Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Het ontwerpen van Silk-zijde Protein Alloy materialen voor biomedische toepassingen

17.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50891

⸱

13 augustus 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics and Astronomy, Rowan University, 2Department of Biomedical and Translational Sciences, Rowan University, 3Department of Biomedical Sciences, Cooper Medical School of Rowan University, 4Department of Chemistry and Biochemistry, Rowan University

In dit artikel

Samenvatting

Mengen is een efficiënte benadering van biomaterialen met een breed scala van eigenschappen en gecombineerde functies te genereren. Door het voorspellen van de moleculaire interacties tussen de verschillende natuurlijke zijde proteïnen, kunnen nieuwe zijde-zijde eiwit legering platforms met instelbare mechanische veerkracht, elektrische reactie, optische transparantie, chemische verwerkbaarheid, biologische afbreekbaarheid, of thermische stabiliteit worden ontworpen.

Samenvatting

Vezeleiwitten scherm verschillende sequenties en structuren die zijn gebruikt voor diverse toepassingen in biomedische gebieden zoals biosensoren, nanogeneesmiddelen, weefselregeneratie en geneesmiddelafgifte. Het ontwerpen van materialen op basis van de moleculaire schaal interacties tussen deze eiwitten zal helpen bij het genereren van nieuwe multifunctionele eiwit lichtmetalen biomaterialen met instelbare eigenschappen. Dergelijke legeringen materiaalsystemen voordelen ten opzichte van traditionele synthetische polymeren geven ook samen met de materialen biologische afbreekbaarheid, biocompatibiliteit en houdbaarheid in het lichaam. Dit artikel gebruikt de proteïne mengsels van wilde tussahzijde (Antheraea pernyi) en binnenlandse moerbei zijde (Bombyx mori) als een voorbeeld om bruikbare protocollen met betrekking tot deze onderwerpen, met inbegrip van hoe je eiwit-eiwit interacties te voorspellen door computationele methoden, hoe eiwitten legering produceren bieden oplossingen, hoe lichtmetalen systemen te verifiëren door middel van thermische analyse, en hoe variabel legering materialen te fabricerenwaaronder optische materialen met diffractie roosters, elektrische materialen met circuits coatings en farmaceutische materialen voor afgifte van geneesmiddel en de levering. Deze werkwijzen kunnen belangrijke informatie voor het ontwerpen van de volgende generatie multifunctionele biomaterialen op basis van verschillende eiwitten legeringen.

Inleiding

De natuur heeft strategieën ontwikkeld om afstembare en multifunctionele biologische matrices met een beperkt aantal structurele eiwitten produceren. Zo worden elastins en collagenen altijd samen in vivo de verstelbare sterke en functies voor specifieke weefsels 1,2 verschaffen. De sleutel tot deze strategie is het mengen. Mengen het mengen eiwitten met specifieke verhoudingen en is een technologische benadering van eenvoudige materiële systemen met instelbare en gevarieerde eigenschappen 3-5 te genereren. In vergelijking met synthetische strategieën 6,7 techniek kan ook mengen materiaal uniformiteit en de mogelijkheid om het materiaal verwerken vanwege het bedieningsgemak 8-16 verbeteren. Daarom is het ontwerpen van multifunctionele, biocompatibele eiwit legeringen is een opkomend gebied van medisch onderzoek. Deze technologie zal ook een systematische kennis van de invloed van natuurlijke proteïne matrices geven op cel-en weefsel functies, zowel in vitro en in vivo 10,17. Door het optimaliseren moleculaire interfaces tussen verschillende eiwitten kan-eiwit gebaseerde legeringen diverse lichaamsfuncties, zoals thermische stabiliteit bij verschillende temperaturen, elasticiteit diverse weefsels, elektrische gevoeligheid ondersteunen variabele organen en optische eigenschappen cornea weefselregeneratie 3 omvatten, 18-27. De uitkomst van deze studies zal een nieuw eiwit-materialen platform op het gebied van de biomedische wetenschappen bieden directe relevantie voor afstembare weefsel reparaties en ziekte behandelingen en verder leiden tot biologisch afbreekbare implantaten waar hun nieuwe therapeutische en diagnostische functies kunnen worden voor ogen 3.

Veel natuurlijke structurele eiwitten hebben kritische fysieke en bioactieve eigenschappen die kunnen worden benut als kandidaten voor het biomateriaal matrixen. Zijde uit verschillende soorten wormen, keratines van haren en wol, elastins en collageen uit verschillende weefsels, endiverse plantaardige eiwitten zijn enkele van de meest voorkomende structurele eiwitten gebruikt voor het ontwerpen van niet-eiwit gebaseerde materialen (Figuur 1) 18-27. In het algemeen kunnen deze eiwitten moleculaire secundaire structuren (bijvoorbeeld beta sheets voor zijde, of gewikkelde spoelen voor keratine) vanwege hun unieke repetitieve primaire aminozuursequenties 3,28-35 vormen. Deze eigenschappen bevorderen de vorming van zelf-geassembleerde macroscopische structuren met unieke functies op biologische interfaces gevraagd hun nut als een waardevolle bron van biopolymeermaterialen. Hier zijn twee soorten structurele eiwitten werden gebruikt (eiwit A van wilde tussahzijde en eiwit B van gedomesticeerde moerbei zijde als voorbeeld) om de algemene protocollen van de productie van verschillende eiwitten lichtmetalen biomaterialen demonstreren. De protocollen aangetoond onder deel 1: eiwit interactie voorspellingen en simulaties, deel 2: de productie van eiwitten legering oplossingen, en deel 3: productie van eiwitten legeringen systemen voor optische, elektrische en farmaceutische toepassingen.

figure-introduction-1
Figuur 1 Grondstoffen van verschillende structurele eiwitten die vaak worden gebruikt in ons laboratorium voor het ontwerpen-eiwit gebaseerde materialen, waaronder zijde uit verschillende soorten wormen, keratines van haren en wol, elastins uit verschillende weefsels, en diverse plantaardige eiwitten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1 Voorspelling van Protein Interactions

  1. Bioinfomatics Analyse van eiwitmoleculen
    1. Bezoek het National Center for Biotechnology Information website (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/), en zoek het eiwit namen die gebruikt zal worden voor de legering studie. Opmerking: In dit voorbeeld werden twee eiwitten gebruikt: proteïne A, dat de wild tussahzijde fibroin en eiwit B, die de interne moerbei zijdefibroïne. Voor eiwit A, kan het aminozuur sequenties gevonden worden in "fibroin [Antheraea pernyi] GenBank: AAC32606.1" (Antheraea pernyi is de Chinese (Eik) Tussah Mot). Voor eiwit B, kan het aminozuur sequenties gevonden worden in "fibroin zware keten voorloper [Bombyx mori] NCBI Reference Sequence: NP_001106733.1" en "fibroin lichte keten voorloper [Bombyx mori] NCBI Reference Sequence: NP_001037488.1" samen (Bombyx mori is de gedomesticeerde zijderups van de moerbeiboom).
    2. Selecteer en save de aminozuursequenties van de eiwitten A en B eiwit uit de database.
    3. Bezoek de ExPASy website (de SIB Bioinformatics Resource Portal) (www.expasy.org) of gebruik andere commerciële software de basis bioinfomatics gegevens van eiwitten berekenen op basis van de sequenties waaronder, maar niet beperkt tot, totale lading per molecule, hydrofobiciteit index het molecuul titratie curve van de moleculen bij verschillende pH-waarden, etc. Deze informatie wordt gebruikt als basiselementen voor de computersimulatie van eiwit interacties en helpt te begrijpen of deze twee eiwitten hebben sterke interacties. [Opmerking: Deze stap is niet juist voor elk detail van het eiwit interactie zoals die gebruikt worden in kleine peptiden of functionele eiwitten wetenschap voorspellen. Het doel van dit gedeelte is alleen om te voorkomen dat de productie van een proteïne mengsel met duidelijke macrophase scheidingen die niet een "legering" materiaal kan worden genoemd. Daarom kon de schatting bij benadering, maar ste zijne eiwit legering systeem kan worden gecontroleerd door een experimentele methode in stap 3.1 wordt beschreven met behulp van nauwkeurige thermische analyse].
  2. Computationele Simulatie van Protein Alloy systeem
    Hier wordt beschreven een werkwijze voor het eiwit legering te simuleren. Een simulatie programma is geschreven in C programmeertaal die kan worden gebruikt op een of multiprocessor computersysteem. Een rooster-veer-massa (LSM) model gebruikt om de legering eiwitten 36-39 simuleren. De LSM-model geeft een eenvoudige beschrijving van de netto kracht op een massa wanneer bevestigd aan een veer en kan men de kracht vergelijking om de beweging voor elke massa begrijpen lossen. Een eenvoudig programma algoritme om dit eiwit legeringssysteem modelleren met de LSM model als volgt gegeven:
    1. Vormen een eiwit als grofkorrelige deeltjes een massa m heeft.
    2. Gebruik een Hookean of een neo-Hookean voorjaar om een band 38,39 vertegenwoordigen. Door onderlinge verbinding van een eindig aantal deeltjes met veren, kan men make een sub-legering domein dat een stabiele bouwsteen van de legering-eiwitten vertegenwoordigt. Om verschillende soorten van obligaties in de intra-koppeling vertegenwoordigen, maken gebruik van verschillende veerconstanten / stijfheid.
    3. Modelleren het eiwit legering systeem als een materiaal bestaande uit dof-verknoopt sub-legeringen. Hier weer verschillende stijfheden werden gebruikt om verschillende banden tussen de verwevenheid van de sub-legeringen vertegenwoordigen.
    4. Het model van de band te breken en hervormingsproces door een Bell Model 40,41, waardoor zwakke bindingen mogen worden hervormd, maar sterke banden kan niet hervormen als ze eenmaal zijn gebroken. Wanneer het systeem voldoende wordt benadrukt (zowel op de intra-en inter-suballoy suballoy obligaties), kunnen obligaties worden gebroken en hervormd.
    5. Om vervorming effecten te onderzoeken van de legering-eiwitten wanneer ze gestresst, externe krachten toegepast op het systeem. Bij het oplossen van de kracht vergelijking (De wetten van Newton) verdelen deze krachten ook voor elk deeltje.
    6. Voor het modelleren van interactiestussen de oplossing (bijvoorbeeld water moleculen) en eiwitten, breng een extra sleepkracht of wrijvingskracht elk deeltje.
    7. Los de kracht vergelijking voor elk deeltje met de acties van elke kracht (de veerkracht van de obligatie, de externe kracht, en de wrijvingskracht).
    8. Bereken en extraheer de posities van de eiwitdeeltjes als functie van de tijd.
    9. Bereken de fysische grootheden die de legering-eiwitten te karakteriseren van de posities van de deeltjes.
    10. Wijzig de binding stijfheid in het programma interacties tussen verschillende eiwitten begrijpen. (De gemiddelde binding stijfheid wordt berekend op basis van de Young's modulus van het eiwit materialen. De Young's modulus van verschillende vezelig eiwit materialen kunnen worden verkregen, hetzij door Universal Trekproef 18, of rechtstreeks bij de vorige literatuur 2-4,18).

2 Productie van eiwit Alloy Solutions

Wild tussahzijde (proteïne A) en binnenlandse moerbei zijde (eiwit) worden hier geselecteerd als een voorbeeld van eiwit legering systeem. Dit protocol geeft eerst hoe je de wilde tussahzijde (proteïne A) oplossing te verkrijgen.

  1. Snijd rauwe wilde tussah zijdecocons of vezels bij een gewicht van 3 g.
  2. Maatregel 3 g natrium bicarbonaat of natriumcarbonaat (Opmerking: Bij gebruik van natriumcarbonaat, zal het molecuulgewicht van eiwitketens tijdens het kookproces 42 verminderen).
  3. Vul een 2 L bekerglas met gedestilleerd water (H2O). Plaats vervolgens het bekerglas op een hete podium, dek het af met aluminiumfolie en warmte aan de kook.
  4. Verwijder de aluminium folie deksel en voeg de gemeten natrium butyldicarbonaat langzaam in het kokende water, zodat het volledig oplossen. (Opmerking: De rol van natrium bicarbonaat is de "soap" schoon te maken uit aangesloten op het oppervlak van wilde zijde vezels oplosbare sericine eiwitten en andere onzuiverheden Bij gebruik oth.re aard eiwit vezels, selecteer dan corresponderende chemische middelen volgens de literatuur).
  5. Voeg de rauwe eiwit vezels (wilde zijde vezels) in het kokende water en laat koken gedurende 2-3 uur (Let op:. De kooktijd heeft kritische impact op het molecuulgewicht van eiwitketens 26,43 Men moet een geschikt moment te selecteren op basis de literatuur of door het uitvoeren van controle-experimenten 26,43. De kooktemperatuur kan ook worden aangepast om het molecuulgewicht van de eiwitketens 26,43,44) beïnvloeden.
  6. Na het koken zorgvuldig de eiwitvezels verwijderen met een spatel uit de oplossing en knijp ze om het overtollige water te verwijderen. (LET OP: De vezels zijn zeer heet!)
  7. Vervolgens dompel de vezels in een 2 L beker met koud gedestilleerd water, en was de vezels tweemaal gedurende 30 min elk met de onzuivere residu volledig van het vezeloppervlak. Droog de vezels in een zuurkast gedurende ten minste 12 uur.
  8. Smelt 45,784 g calcium nitrate (Ca (NO 3) 2) in een bekerglas op een vloeistof bij 65 ° C te vormen voor het oplossen van de wilde zijde eiwit vezels. (Opmerking: als u andere natuurlijke proteïne vezels, kiest u een overeenkomstige oplosmiddel om de eiwitten te ontbinden Hier kunt u ook 9,3 M LiSCN of LiBr oplossing, of een 85% fosfaat-oplossing voor het oplossen van verschillende zijde vezels te gebruiken..)
  9. Combineer de vezels en het oplosmiddel in een verhouding van 1 g vezel in 10 ml oplosmiddel. Laat de vezels oplossen bij 95 ° C gedurende 5 tot 12 uur. (Opmerking: De oplostijd is afhankelijk van het molecuulgewicht van eiwitten 26,43-45)
  10. Met behulp van spuiten, injecteer de wilde zijde oplossing in 12 ml dialyse cassettes (maximaal 1.000 MW als de cutoff-formaat) of in een verzegelde dialyse buizen (maximaal 1.000 MW als de cutoff grootte) en dialyseren tegen 2 L gedestilleerd water. (Opmerking: De injectie efficiëntie kan handhaven van de oplossing bij 35 ° C, omdat anders de viscositeit eiwitoplossing dramatisch toenemen bij kamertemperatuur). Verander het gedestilleerd water regelmatig om Ca verwijderen (NO 3) 2 oplosmiddelen in de oplossing (na 30 min, 2 uur, 6 uur, en vervolgens elke 12 uur gedurende 3 dagen. In totaal zullen er ongeveer 8 veranderingen water).
  11. Na 3 dagen, verzamel de eiwitoplossingen van de dialyse cassettes of buizen en het in een 13.000 rpm beoordelingscijfer buizen.
  12. Centrifugeer de oplossing gedurende 1 uur bij 3500 rpm bij 4 ° C 3x tot afzettingen te verwijderen. Na elke centrifuge draaien, trek snel de bovenstaande vloeistof in nieuwe buizen. Bewaar de uiteindelijke oplossing in een 4 ° C koelkast.
  13. Giet 5 ml eiwit oplossing op een polydimethylsiloxaan (PDMS) substraat of ander plat hydrofoob substraat en laat het goed drogen (dit duurt meestal meer dan 12 uur). Weeg de resterende vaste eiwit film en bereken de uiteindelijke oplossing concentratie gewichtspercentage (w / v%) = gemeten gewicht (in mg) ÷ 5 (in ml) ÷ 10.
  14. Verzamel een andere geselecteerde natuurlijke eiwit vezels (in dit case werd geacclimatiseerd moerbeizijde als het eiwit B), en herhaal bovenstaande proces met een geschikt "soap" en oplosmiddel zijn, totdat de uiteindelijke eiwit wateroplossing met gemeten concentratie wordt verkregen. [Opmerking: Als het eiwit materialen zijn in de vorm van poeder, gebruik dan een geschikte poreuze buizen of membranen om de monsters te houden tijdens de "inzepen" proces. Als het eiwit reeds gezuiverd, eens stap 2.8 het poeder oplost. Indien het proteïne al gezuiverd en is wateroplosbaar, maak waterige oplossing met een gewenste concentratie eerst en dan naar beneden naar stap 2.15 mengsel eiwitoplossingen maken.]
  15. Langzaam verdunnen de Proteïne A oplossing (here wild zijde oplossing) in gedestilleerd water bij 4 ° C een 1,0 gew% eiwit vormen een waterige oplossing. Doe hetzelfde proces voor eiwit B (hier gedomesticeerd zijde).
  16. Roerend de 1 gew% proteïne A oplossing B Protein oplossing bij 4 ° C met behulp van een pipet om p vermijdenrotein aggregatie tijdens het mengen. (Opmerking 1: niet een vortex instrument te gebruiken om de eiwitten te mengen, omdat sommige eiwitten (bijvoorbeeld zijde) hydrogels zal vormen tijdens de trilling 46,47 Opmerking 2:. Indien mogelijk, gebruik van extra apparaten op de mengverhouding en het mengen van grootte, waardoor controle ervoor om ze te mengen zo langzaam mogelijk om aggregatie te voorkomen. Laat snel niet de oplossing pipet tijdens het mixen).
  17. De uiteindelijke mengen oplossingen moeten een bepaalde massaverhouding of een molaire verhouding van Proteïne A zijn: Protein B. Doorgaans mengen met massaverhouding van 90:10, 75:25, 50:50, 25:75, 10:90 verkrijgen een breed spectrum van legering oplossingen. Gebruik zuivere eiwit A en eiwit B oplossingen als controlegroep. Voor een menging oplossing met een molaire verhouding van Proteïne A: Proteïne B = R: (100-R). Bereken het mengen volumeverhouding (gebaseerd op eenzelfde 1 gewichts% oplossing) door: deel A: Deel B = R · (MW A): (100 R) · (MW B).
  18. Onmiddellijk wierp de laatste oplossingen op PDMS substraten om films of andere desi vormenbestaande situaties materialen. (Opmerking: hoge concentratie eiwit legering oplossingen niet gedurende langere tijd meer aggregaten vormen later door de eiwit-eiwit interacties in water.). Indien nodig, verdunnen het mengsel oplossingen met-ion vrij gedestilleerd water en bewaar ze op een 4 ° C koelkast om extra proteïne aggregatie in oplossingen te vermijden.

3 Fabrication van Variable Protein Alloy Materials

  1. Bevestig Alloy Voorspelling door Thermal Analysis 3,9,31-35
    1. Bereid PDMS substraten en maak ze schoon door het weken in gedestilleerd water.
    2. Wierp het eiwit mix oplossingen met verschillende mengverhoudingen op de PDMS substraten.
    3. Droog de oplossingen voor ten minste 12 uur in een chemische kap met luchtstroom tot films worden gevormd (Let op: Gebruik dezelfde volume voor verschillende oplossingen zodat de dikte van de films kunnen worden vastgesteld).
    4. Verwijder het eiwit legering films uit de PDMS substraten en leg ze op een schone vaat.
    5. Weeg veel Differential Scanning Calorimetrie (DSC) aluminium pannen en deksels voor DSC studie. Overeenkomen met de pan en het deksel paren een gelijk totaal gewicht hebben (gewicht van de pan plus het gewicht van het deksel is gelijk aan een constant gewicht). Bijvoorbeeld, hier een totaal gewicht van het deksel en pan 22,50 mg werd gebruikt, en acht sets van deksel en pan combinaties met dit totaalgewicht bereid.
    6. Kapselen 6 mg elke soort gedroogd eiwit past in aluminium DSC pannen en verzegelen ze met hun afgedekte deksels in proces 3.1.5. Verbinding een lege pan en het deksel pair voor gebruik met het monster als referentie zodat alleen de warmtecapaciteit monsters zelf zullen tijdens de thermische analyse (NB opgenomen: De DSC wordt de warmtecapaciteit van referentie pan + deksel tegen dat vergelijk van het monster + pan + deksel. Vanwege de gelijke gewichten, zal de achtergrond warmtecapaciteit van de pannen en deksels worden verantwoord waardoor alleen de warmtecapaciteit van het monster in de pan).
    7. Zet verzegeld referenties en monster pannen in een DSC-instrument, metdoorgeblazen droog stikstofgas van 50 ml / min, en voorzien van een gekoelde koelsysteem. Voordat het monster metingen moet de DSC instrument eerst gekalibreerd met saffier en indium warmtestroom en temperatuur respectievelijk.
    8. Voorlooptijd de DSC met een verwarmingssnelheid van 2 K / min tot 150 ° C en houdt bij deze temperatuur gedurende 15 min om alle resterende watermoleculen in de monsters (typisch ongeveer 3-10% van het totale gewicht) te verwijderen. Snel afkoelen (10 K / min) tot 25 ° C.
    9. Voer de DSC opnieuw bij een verwarmingssnelheid van 2 K / min tot 300 ° C, of tot de achteruitgang piek van eiwit mengsels weergegeven 34. Noteer de warmtecapaciteiten van het eiwit monster bij verschillende temperaturen tijdens dit proces. Afkoelen DSC en oude monster veranderen in nieuw monster met een andere mengverhouding.
    10. Berekenen en plotten de warmtecapaciteit versus temperatuur curves voor elk eiwit mix monster met behulp van de DSC-software 31-35.
    11. Oordelen over de miscibility eiwit blends door de volgende werkwijze (zie Figuur 4 Thermische en figuur 5) en als de twee eiwitten volledig mengbaar, ook genaamd "eiwit legeringen". Anders wordt de term "eiwit composiet" zou een geschikte naam zijn volgens polymeer beschrijvende theorieën 48,49):
      1. De afzonderlijke eiwitten A en B moeten individuele regeling glasovergangen temperatuur, Tg (A) en Tg (B) (De groene en blauwe curven in figuur 5) 3,48 hebben;
      2. Deze enkele glasovergangstemperatuur doorgaans tussen die van de twee individuele eiwitcomponenten, Tg (A) en Tg (B) (zie Figuur 5) 3,48;
      3. Mengbare mengsels fasescheiding wordt verkregen als zowel Tg (A) en Tg (B) bleek hun oorspronkelijke positie (figuur 5), en met elke Tg staphoogte in verhouding tot de samenstelling, de twee eiwitten volledig mengbaar 3,48.
      4. Semi-mengbare composietmengsel type zal een zeer breed glasovergangstemperatuur hebben, of kunnen nog twee glasovergangen, maar elk heeft dichter bij elkaar ten gemigreerd naar de pure eiwitcomponenten, Tg (A) en Tg (B) ( zie figuur 5). In dit geval kunnen er micro-heterogene fase structuren gevormd tussen de twee eiwit componenten, en de samenstelling kan variëren van plaats tot plaats.
    12. If (3.1.11.1) is het in DSC geval, en kan worden bevestigd dat het eiwit AB is een legering systeem, dan naar eiwit legeringen fabriceren.
  2. Fabricage van optische materialen door Protein Alloys
    1. Produceren (in de fabricage lab) of de aanschaf van een ontworpen topografische ondergrond voor het gieten. In dit specifieke voorbeeld, een glas met vier diffractiepatronen werd gebruikt (figuur 4Optisch).
    2. Plaats het glas met diffractie patronen in een schaal, en zorg ervoor dat het oppervlak met patroon wordt opwaarts geconfronteerd.
    3. Verdeel PDMS oplossing gelijkmatig op het glas en de oppervlakte patronen volledig bedekken (PDMS De oplossing wordt door ingieten en katalysatoroplossing in een 9: 1 mengverhouding volgens de gebruiker instructies 23,44).
    4. Plaats het gieten schaal in een 65 ° C oven gedurende ten minste 2 uur terwijl op een vlakke ondergrond. De PDMS oplossing, drogen in een vast substraat tijdens dit proces.
    5. Verwijder PDMS substraat uit het glas. De diffractiepatronen moet nu naar de PDMS oppervlak.
    6. Pons de PDMS mallen met diffractie patronen met behulp van een geschikte perforator.
    7. Drop eiwit legering oplossingen op de PDMS oppervlakken diffractiepatronen en drogen gedurende ten minste 12 uur folies met diffractiepatronen te verkrijgen.
    8. Onoplosbare eiwitten legeringen te verkrijgen, plaatst u de gehele set van dry films, waaronder de PDMS mallen in een 60 ° C vacuümoven (25 kPa) met een waterbak op de bodem van de kamer. Pomp lucht in de oven, en laat het water dampen gloeien monsters gedurende minstens 2 uur. (Dit proces heet temperatuurgestuurde waterdamp gloeien 45. Vergelijken met de veel gebruikte methanol methode, kan het vergelijkbaar beta-sheet-gehalte in de zijde materialen 45 genereren). Hef het vacuum op en trek het niet in water oplosbare film van de PDMS substraat met behulp van een tang. In dit voorbeeld zijn wild-zijde geacclimatiseerd zijde legeringen gebruikt.
    9. Test de kwaliteit van diffractiepatronen van films door vergelijking met de originele patronen op het glas (bijvoorbeeld verzamelen SEM afbeeldingen voor de micro-schaaldetails, verzamel laser diffractie patronen voor het algemene patroon kwaliteit).
  3. Fabricage van elektrische schakelingen op Protein Alloys Materials
    1. Om een ​​elektrisch circuit patroon op glas substraat fabriceren, eerste cleana glasplaatje met een ontvettingsmiddel zoals Alconox in een ultrasoon reiniger voor 5 min, gevolgd door 5 min in aceton, gevolgd door 5 min in methanol. De methanol wordt de laatste gebruikt, omdat het verdampt langzamer dan aceton, zodat kan worden afgeblazen de ondergrond in plaats van drogen en resten achter te laten.
    2. Blaas het glaasje droog met droog stikstofgas dat wordt gegenereerd door de kook-off van een 180 L vloeibare stikstof Dewar.
    3. Introduceer het substraat materialen in de afzettingskamer. (Deze richtlijnen zijn voor een sputterende systeem, maar andere depositie technieken kunnen worden gebruikt.) Als de kamer is ontworpen met een loadlock, wordt het vacuüm in de afzettingskamer niet significant beïnvloed. Evacueren de loadlock tot een druk van 30 mTorr.
    4. Open de afsluiter tussen de uitvoerlaadsluis en de belangrijkste afzettingskamer en introduceren het substraat in de kamer.
    5. Zet het Ar gas en de drukregelaar en de controle van de druk om de gewenste deposition druk. Een hogere druk geeft een lager energieverbruik sputterde metaalatomen en meer uniforme films, terwijl een lagere druk tot betere aanhangen sneller gedeponeerde films. Het gebied van drukken is over het algemeen tussen 3 mTorr en 60 mTorr, met 20 mTorr goed werken.
    6. Metalen worden dan geprojecteerd op een sluiter die het substraat bekleden met een RF vermogen van 100 W. tuning circuit nodig om het HF-vermogen aan de metalen doel richten beschermt. DC voeding kan worden gebruikt in plaats van RF voor metalen doelen. Om oxide lagen en verontreinigingen van het doel te verwijderen, pre-sputteren enkele minuten.
    7. Open de sluiter en sputteren de metalen op de ondergrond. De depositie tarief voor de beschreven configuratie is ongeveer 10 nm per min. Dit tarief is afhankelijk van het werk afstand, druk, magneet kracht in de magnetron kathode, doel dikte en de metalen sputterde. Stel de afzettingstijd om de gewenste dikte te bereiken.
    8. Verwijder de beklede glazen dia dekamer.
    9. Met behulp van een spinner, spin fotoresist coating op het oppervlak van de film. Vele resists worden gebruikt. Voor dit geval werd een positieve fotoresist gebruikt.
    10. Nadat de resist wordt gesponnen op de film zacht bakken bij 90 ° C gedurende 5 min drogen de resist.
    11. Plaats een contact masker met een afbeelding van de inrichting stevig tegen de resist. Een UV-lichtbron wordt gebruikt om de fotoresist bloot. De belichting 10 sec, maar varieert afhankelijk van de sterkte van de lichtbron en de resist gebruikt.
    12. Plaats de film in de fotolak ontwikkelaar totdat het geprojecteerde beeld verschijnt. De ontwikkelaar spoelt de resist die is blootgesteld aan het UV-licht dat het breken van het polymeer bindingen veroorzaken. Onmiddellijk na het beeld verschijnt, dompel de film in DI water om de ontwikkelaar te stoppen van het werken aan de niet-blootgestelde fotolak.
    13. Blaas de films droog met droog stikstofgas.
    14. Plaats de films in een oven bij 120 ° C gedurende 15 min "hard bakken" de fotoweerstaan.
    15. Na de films afkoelen, leg ze in een ets oplossing totdat de metalen niet beschermd door de fotolak stijgt op. Dip in water om de ets stoppen.
    16. Spoelen met aceton om het geharde fotolak verwijderen.
    17. Spoelen met methanol en föhnen met droge stikstof.
    18. Nadat de beklede glazen klaar, vallen ander eiwit legering oplossingen op de glasoppervlakken en droog ze ten minste 12 uur eiwit legering films op glazen verkrijgen. (Voorgesteld wordt eerst de legering oplossingen 5 gew% concentraat dikke eiwit legering films te verkrijgen.)
    19. Vanwege de hydrofobe-hydrofiele interacties, zal de dunne metalen folies worden overgedragen door de glasoppervlakken bijgaande eiwit legeringsfilm oppervlakken 51. Trek het eiwit legering films met de dunne metalen patronen uit de glazen substraten met behulp van een tang.
    20. Onoplosbare eiwitten legeringen te verkrijgen, plaatst u de droge films in een 60 ° C vacuüm oven (25 kPa) met awater schaal op de bodem van de kamer. Pomp lucht in de oven, en laat het water dampen gloeien monsters gedurende minstens 2 uur. Hef het vacuum op en trek het niet in water oplosbare film van het substraat met behulp van een tang.
    21. Test de elektrische eigenschappen van metaalpatronen op proteïne legering films zoals elektrische weerstand en te vergelijken met de oorspronkelijke patronen op het glas.
  4. Fabricage van farmaceutische stoffen door Protein Alloys
    1. Een eiwit legering films met farmaceutische verbindingen fabriceren, eerst bereid een PDMS substraat zoals beschreven in stap 3.2. Reinig de gevormde PDMS substraat door gedestilleerd water.
    2. Oplossen of dispergeren van de farmaceutische verbindingen in een waterige oplossing. Gebruik echografie of vortex de farmaceutische verbindingen homogeen mengen met het water. Indien de verbindingen niet wateroplosbaar, dispergeren de poeders met een homogene verdeling in de ion-vrij gedestilleerd water.
    3. Bereken de gewenste massaverhoudingverbindingen van het eiwit legeringen door: volume van verbinding oplossing x gewichtspercentage van verbinding oplossing: volume eiwit legering oplossing x gewichtspercentage van verbinding oplossing (hier 1 gew% aluminium werd gebruikt). Selecteer een verhouding van een film met gewenste verbinding dichtheid in het eiwit legeringsfilm verkrijgen.
    4. De verbinding oplossing met het eiwit legering oplossing volgens dezelfde aanwijzingen in hoofdstuk 2 proces 2.16 langzaam mengen. (Let op: Om te geleren te voorkomen, niet ultrasonicate of vortex de oplossing tijdens het mengen).
    5. Giet een berekende volume van het mengsel op de PDMS substraat en drogen ten minste 12 uur in een chemische kap een verkrijgen eiwit legeringsfilm die een verhouding gemaakt van farmaceutische verbindingen.
    6. Fysiek verknoopt de film volgt dezelfde instructie in paragraaf 3.2 proces 3.2.8. Een voorbeeld van aluminium films met onoplosbare model geneesmiddelen met een lage dichtheid (LD) of hoog (HD) dichtheid te zien in figuur 4 Chemical.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Typische eiwit-eiwit interacties (bijvoorbeeld tussen eiwit A en eiwit B) kunnen lading-lading (elektrostatisch) attracties waterstofbinding vorming, hydrofobe-hydrofiele interacties, alsmede dipool, oplosmiddel, tegenion en entropische effecten tussen de specifieke bevatten domeinen van twee eiwitten (figuur 2) 3. Daarom fundamenteel, we kunnen de effecten van deze interacties door computationele simulaties voorspellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Een van de meest kritische procedures productie "legering" eiwit systeem is de mengbaarheid van het gemengde eiwitten verifiëren. Anders is uitsluitend mengbaar eiwitmengsel of proteïne samengestelde systeem zonder stabiel en afstembare eigenschappen. Een experimentele thermische analyse methode kan worden gebruikt voor dit doel en hun legeringen eigenschappen bevestigen. Eiwit-eiwit interacties kunnen worden bekeken volgens Flory-Huggins's roostermodel 48 interactie tussen het "oplosmiddel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

De auteurs danken Rowan University voor de ondersteuning van dit onderzoek. XH ook dankzij Dr David L. Kaplan aan de Tufts University en de NIH P41 Tissue Engineering Resource Center (TERC) voor de voorafgaande technische trainingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Q100 Differential Scanning Calorimeters (DSC)TA Instruments, New Castle, DE, USA
N/AJe kunt elk type DSC gebruiken met een software om de warmtecapaciteit te berekenen.
SS30T Vacuum Sputtering System T-M Vacuum Products, Inc., Cinnaminson, NJ, USAN/AMet op maat gemaakte onderdelen; je kunt elk type sputtering systeem gebruiken om te coaten.
VWR 1415M Vacuum OvenVWR International, Bridgeport, NJ, USAN/AJe kunt elk type vacuümoven gebruiken om de monsters fysiek te crosslinken.

Referenties

  1. Rosenbloom, J., et al. Extracellular matrix 4: The elastic fiber. FASEB J. 7, 1208-1218 (1993).
  2. Traub, W., et al. On the molecular structure of collagen. Nature. 221, 914-917 (1969).
  3. Hu, X., et al. Protein-Based Composite Materials. Materials Today. 15, 208-215 (2012).
  4. Hardy, J. G., Scheibel, T. R. Composite materials based on silk proteins. Progress in Polymer Science. 35, 1093-1115 (2010).
  5. Kidoaki, S., et al. Mesoscopic spatial designs of nano- and microfiber meshes for tissue-engineering matrix and scaffold based on newly devised multilayering and mixing electrospinning techniques. Biomaterials. 26, 37-46 (2005).
  6. Teng, W. B., et al. Recombinant silk-elastin like protein polymer displays elasticity comparable to elastin. Biomacromolecules. 10, 3028-3036 (2009).
  7. Foo, C. W. P., Kaplan, D. L. Genetic engineering of fibrous proteins, spider dragline, silk and collagen. Adv Drug Delivery Rev. 54, 1131-1143 (2002).
  8. Hu, X., et al. Charge-Tunable Autoclaved Silk-Tropoelastin Protein Alloys That Control Neuron Cell Responses. Adv. Funct. Mater. 23, 3875-3884 (2013).
  9. Hu, X., et al. Biomaterials derived from silk-tropoelastin protein systems. Biomaterials. 31, 8121-8131 (2010).
  10. Hu, X., et al. The influence of elasticity and surface roughness on myogenic and osteogenic-differentiation of cells on silk-elastin biomaterials. Biomaterials. 32, 8979-8989 (2011).
  11. Hu, X., et al. Biomaterials from ultrasonication-induced silk fibroin-hyaluronic acid hydrogels. Biomacromolecules. 11, 3178-3188 (2010).
  12. Gil, E. S., et al. Swelling behavior and morphological evolution of mixed gelatin/silk fibroin hydrogels. Biomacromolecules. 6, 3079-3087 (2005).
  13. Lu, Q., et al. Green process to prepare silk fibroin/gelatin biomaterial scaffolds. Macromol. Biosci. 10, 289-298 (2010).
  14. Lu, S., et al. Insoluble and flexible silk films containing glycerol. Biomacromolecules. 11, 143-150 (2010).
  15. Mandal, B. B., et al. Silk fibroin/polyacrylamide semi-interpenetrating network hydrogels for controlled drug release. Biomaterials. 30, 2826-2836 (2009).
  16. Yeo, I. S., et al. Collagen-based biomimetic nanofibrous scaffolds, preparation and characterization of collagen/silk fibroin bicomponent nanofibrous structures. Biomacromolecules. 9, 1106-1116 (2008).
  17. Holst, J., et al. Substrate elasticity provides mechanical signals for the expansion of hemopoietic stem and progenitor cells. Nat. Biotechnol. 28, 1123-1128 (2010).
  18. Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. New Opportunities for an Ancient Material. Science. 329, 528-531 (2010).
  19. Qin, G., et al. Mechanism of resilin elasticity. Nature Communications. 3, 1003(2012).
  20. Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nat. Protocols. 6, 1612-1631 (2011).
  21. Wise, S. G., et al. Engineered tropoelastin and elastin-based biomaterials. Adv Protein Chem Struct Biol. 78, 1-24 (2009).
  22. Amsden, J. J., et al. Rapid nanoimprinting of silk fibroin films for biophotonic applications. Adv. Mater. 22, 1746-1749 (2010).
  23. Lawrence, B. D., et al. Silk film biomaterials for cornea tissue engineering. Biomaterials. 30, 1299-1308 (2009).
  24. Kim, D. H., et al. Dissolvable films of silk fibroin for ultrathin conformal bio-integrated electronics. Nat. Mater. 9, 511-517 (2010).
  25. Zhang, J., et al. Stabilization of vaccines and antibiotics in silk and eliminating the cold chain. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 11981-11986 (2012).
  26. Pritchard, E. M., et al. Effect of silk protein processing on drug delivery from silk films. Macromolecular Bioscience. 13, 311-320 (2013).
  27. Lammel, A. S., et al. Controlling silk fibroin particle features for drug delivery. Biomaterials. 31, 4583-4591 (2010).
  28. Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. J Phys Chem B. 101, 11007-11028 (1997).
  29. Shao, Z., Vollrath, F. Materials: Surprising strength of silkworm silk. Nature. 418, 741-741 (2002).
  30. Jin, H. J., Kaplan, D. L. Mechanism of silk processing in insects and spiders. Nature. 424, 1057-1061 (2003).
  31. Hu, X., et al. Determining Beta-Sheet Crystallinity in Fibrous Proteins by Thermal Analysis and Infrared Spectroscopy. Macromolecules. 39, 6161-6170 (2006).
  32. Hu, X., et al. Dynamic Protein-Water Relationships during β-Sheet Formation. Macromolecules. 41, 3939-3948 (2008).
  33. Hu, X., et al. Microphase separation controlled beta-sheet crystallization kinetics in fibrous proteins. Macromolecules. 42, 2079-2087 (2009).
  34. Cebe, P., et al. Beating the Heat - Fast Scanning Melts Beta Sheet Crystals. Scientific Reports. 3, 1130(2013).
  35. Pyda, M., et al. Heat Capacity of Silk Fibroin Based on the Vibrational Motion of Poly(amino acid)s in the Presence and Absence of Water. Macromolecules. 41, 4786-4793 (2008).
  36. Buxton, G. A., et al. A lattice spring model of heterogeneous materials with plasticity. Model. Simul. Mater. Sci. Eng. 9, 485-497 (2001).
  37. Buxton, G. A., Balazs, A. C. Modeling the dynamic fracture of polymer blends processed under shear. Phys. Rev. B. 69, 054101(2004).
  38. Kolmakov, G. V., et al. Harnessing labile bonds between nanogel particles to create self-healing materials. ACS Nano. 3, 885-892 (2009).
  39. Duki, S. F., et al. Modeling the nanoscratching of self-healing materials. J. Chem. Phys. 134, 084901(2011).
  40. Bell, G. I. Models for the specific adhesion of cells to cells. Science. 200, 618-627 (1978).
  41. Bell, G. I., et al. Cell adhesion. Competition between nonspecific repulsion and specific bonding. Biophys. J. 45, 1051-1064 (1984).
  42. Wang, Q., et al. Effect of various dissolution systems on the molecular weight of regenerated silk fibroin. Biomacromolecules. 14, 285-289 (2013).
  43. Wray, L. S., et al. Effect of processing on silk-based biomaterials: reproducibility and biocompatibility. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 99, 89-101 (2011).
  44. Lawrence, B. D., et al. Silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design. J. Vis. Exp. (62), e3646(2012).
  45. Hu, X., et al. Regulation of Silk Material Structure by Temperature-Controlled Water Vapor Annealing. Biomacromolecules. 12, 1686-1696 (2011).
  46. Yucel, T., et al. Vortex-induced injectable silk fibroin hydrogels. Biophys J. 97, 2044-2050 (2009).
  47. Yucel, T., et al. Non-equilibrium silk fibroin adhesives. J Struct Biol. 170, 406-412 (2010).
  48. Flory, P. J. Principles of polymer chemistry. , Cornell University Press. Ithaca, N.Y.. (1953).
  49. Chen, H., et al. Thermal properties and phase transitions in blends of Nylon-6 with silk fibroin. J Therm Anal Calorim. 93, 201-206 (2008).
  50. Scabarozi, T. H., et al. Epitaxial growth and electrical-transport properties of Ti7Si2C5 thin films synthesized by reactive sputter deposition. Scripta Materialia. 65, 811-814 (2011).
  51. Tao, H., et al. Silk materials-a road to sustainable high technology. Adv Mater. 24, 2824-2837 (2012).
  52. Annabi, N., et al. Cross-linked open-pore elastic hydrogels based on tropoelastin, elastin and high pressure CO2. Biomaterials. 31, 1655-1665 (2010).
  53. Moll, R., et al. The human keratins: biology and pathology. Histochem Cell Biol. 129, 705-733 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

ZijdeproteïnemengselsCoating van Elektrische CircuitsRegeneratie van Proteïne-oplossingenFabricage van Dunne FilmsThermische AnalyseOptische MaterialenElektrische MaterialenFarmaceutische MaterialenProteïne-proteïne-interacties
Het ontwerpen van Silk-zijde Protein Alloy materialen voor biomedische toepassingen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.