningsmiddel voor de test). Als relatief hoge CORT waarden worden verwacht, gebruik dan een buffer volume van 0,4 ml of meer. Als relatief lage waarden verwacht, dan kan het volume worden teruggebracht tot 0,2 ml of minder gevoeligheid te verhogen. Opmerking: 0.2 ml is voldoende volume om dubbele monsteroplossing minstens tweemaal uitgevoerd bij een herhaling van het monster nodig.
3. Hetzij onmiddellijk assay het opgeloste monster of invriezen bij -20 ° C voor latere analyse. Opmerking: Als het opgeloste monster wordt bevroren, is het belangrijk om sublimatie tijdens het invriezen periode na een verandering in monstervolume voorkomen leidt tot een valse CORT waarde wanneer de definitieve berekeningen worden uitgevoerd.

6. CORT Assay en Data Conversion

1. Analyseer het haar extractenCORT gebruik van een hoge gevoeligheid enzymimmunoassay (EIA) kit. Opmerking: Als u een commerciële speeksel CORT EIA kit, volg de aanbevelingen van de fabrikant, zoals gespecificeerd in de kit insert behalve dat de monsters zal duplo monsters van elke opgeloste haar extract in plaats van speeksel monsters.
2. Bereid een kwaliteitscontrole (QC) haar extract voor gebruik in elke test.
   1. Verzamel een aantal extra haar monsters en ofwel verwerken hen individueel als in de stappen 4.1 en 4.2 of bundelen ze voor grote monster verwerking als in de stappen 3.1 en 3.2.
   2. Damp het oplosmiddel en reconstrueren de extracten als in de stappen 5.1 en 5.2, dan is het zwembad van het gereconstitueerde uittreksels uit een aantal enkele of samengevoegde monsters.
   3. Aliquot een geschikt volume van de gepoolde gereconstitueerde extract (bijv. 0,10 ml) in afzonderlijke microcentrifugebuizen en invriezen voor later gebruik.
   4. Ontdooien en voer een QC hoeveelheid wordt in tweevoud op elke immunoassay microplaat een refe biedenRence CORT waarde voor het controleren van de kwaliteit van elke run.
   5. Een intra-assay variatiecoëfficiënt (CV, gedefinieerd als de standaarddeviatie gedeeld door het gemiddelde van een verzameling van het monster waarden) kan worden berekend door het analyseren van 10-12 QC putten in dezelfde run, terwijl een inter-assay CV kan worden berekend met behulp van de QC-waarden over een groep loopt. Als je microplaatlezer software berekent een CV duplo die elke haar extract, wordt een alternatieve methode voor het bepalen intra-assay CV wordt het gemiddelde van deze individuele CV waarden over de gehele plaat te berekenen.
   6. Als een monster extract levert een lezing boven het hoogste CORT standaard in de EIA, toen nog een portie van het extract wordt met een geschikte hoeveelheid van de assay buffer verdund en de daaropvolgende EIA lezing wordt gecorrigeerd voor de verdunningsfactor. Monsters worden ook regelmatig opnieuw geanalyseerd als de CV voor duplo is> 10%.
   7. Omdat CORT EIA kits zijn ontworpen om te meten CORT values in vloeibare monsters zoals speeksel of plasma, de uitgang van de microplaat lezer software moet worden omgezet hoeveelheid CORT per gewichtseenheid poeder haar. De volgende formule omgezet assay output in ug / dl tot pg CORT per mg haar:
      (A / B) * (C / D) * E * 10.000 = F
      waarbij A = ug / dl vanaf assay uitgang, B = gewicht (in mg) haar onderworpen aan extractie, C = vol. (In ml) methanol toegevoegd aan de poedervormige haar, D = vol. (In ml) methanol hersteld van het extract en vervolgens gedroogd neer; E = vol. (In ml) assaybuffer gebruikt om de gedroogde extract reconstrueren, en F = eindwaarde van haar CORT concentratie in pg / mg.

Resultaten

Figuur 1 toont de afdruk van een representatieve set van menselijk haar monsters (volwassen mannelijke en vrouwelijke proefpersonen) verwerkt volgens methode 2 slijpen en extractie. Software gebruikt om de uitvoer van gegevens en een 4-parameter sigmoïdale curve op de CORT normen (figuur 2) past. De tussen-en CV's van deze plaat varieerde 0,01-5,73% met een gemiddelde intra-assay CV van 1,34%. De inter-assay CV bepaald met behulp van de QC-waarden uit negen recente menselijke haar a...

Discussie

De hierboven beschreven haar CORT procedure is eenvoudig uit te voeren, is relatief goedkoop maakt gebruik van gemakkelijk verkrijgbare chemicaliën, reagentia en benodigdheden en vereist apparatuur die, met een uitzondering, waarschijnlijk aanwezig in een typische analytisch laboratorium zijn. De uitzondering is een knarsend apparaat zoals een kogelmolen of mini-BeadBeater. We merken dat sommige onderzoeksgroepen gehakt haar monsters in kleine fragmenten ongeveer 1 mm in lengte ^12, maar op basis van onze obse...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
HPLC-grade isopropanol	Fisher	A451
HPLC-grade methanol	Fisher	A452
Salivary cortisol assay kits	Salimetrics	1-3002	Zie de kitinvoegsel van de fabrikant voor informatie over de gevoeligheid en specificiteit van de test
15 ml Polypropyleen schroefdop centrifugebuizen	Max Scientific	10-9151
1.5 ml Safe-Lock microcentrifugebuizen	Fisher	05-402-25
2.0 ml Safe-Lock microcentrifugebuizen	Fisher	05-402-7
2.0 ml XXTuff versterkte microvialen	BioSpec	330TX	Gebruik met mini-beadbeater
3.2 mm chroom-staalkorrels	BioSpec	11079132c	Gebruik met mini-beadbeater
10 ml roestvrijstalen malende potten	Retsch	02.462.0061	Gebruik met mengmolen
12 mm roestvrijstalen malende ballen	Retsch	05.368.0037	Gebruik met mengmolen
Savant geactiveerde koolstof cartridge	Fisher	DTK120R	Gebruik met Savant chemische val
Rotator voor 15 ml centrifugebuizen	Fisher	S02135
Rotator voor microcentrifugebuizen	Fisher	NC9854190
Benchtop centrifuge voor microcentrifugebuizen	Fisher	13-100-675
MM 200 mengmolen	Retsch	20.746.0001
Mini-Beadbeater 16	BioSpec	607
Savant DNA Speedvac	Fisher	DNA120-115
Savant gekoelde dampval	Fisher	RVT400-115
Savant chemische val	Fisher	SCT120	Alternatief voor gekoelde dampval
Microplaat lezer
Microplaat wasmachine
Microplaat menger
Multikanaals pipettor
Analytische weegschaal