Twee-foton Beeldvorming Calcium in Muizen navigeren van een Virtual Reality-omgeving

Samenvatting

Hier beschrijven we de experimentele procedures betrokken bij twee-foton beeldvorming van de muis cortex tijdens gedrag in een virtual reality omgeving.

Samenvatting

In de afgelopen jaren, heeft twee-foton beeldvorming uitgegroeid tot een onmisbaar hulpmiddel in de neurowetenschappen, omdat het zorgt voor chronische meting van de activiteit van genetisch geïdentificeerde cellen tijdens gedrag ^1-6. Hier beschrijven we methoden naar twee-foton beeldvorming uitvoeren muis cortex terwijl het dier navigeert een virtual reality omgeving. We richten ons op de aspecten van de experimentele procedures die essentieel zijn voor de beeldvorming in een gedragen dier in een helder verlichte virtuele omgeving zijn. De belangrijkste problemen die zich voordoen in deze experimentele opstelling die we hier adresgegevens zijn: het minimaliseren van de hersenen motion gerelateerde artefacten, het minimaliseren van licht lekken van de virtual reality projectiesysteem, en het minimaliseren van laser-induced weefselschade. We bieden ook sample software om de virtual reality omgeving controleren en leerling bijhouden doen. Met deze procedures en middelen moet het mogelijk zijn om een ​​conventionele twee-foton microscoop voor gedragen te converteren in muizen.

Inleiding

Twee-foton beeldvorming van calcium indicatoren (genetisch gecodeerd zoals GCaMP5 ⁷ of R-GECO ^8, of synthetische kleurstoffen zoals OGB of Fluo4) heeft zich ontpopt als een krachtige methode voor het meten van neuronale activiteit in gedragen muizen ^1-6. Het maakt de gelijktijdige meting van de activiteit van honderden cellen bij bijna enkele actiepotentiaal resolutie tot ongeveer 800 urn onder het hersenoppervlak ^9,10. Bovendien, met behulp van genetisch gecodeerde calcium indicatoren (GECIS) neuronale activiteit kan worden gemeten chronisch ^5,11,12, en genetische gedefinieerde celtypes ^13. Samen bieden deze methodes een zekere mate van temporele en ruimtelijke resolutie die het openen van een veelheid aan nieuwe mogelijkheden in de studie van neuronale berekening in vivo.

Chirurgische ingreep noodzakelijk is om bloot te leggen en het etiket van de hersenen van muizen voor de beeldvorming. Cellen worden kenmerkend getransfecteerd met een recombinant adeno geassocieerde vir us (AAV) voor GECI levering en een craniale venster wordt ingeplant op de injectieplaats om optische toegang tot de hersenen te krijgen. Een hoofd balk wordt dan aan de schedel voor kop bevestiging kader van de twee-foton microscoop bevestigd. Het ontwerp en de uitvoering van deze stappen is van cruciaal belang, aangezien de meeste van de problemen met wakker beeldvorming ontstaan ​​van instabiliteiten in de voorbereiding. Idealiter zou de hier beschreven procedure mogelijk maken chronische beeldvorming tot enkele maanden na de operatie.

Om visueel geleide gedrag tijdens twee-foton beeldvorming mogelijk te maken, de kop vaste muis zit op een lucht ondersteund sferische loopband, die zij kan gebruiken om een ​​virtual reality omgeving te navigeren. Locomotion van de muis op de loopband is gekoppeld aan beweging in de virtuele omgeving die wordt weergegeven op een ringkern scherm rond de muis ^14,15. Behavioral variabelen zoals motoriek, visuele stimulus, en leerling positie kan worden opgenomen ^6.

t "> We beschrijven de bij chronische twee-foton beeldvorming in muizen verkennen van een virtual reality omgeving procedures De belangrijkste punten behandeld:. reductie van bewegingsartefacten, vermindering van licht lekken, maximalisatie van het aantal gelijktijdig opgenomen cellen en minimalisering van foto schade. We bieden ook informatie over het instellen van de lucht ondersteund loopband, pupil tracking, en de virtual reality omgeving. De hier beschreven procedures kan worden gebruikt voor het afbeelden van fluorescent gelabelde celpopulaties in het hoofd vast muizen in een potentieel breed scala van gedrags-paradigma .

Protocol

Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de veterinaire afdeling van het kanton Basel-Stadt uitgevoerd.

1. Hardware-en software-installatie

1. Twee-foton scanning microscoop setup:
   1. Gebruik een gepulste infrarode laser als lichtbron (pulsbreedte <120 FSEC).
   2. Gebruik een scan hoofd bestaat uit een 8 of 12 kHz resonantie scanner en een standaard galvanometer. Opmerking: Dit maakt frame rates van 40 of 60 Hz bij 750 x 400 pixels. Een hoge framerate is van cruciaal belang voor het minimaliseren van de hersenen beweging geïnduceerde beeldvervorming. Bovendien, snelle resonante scanresultaten in een hogere signaal rendement en vermindert fotobleken ¹⁶ en fototoxiciteit.
   3. Gebruik een Piëzo-elektrische hoge snelheid z-stepper te verwerven tijd interleaved beelden sequentieel op meerdere dieptes. Opmerking: Dit is optioneel en wordt gebruikt om gegevens opbrengst te verhogen ten koste van de framerate.
   4. Gebruik amechanische uitschakel laser blootstelling aan het weefsel verminderen. De breedte van de uitschakel afhankelijk van de amplitude van de resonante scanner. Opmerking: Door de sinusvormige aard van het scanpad van een resonante scanner, de laserstraal beweegt relatief traag aan het scan om te keren. Om beschadiging van het weefsel op deze ommekeer punten waar de blootstelling laser is het grootst te voorkomen, wordt een mechanische blanker geïntroduceerd in het brandvlak tussen de scan en de buis lenzen die de laserstraal stopt.
   5. Voor data-acquisitie gebruik van een hoge snelheid digitizer (800 MHz) in combinatie met een field-programmable gate array (FPGA). Opmerking: De FPGA high-pass filters en bakken de PMT-signaal in pixels. De combinatie van het hoogdoorlaatfilter van de FPGA en de effectieve laagdoorlaatfilter op de PMT versterker resulteren in een banddoorlaatfilter ruwweg gecentreerd rond de herhalingsfrequentie van de laser (80 MHz). Monster FPGA-code wordt geleverd als een aanvulling.
2. Opblaasbare loopband setup gebaseerd op het ontwerp van Dombeck en collega's ²
   1. Sluit de bal houder om een ​​luchttoevoer lijn met behulp van een luchttoevoer buis van minimaal 10 mm binnendiameter. Maximaliseren van de dwarsdoorsnede van de bal houder luchttoevoer inlaat en plaats ruime hoeveelheid slang tussen de belangrijkste luchttoevoer en de bal houder. Opmerking: Verhoogde doorsnede en toename van de lengte van de luchttoevoer buis vermindert ruis generatie.
   2. Plaats een piepschuim bal (20 cm diameter) in een op maat ontworpen en 3D-gedrukte bal houder.
   3. Als de gedragsmatige paradigma vereist alleen vooruit (en achteruit) motoriek, beperken beweging van de bal naar de horizontale (pitch) as door het invoegen van een pen (bv. een 19 G injectienaald) aan de kant van de bal. Opmerking: Typisch dieren zich aanpassen aan de installatie veel sneller in deze gereduceerde rotatie paradigma.
   4. Track beweging van de bal met behulp van een of twee optische computermuizendetecteren beweging rond twee of drie assen, respectievelijk. Opmerking: De computer muizen idealiter werken met een infrarood diode minste interferentie met de beeldvorming.
3. Virtual reality omgeving setup
   1. Bereid de virtual reality omgeving. Opmerking: Een monster omgeving op basis van Panda3D, een vrij beschikbare game-engine, wordt geleverd als een aanvulling. De objecten van de virtuele omgeving worden gegenereerd met behulp van Wings3D, een open source 3D modeler. Het monster programma leest positie-informatie op een data-acquisitie kaart en vertaalt deze in beweging in de virtuele omgeving. De code voert ook de niet-lineaire transformatie die nodig zijn voor het milieu te worden geprojecteerd op een ringkern scherm. De gedetailleerde constructie van de ringkern scherm is elders ^14,17 beschreven.
   2. Gebruik LED projectoren of LED backlit beeldschermen voor de weergave van de virtuele omgeving. Integreer een gating circuit voor het snel knipperen van de LED's tijdens de beeldvorming. Opmerking: Een inherent probleem in twee-foton beeldvorming tijdens visuele stimulatie is licht rook afkomstig van het visuele stimulatie systeem, die kan worden verminderd door het afschermen van de doelstelling. Echter, licht lekken van de visuele stimulatie systeem volledig worden afgeschaft door het synchroniseren van de lichtopbrengst van de projector om de ommekeer punten van de resonante scanner (wanneer gegevens niet worden verworven), zoals wordt gedaan met LED-arena gebruikt voor visuele stimulatie tijdens de beeldvorming in Drosophila ^18. Dit resulteert in een effectieve snelle afwisseling van visuele stimulatie en data acquisitie (zie figuur 2). De flikkering frequentie (24 kHz) is ordes van grootte hoger dan de flikkering fusie drempel, waarboven het trillen wordt niet langer gezien door het dier. De elektronische schema van deze wijziging een commerciële LED projector getoond in figuur 3.
4. Jongenil volgen
   1. Gebruik een CMOS-gebaseerde video-camera (30 fps) voor pupilpositie tracking. Zorg ervoor dat de camera een infrarood blocking filter bevat. Opmerking: De leerling is zichtbaar bij hoge contrast tijdens opnames als gevolg van strooilicht van de twee-foton excitatie laser verlaten door het oog. Pupilpositie en diameter wordt geëxtraheerd in real time met speciaal geprogrammeerde software gebaseerd op het ontwerp van Sakatani en Isa ^19.

2. Injectie van Genetische Calcium Indicator en Window Implant

De injectie van een calcium indicator ²⁰ en de implantatie van de craniale venster ²¹ worden uitgevoerd zoals eerder beschreven met de volgende toevoegingen:

1. Injecteer het virus in het gebied van belang met een glazen injectiepipet opgevuld met virusoplossing en op een druk injectiesysteem. Stel de druk afhankelijk van de pipet binnen-diameter, typisch ongeveer. 70-140 mbar tot ongeveer 100 nl van virusoplossing injecteren in de loop van 1-2 minuten. Laag Volume injectie pulsen bij lage frequentie (0,05 seconden pulsen bij 2 Hz) worden gebruikt om overloop van het virus aan de pipet tijdens injectie te voorkomen. Opmerking: Om het injectievolume bewaken, kan de pipet op kleine gemarkeerd , gelijkmatig verdeeld lengtes (bv. 0,5 mm) onder een stereo microscoop. Verplaatsing van de meniscus tussen de markeringen kan dan gebruikt worden om het geïnjecteerde volume te schatten.
2. Enkele weken na injectie moet dit leiden tot een bolus van dicht gemerkte cellen met een diameter van ongeveer 500 urn. Werkzaamheid van GECI expressie in het interessegebied afhankelijk van de keuze van GECI en promotor combinatie, en de infectieuze titer en serotype van het recombinante AAV gebruikt. Opmerking: Als een representatief voorbeeld injectie van AAV2/1-EF1α-GCaMP5 met een virale titer of 8 x 10 ¹² GC / ml in primaire visuele cortex van muis leidt bevredigende expressie ongeveer twee weken na de injectie (Figuur 1).
3. Het hoofd balk moet niet het gezichtsveld van de muis belemmeren, maar stijf genoeg om te zorgen voor een stabiele beeldvorming tijdens gedrag zou moeten zijn. Dit vereist meestal twee bevestigingspunten aan weerszijden van de kopboom (zie figuur 1). Om het hoofd bar aan de schedel goed vast, zorg ervoor om te maximaliseren en droog het gebied van de blootgestelde schedel waar de hoofd bar zal worden gehecht. Bovendien, met behulp van een scalpel of een spuit, krassen op de schedel om oppervlakkige groeven waardoor het oppervlak toenemende lijmen creëren. Bedek het bot met cyanoacrylaat weefselhechtmiddel voordat u het hoofd bar met tandheelkundige cement.

3. Experimentele procedure

1. Twee tot drie weken na virus injectie, controleer dan de craniale venster implantaat voor duidelijkheid en expressie onder epifluorescentie verlichting. Duidelijk zichtbaar en scherp gedefinieerde grenzen van oppervlakkige bloedvaten een goede indicatie dat het raam implantaat geschikt is voor beeldvorming (zie figuur 1).
2. Meet en pas laservermogen tot een waarde onder 50 mW bij het monster.
3. Zet de luchtstroom naar de bolvormige loopband.
4. Voor hoofd fixatie onder de microscoop, kort verdoven het dier met isofluraan om stress te verminderen. Plaats het dier in een isofluraananesthesie container en wacht tot het dier stopt met bewegen (ongeveer 10 sec). Haal het dier onmiddellijk hoofd repareren onder de microscoop.
5. Plaats de visuele weergave systeem zo dicht mogelijk bij het dier nog steeds de mogelijkheid om toegang tot het dier. Hoe minder visueel contact met het dier de experimentator, hoe minder stress zal het dier tijdens de beginfase van het experiment.
6. Zorg ervoor dat de craniale venster implantaat is vrij van stof en vuil. Schoon met waterindien nodig.
7. Solliciteer duidelijk ultrasound gel als onderdompeling medium tussen de craniale raam en water-immersie objectief. Dit lost de problemen van langzame verslechtering van het beeld als gevolg van water verdamping of lekkage en vermindert de noodzaak om een kegel te monteren op het hoofd bar om water vast te houden. Opmerking: Centrifuge de gel vóór gebruik om alle luchtbellen te verwijderen, en verzorgen alle lucht te creëren bellen tijdens het aanbrengen van de gel. Luchtbellen ernstig verminderen beeldkwaliteit.
8. Wikkel een stukje zwarte tape rond het doel en de hoofd bar voor lichte afscherming.
9. Verplaats de virtuele omgeving arena om zijn definitieve positie en pas de videocamera voor pupil tracking.
10. Stel de laser uitschakel de scan amplitude tijdens het experiment passen.
11. Start de opname van gegevens.

Resultaten

De beeldkwaliteit twee-foton calcium beeldvorming van celpopulaties gelabeld met een GECI grotendeels afhankelijk van de kwaliteit van de craniale venster implantaat. Twee weken na virus injectie de craniale venster moet worden gecontroleerd voor de duidelijkheid. Er mag geen granulatieweefsel of bot hergroei zichtbaar (Figuur 1A) zijn. Bovendien moet het patroon van oppervlakkige bloedvaten behouden en grenzen van de vasculatuur dienen nauwkeurig gedefinieerd. Tegelijkertijd kan GECI expressie worden g...

Discussie

De sleutel tot het succes van gedrags twee-foton beeldvorming is de stabiliteit van het preparaat op twee manieren:

1. In de loop van de dagen na de implantatie venster, kan ontstekingsreacties van het weefsel leiden tot verbetering van de vorming van granulatieweefsel en kraakbeen dat zal belemmeren of zelfs beeldvorming te voorkomen.
2. Tijdens het experiment de hersenen stabiel genoeg om te voorkomen bewegingsartefacten van beschadiging neurale activiteit met betrekking fluorescentiesignaal is.
...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Cover slips (diameter = 3-5 mm)	Menzel		venster implantaat
InSight DeepSee laser	Spectra-Physics		microscoop
12 kHz Resonance scanner	Cambridge Technology	G1-003-30026	microscoop
Galvanometer	Cambridge Technology	G6215H	microscoop
Digitizer	National Instruments	NI 5772	microscoop
FPGA	National Instruments	PXIe 7965R	microscoop
Acquisitiekaart	National Instruments	PCIe 6363	microscoop
Emissiefitter 525/50	Semrock	FF03-525/50-25	microscoop
Piëzo-elektrische z-aandrijving	Physikinstrumente	P-726.1CD	microscoop
Controller voor piëzo-elektrische aandrijving	Physikinstrumente	E665 LVPZT	microscoop
Objectief 16X, 0.8NA	Nikon	CFI75	microscoop
Stroomversterker	Femto	DHPCA-100	microscoop
Fotovermenigvuldigingsbuis	Hamamatsu		microscoop
USB-camera zonder IR-filter	ImagingSource	DMK22BUC03	pupil tracking
Objectief 50 mm	ImagingSource	M5018-MP	pupil tracking
Macro adapterringen	ImagingSource	LAexSet	pupil tracking
Optische computermuis	Logitech	G500	motion tracking
Plexiglas bal 20 cm	bijv. idee-shop.de	08797.00.15	virtuele omgeving
LED-projector	Samsung	SP-F10M	virtuele omgeving
Acquisitiekaart	National Instruments	NI 6009	virtuele omgeving
Panda3D game engine		www.panda3d.org	virtuele omgeving
Numpy bibliotheek voor Python		www.scipy.org	virtuele omgeving
Scipy bibliotheek voor Python		www.scipy.org	virtuele omgeving
NI-DAQmx driver	National Instruments	www.ni.com	virtuele omgeving
Ultragel gel	Dahlhausen	5701.0342.10	beeldvorming