De vloerplaat is een cruciale structuur van de ontwikkeling van het ruggenmerg, waardoor dampdoorlatend signalen naar voorouders en differentiëren neuronen. We beschrijven een methode om vloer-plaat geconditioneerd medium produceren, toe te passen op verse ruggenmerg weefsel, en de consequenties daarvan op de eiwitten van belang door biochemie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Cultuur van Geïsoleerde Vloerplaat Tissue en productie van geconditioneerd medium om functionele eigenschappen van Floor-plaat uitgebracht Signalen Assess
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Tijdens de ontwikkeling, voorouders en post-mitotische neuronen ontvangen signalen van aangrenzende gebieden die hun lot te reguleren. De vloer-plaat is een groep van gliacellen voering de ependymale kanaal bij ventrale positie. De bodemplaat drukt toets morfogenen bijdragen tot de patroonvorming van cellijnen in het ruggenmerg. Op latere ontwikkelingsstadia, de vloer-plaat regelt de navigatie van axonen in het ruggenmerg, als een belemmering voor de overschrijding van de ipsilaterale axonen en controlling middellijn oversteken te voorkomen door commissurale axonen 1. Deze functies worden bereikt door de secretie van verschillende begeleiding signalen. Sommige van deze signalen fungeren als lokstoffen en insectenwerende de groeiende axonen terwijl reguleert begeleiding receptoren en stroomafwaartse signalering naar de gevoeligheid van de axonen moduleren de lokale richtlijnen 2,3 signalen. Hier beschrijven we een werkwijze die het mogelijk maakt onderzoek naar de eigenschappen van bodemplaat afgeleide signalen in verschillende ontwiklopmental contexten, gebaseerd op de productie van vloer-Plate geconditioneerd medium (FP cm) 4-6. We illustreren dan het gebruik van dit FP cm in de context van axon guidance. Eerst wordt het ruggenmerg geïsoleerd uit muizenembryo op E12.5 en de bodemplaat wordt uitgesneden en gekweekt in een plasma-trombine matrix (figuur 1). Tweede twee dagen later worden commissural weefsel ontleed uit E12.5 embryo's, fijngewreven en blootgesteld aan de FP cm. Ten derde, het weefsel verwerkt voor Western blot analyse van commissural merkers.
Inleiding
De bodemplaat is een bekend patroon midden van de ontwikkelende ruggenmerg, spelen een sleutelrol in de specificatie van voorlopers en postmitotische cellijnen en controle axon navigatie 7,8. De hier beschreven FP cm produceren experimentele procedure kunnen onderzoekers de functionele eigenschappen van bodemplaat afgeleide signalen in verschillende contexten van ontwikkelingsprocessen beoordelen van cel patronen en overleving cel en axon migratie.
Om het gebruik van dergelijke FP cm illustreren, zijn dorsale ruggenmerg weefsel dat commissural neuronen ontleed, dilacerated en gestimuleerd met de FP cm. De weefsels kunnen vervolgens worden verwerkt voor Western blot analyse. Dit maakt onderzoek naar regelgeving van de axon begeleiding machines door vloer-plaat uitgebracht signalen. De behandelingsmethode van dilacerated verse weefsel heeft het grote voordeel van het behoud van het micromilieu van cellen in ee weefsel. Dus de gevolgen van de behandeling door FP cm of soorten behandeling worden beoordeeld in een meer fysiologische wijze dan in cel-en weefselkweek omstandigheden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
DAG 1
1. Dissectie van de Spinal Cord Vloerplaat (FP) van E12.5 muizenembryo's
Opmerking: De gehele procedure vereist het gebruik van steriele omstandigheden. Het verdient de voorkeur de dissectie voeren onder een dissectie kap te voorkomen. Het oppervlak van de kap worden gereinigd met ethanol. Alle dissectie instrumenten moeten worden gesteriliseerd en bewaard in een steriele petrischaal. De vloeistoffen (gemiddeld, dissectie medium) moeten gesloten worden gehouden en in een ijsbad. Elk embryo moet worden verzameld in individuele verse druppel. Dit is belangrijk voor weefsel bewaring. De dissectie wordt uitgevoerd met Dumont # 5 tang. Om de embryo's tussen de gerechten in, greep de navelstreng of het hoofd zonder enige schade aan de achterste hersenen overbrengen. Het is essentieel het ruggenmerg niet tot schade aan de dissectie voltooid. Bereid koude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), koude Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) -6,5% glucose en kamertemperatuur Neurobasal medium.
1.1 ruggenmerg dissectie
Dieren worden behandeld volgens het dier zorg richtlijnen van het Centre National de la Recherche Scientifique volgende Europese richtlijnen. Werkwijze euthanasie cervicale dislocatie, dat bestaat uit het toepassen van druk op de nek en ontwrichten de wervelkolom de hersenen. Deze methode wordt aanbevolen voor muismodellen en kan snel en efficiënt worden uitgevoerd.
- Euthanaseren een zwangere muis op E12.5 van de dracht (E0.5 = eerste dag na matten). Plaats de muis ventrale zijde naar boven.
- Week de buik met 70% ethanol. Knijp de huid van de buik met Adson pincet en snijd door de huid en de peritoneale lagen met chirurgische schaar. Maak een insnijding en te gebruiken om te snijden aan beide zijden van de muis naar de buikholte bloot.
- Een reeks van embryo aanwezig aan elke zijde van de muis. Pak een hoorn van de uterus in het weefsel tussen twee embryo's en ontleden het uit vanaf de buitenzijde. Breng de baarmoeder om een 100 mm petrischaal met koud PBS op ijs.
- Pak de embryo's uit extra-embryonale weefsels. Pak de placenta weefsel (in het donker rood) met twee paar tang en trek zachtjes aan het weefsel scheuren en verwijder de embryo's uit de baarmoeder weg.
Opmerking: Voor een beter behoud, het verzamelen van de embryo's uit hun baarmoeder weg een voor een.
- De volgende stappen zijn gedaan onder verrekijker vergrootglas en dissectie kap. Plaats een embryo in een druppel koud HBSS-6,5% glucose.
- Behulp van een tang, onthoofden het embryo.
Opmerking: Snijd tussen de onderkaak en de achterhersenen, het achterste deel van de achterhersenen is belangrijk voor de volgende stappen.
- Plaats de embryo ventrale zijde naar beneden met het voorste deel naar de experimentator.
- Knijp de huidvan de embryo met een pincet en de andere paar trek de huid weg.
Opmerking: Deze stap wordt herhaald totdat de huid volledig wordt verwijderd uit het voorste deel van het embryo.
- Draai de embryo voorvlak naar links. Met een tang "vastpinnen" het embryo in het voorste deel. Met de andere tang pak de huid en trek naar de rostrale zijde van het embryo. Het ruggenmerg is dan toegankelijk.
- Gebruik een zijde van de tang om de hersenvliezen die nog wikkel het ruggenmerg snijden. Het ruggenmerg is nu open.
- Draai de embryo voorvlak naar rechts.
- Maak het weefsel van het ruggenmerg vanaf de cervicale zijde van het embryo. Schuif de tang onder het ruggenmerg (de tang worden dichtgehouden ruggenmerg beschadiging te voorkomen). De forceps zijn zichtbaar onder het ruggenmerg zijn. Kleine draaiende bewegingen onder het ruggenmerg voldoende zijn om los van deomringende weefsel en de dorsale wortel ganglia (DRG).
Opmerking: Het verlaten verbonden omliggende weefsel in te brengen ruggenmerg, waardoor de kans op breken bij de volgende stap toe.
- Plaats de geïsoleerde ruggenmerg in een frisse druppel koud HBSS-6,5% glucose.
- Plaats het ruggenmerg in een vlakke positie, meninges op de bovenkant en voorste zijde weg van de experimentator.
- "Vastpinnen" het ruggenmerg met behulp van de resterende hindbrain met een tang, en met de tweede tang pak de hersenvliezen. Afpellen de hersenvliezen vanaf de rostrale zijde van het ruggenmerg.
Opmerking: Deze beweging moet langzaam en constant elke onderbreking van het ruggenmerg te voorkomen. Vibrerende bewegingen kunnen het losmaken van de hersenvliezen te vergemakkelijken.
1.2 FP dissectie
- Knijp de achterhersenen met een pincet.
- De FP is de centrale transparent deel van het weefsel. Met behulp van een scalpel knip de vloerplaat.
Opmerking: als u beide kanten snijden met dezelfde kwaliteit, starten vanaf de rostrale kant en afwisselend knip de rechterkant en de linkerkant van de vloerplaat.
- Instandhouding van het ontleed FP in Neurobasal medium bij kamertemperatuur.
2. FP Cultuur
Opmerking: Alle stappen dienen onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd in een weefselkweek kap. Gebruik vers medium en vers ontdooid supplementen en reagentia. Bereid steriele glazen dekglaasjes, warm Neurobasal + B27, plasma en HBSS-trombine.
2.1 FP cultuur
- Plaats verscheidene steriele dekglaasjes in een 100 mm petrischaal en pipetteer 20 pl plasma in het midden van elke dekglaasje.
- Transfer 03:58 FP in elk plasma drop en voeg 20 ul HBSS-trombine naast de plasma-drop en meng voorzichtig. Houd de dekglaasjesgedurende ten minste tien minuten bij kamertemperatuur om stolling van het plasma mogelijk.
Opmerking: Transfer twee KP's in geval van een volledige dissectie en meer in het geval van gedeeltelijke versnijding. Meng langzaam met een pipet en het contact met de FP explantaten voorkomen.
De plasma stolsel trekt een paar micrometer als een teken van de coagulatie. De coagulatie niet voortijdig worden gestopt, om losraken van het plasma stolsel voorkomen.
- Breng elke dekglaasje in een 24-well plaat en voeg 500 ul van Neurobasal + B27. Incubeer 48 uur bij 37 ° C.
DAG 3
3. FP geconditioneerd medium (FP cm) Oogsten
Opmerking: Het oogsten moet onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd in een weefselkweek kap. Als de bovenstaande vloeistof vervuild is of als vloerplaten zweven (wat betekent dat ze zouden zijn gestorven tijdens de cultuur period) dan niet de FP cm oogsten uit deze bron.
3.1 FP cm oogsten
- Oogst zorgvuldig het medium uit elk putje.
Opmerking: Gebruik geen pipet de gepolymeriseerde plasma-trombine mix of FP fragmenten.
- WINKEL 100 ul aliquots bij -80 ° C.
DAG 4
4. Dissectie van Spinal Cord commissurale neuronen van E12.5 muizenembryo's
Opmerking: Dit preparaat hoeft niet onder steriele omstandigheden te worden uitgevoerd. Volg de hierboven beschreven procedure de embryo's te verzamelen. Bereid koude PBS, koude HBSS-6,5% glucose en koud Neurobasal.
4.1 ruggenmerg dissectie
- Behulp van een tang, onthoofden het embryo.
Opmerking: Snijd tussen de onderkaak en de achterhersenen, het achterste deel van de achterhersenen is belangrijk voor devolgende stappen.
- Plaats de embryo ventrale zijde naar beneden in een verse druppel met het voorste deel naar de experimentator.
- Knijp de huid van het embryo met een pincet en met de ander weg te trekken van de huid.
Opmerking: Deze stap wordt herhaald totdat de huid volledig wordt verwijderd uit het voorste deel van het embryo.
- Draai de embryo voorvlak naar links. Met een tang "vastpinnen" het embryo in het voorste deel. Met andere tang, grijpen de huid trekken naar de rostrale zijde van het embryo, het ruggenmerg bloot.
- Gebruik een zijde van de tang om de hersenvliezen die nog wikkel het ruggenmerg snijden. Het ruggenmerg is nu bloot en open.
- Plaats de embryo anterieure zijde naar rechts.
- Maak het weefsel van het ruggenmerg vanaf de cervicale zijde van het embryo. Schuif de tang onder het ruggenmerg (houd de tang gesloten). Vooreekhoorntjesbrood moet zichtbaar onder het ruggenmerg. Kleine draaiende bewegingen onder het ruggenmerg voldoende zijn om het aangrenzende weefsel en de dorsale wortel ganglia (DRG) los te maken.
- Breng de geïsoleerde ruggenmerg in een nieuwe druppel koud HBSS-6,5% glucose.
- Plaats het ruggenmerg in een vlakke positie, meninges op de bovenkant en voorste zijde weg van de experimentator.
- "Vastpinnen" het ruggenmerg met de resterende achterhersenen met een pincet, tweede tang pak de hersenvliezen. Afpellen de hersenvliezen vanaf de rostrale zijde van het ruggenmerg.
4.2 commissurale Neuron dissectie
- Knijp de achterhersenen met een pincet.
- De commissural neuronen in de zijkant van het ruggenmerg (de rugzijde). Knip dit zijkant met een fijn scalpel.
Opmerking: De dorsale gedeelte van het ruggenmerg kan worden onderscheiden van het ventrale deel van verschil cel density, het ventrale deel is ondoorzichtiger.
Opmerking: als u beide kanten snijden met dezelfde kwaliteit, starten vanaf de rostrale kant en afwisselend snijd een kleine lengte van de rechterzijde en de linkerzijde.
- Instandhouding van het ontleed weefsel in Neurobasal medium op ijs voor onmiddellijk gebruik.
5. Behandeling van commissurale Tissue met de FP cm
Opmerking: Deze procedure geldt niet steriele omstandigheden vereisen. Het weefsel moet worden verzameld in afzonderlijke 1,5 ml buizen. De bevroren FP cm mag slechts eenmaal worden gebruikt. Vermijd meerdere opnieuw invriezen. Bereid warme FP cm (37 ° C).
5.1 Behandelingen van commissurale neuronen
- Dilacerate de commissural weefsel met een klein schaartje.
Opmerking: Snijd het weefsel zo klein mogelijk, de toegankelijkheid van de cellen versterken.
- Een billijke verdeling van het weefsel tussen de verschillende experimentele condities controle behandeling en FP cm behandeling.
- Centrifugeer de weefselfragmenten bij 800 xg gedurende 1 min bij 4 ° C.
- Controleer de verdeling tussen de buizen.
Opmerking: Indien nodig herdistribueren en centrifuge opnieuw totdat fragmenten gelijk verdeeld.
- Verwijder het supernatant.
- Voeg de warme FP cm en controlebehandelingen naar de weefsels.
Opmerking: Het volume moet worden aangepast aan de hoogte van de pellet en ten minste tweemaal het volume van het pellet worden.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
Opmerking: Schud elke 10-15 min
- Centrifugeer bij 800 xg gedurende 1 minuut en verwijder de behandeling.
- Voeg de lysisbuffer
Opmerking: Het volume moet worden aangepast om de eenmount van de pellet en moet minstens twee keer het volume van de pellet zijn.
- Pipet op en neer om de pellet opnieuw in suspensie.
Opmerking: Een vortex kan worden gebruikt.
- Incubeer 15 minuten op ijs.
- Centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Houd de supernatant en meet de hoeveelheid eiwit met een Bradford assay 9.
- Voeg 6x Laemmli Buffer.
- Incubeer bij 95 ° C gedurende 5 minuten van het eiwitgehalte denatureren.
Opmerking: Monsters kunnen direct worden gebruikt of kan worden opgeslagen bij -80 ° C.
- Beoordelen van de effecten van de behandeling door de Western Blot 10.
Opmerking: Ten minste 50 ug totaal eiwit moet voor elke baan geladen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Commissural weefsels werden behandeld met de FP cm en de monsters werden voor analyse van receptor niveaus in Western blot. Toepassing van de FV cm bleek de niveaus van een leiding receptor, PlexinA1, die de gevoeligheid van commissurale axonen aan de middellijn afstotende Semaphorin3B bemiddelt na splitsing (figuur 2) te verhogen. Hieruit bleek dat signalen vrijgegeven door de FP reguleren PlexinA1 niveaus 4,6.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De productie van vloer-plaat geconditioneerd medium biedt een efficiënte en eenvoudige manier voor de beoordeling van de biologische eigenschappen van vloerplaat vrijgegeven signalen.
De plasma-trombine matrix biedt uitstekende staat voor weefsel overleven. Toch zou dit verrijkte omgeving een beperking voor sommige soorten van experimenten. Aldus kan de vloerplaat weefsel worden gekweekt in agarose matrix. De kwaliteit van de vloerplaat geconditioneerde medium kan worden beoordeeld door de d...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen
Dankbetuigingen
Wij danken Karine Kindbeiter, Muriel Bozon, en Florie Reynaud voor hun hulp. Het werk wordt ondersteund door CNRS, ANR YODA programma en Labex DevWeCan.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Benodigde reagentia | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PBS | Invitrogen | 14190-094 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| HBSS, Ca2+/Mg2+- vrij | Invitrogen | 14170-088 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Glucose | Sigma | G-7021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Neurobasal | Invitrogen | 21103-049 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Plasma | Sigma | P-3266 | 1 mg/ml (Reconstituteer in H2O en filtreer) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Thrombin | Sigma | T-4648 | 10 mg/ml(Reconstituteer in H2O en filtreer) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 50x | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| HEPES (260 g/mol) | Sigma | H-7006 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EDTA | Sigma | E-5513 | 0.5 M, pH 8 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| MgCl2 | Euromedex | 2189 | 1M | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Glycerol | VWR | 24388.295 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| IGEPAL | Sigma | I-3021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 116 001 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Sigma | S-6508 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Gedestilleerd H2O | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tabel 1. Benodigde reagentia. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Hulpmiddelen en materialen | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Chirurgische schaar | Fine Science Tools | 14002-12 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Adson-tang | Fine Science Tools | 11027-12 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dumont #5 fijne tips tang | Fine Science Tools | 11254-20 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Microknives | Fine Science Tools | 10136-14 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tabel 2. Hulpmiddelen en materialen. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Referenties
- Nawabi, H., Castellani, V. Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline. Cell. Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).
- Placzek, M., Briscoe, J. The floor plate: multiple cells, multiple signals. Nat. Rev. Neurosci. 6, 230-240 (2005).
- Chedotal, A. Further tales of the midline. Curr. Opin. Neurobiol. 21, 68-75 (1016).
- Nawabi, H., et al. A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates. Genes Dev. 24, 396-410 (2010).
- Ruiz de Almodovar, C., et al. VEGF mediates commissural axon chemoattraction through its receptor Flk1. Neuron. 70, 966-978 (2011).
- Charoy, C., et al. gdnf activates midline repulsion by Semaphorin3B via NCAM during commissural axon guidance. Neuron. 75, 1051-1066 (2012).
- Kiecker, C., Lumsden, A. The role of organizers in patterning the nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 35, 347-367 (2012).
- Le Dreau, G., Marti, E. Dorsal-ventral patterning of the neural tube: a tale of three signals. Dev. Neurobiol. 72, 1471-1481 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J. Vis. Exp. , (2010).
- Salinas, P. C. The morphogen sonic hedgehog collaborates with netrin-1 to guide axons in the spinal cord. Trends Neurosci. 26, 641-643 (2003).
- Bechara, A., et al. FAK-MAPK-dependent adhesion disassembly downstream of L1 contributes to semaphorin3A-induced collapse. EMBO J. 27, 1549-1562 (2008).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
