Vroege Metamorfe Insertion technologie voor Insect Flight Behavior Monitoring

Summary

We presenteren een nieuwe chirurgische procedure om elektroden te implanteren in Manduca sexta tijdens de vroege metamorfe stadia. Deze techniek maakt mechanisch stabiele en elektrisch betrouwbare koppeling mogelijk met het neuromusculaire weefsel om de neurofysiologiedynamiek van de vlucht te bestuderen. We presenteren ook een nieuwe magnetische levitatieplatform voor getouwd onderzoek van insectenyaw.

Abstract

Early Metamorphosis Insertion Technology (EMIT) is een nieuwe methodologie voor het integreren van microfabriceerde neuromusculaire opname- en activeringsplatforms op insecten tijdens hun metamorfe ontwikkeling. Hier worden de implantaten versmolten binnen de structuur en functie van het neuromusculaire systeem als resultaat van metamorfe weefselherstelling. De implantaten komen met het insect naar voren waarbij de ontwikkeling van weefsel rond de elektronica tijdens de popontwikkeling resulteert in een bio-elektrisch en biomechanisch verbeterde weefselinterface. Deze relatief betrouwbaardere en stabielere interface zou gunstig zijn voor veel onderzoekers die de neurale basis van de insectenlocomotion verkennen met verminderde traumatische effecten veroorzaakt tijdens invoegingen in het volwassen stadium. In dit artikel implanteren we onze elektroden in de indirecte vliegspieren van Manduca sexta. Gelegen in de dorsale-thorax, activeren deze belangrijke vliegkracht-leverende dorsoventrale en dorsolongitudinale spieren de vleugels en leveren de mechanische kracht voor op- en neerwaartse bewegingen. Relatieve contractie van deze twee spiergroepen is onderzocht om te onderzoeken hoe de giermanoeuvre neurofysiologisch wordt gecoördineerd. Om de vliegdynamica te karakteriseren, worden insecten vaak vastgebonden met draden en hun vlucht wordt opgenomen met digitale camera's. We hebben ook een nieuwe manier ontwikkeld om Manduca sexta vast te maken op een magnetisch zwevend frame waarbij het insect is verbonden met een commercieel verkrijgbare draadloze neurale versterker. Deze set-up kan worden gebruikt om de vrijheidsgraad tot “alleen” gieren te beperken terwijl de gerelateerde elektromyografiesignalen van dorsoventrale en dorsolongitudinale spiergroepen worden verzonden.

Introduction

Plaatsen van elektroden, zelfs met aangebouwde elektronische systemen om insecten voor telemetrische opname toepassingen, heeft een belangrijke methode om te begrijpen hoe neurale systemen functie gedurende natuurlijke vlucht ¹ geweest. Het bevestigen of het implanteren van kunstmatige systemen bij insecten heeft gesteld vele uitdagingen met betrekking tot de mogelijkheden om de natuurlijke vlucht van het insect verstoren. Oppervlakkige attachment of chirurgische inbrengen van kunstmatige platforms op het volwassen insect is onbetrouwbaar vanwege mogelijke verschuiving van de geplaatste apparaten door-lichaam geïnduceerde traagheids en stress krachten. Oppervlakkig bevestigd of chirurgisch ingebracht elektroden zijn ook gevoelig door de insecten als een vreemd lichaam te worden afgewezen. Bovendien is de implantatie operatie vereist het verwijderen van schalen en palen rond het exoskelet. De dikke cuticula moet ook worden doorboord voor chirurgische innervaties die collaterale weefselbeschadiging kunnen veroorzaken, waardoor het interfereert met de natuurlijke vlucht van het insect. Alle teze factoren kunnen een chirurgische of oppervlakkige implantatie operatie een uitdagende en delicate taak. Om deze problemen betrokken bij extern verbonden controle-en sensorsystemen om de insecten te verlichten, zal een nieuwe methodologie waarbij metamorfe groei worden beschreven in dit artikel.

De metamorfe ontwikkeling van holometabolic insecten begint met de omzetting van de larve (of nimf) in een volwassene met een tussenproduct popstadium (figuur 1). De metamorfose proces omvat een uitgebreid weefsel herprogrammering waaronder degeneratie gevolgd door verbouwing. Deze transformatie wordt een aardse larve tot een volwassen insect demonstreren diverse complexe gedragingen ^2,3.

De overleving van insecten na extreme parabiotic operaties is aangetoond wanneer de operaties tijdens de vroege stadia metamorfe ^4,5 uitgevoerd. In deze operaties, de ontwikkelingsdoelen histogenese Caused chirurgische wonden worden gerepareerd kortere lengtes. Na deze waarnemingen is een nieuwe techniek ontwikkeld waarbij de implantatie van elektrisch geleidende elektroden werd uitgevoerd tijdens de vroegere stadia van metamorfe groei (figuur 1). Dit zorgt voor een biomechanisch veilige gehechtheid op het insect ^6. Een zeer betrouwbare interface is ook beveiligd met neurale het insect en neuromusculaire systemen ^7. Deze techniek staat bekend als "Early metamorfose Insertion Technology" (EMIT) ^8.

Na de herbouw van het gehele weefsel systeem, structuren opgenomen in de pop tevoorschijn met de volwassen insect. Vlucht spiergroepen aan tot 65% van het totale thoracale lichaamsgewicht en dus is een relatief gemakkelijke doelwit voor de EMIT procedure ^9. Tijdens de basis vleugelslag, de veranderingen in de morfologie van de vlucht voeden dorsolongitudinal (dl) en de dorsoventral (dv) spieren veroorzaken de vleugel articulation geometrie lift ¹⁰ genereren. Daarom is de functionele coördinatie van dl en dv spieren heeft een actief onderwerp van onderzoek onder vlucht neurofysiologie geweest. Tethering insecten in elektronisch geprogrammeerd visuele omgevingen is de meest voorkomende methode is voor het bestuderen van de neurofysiologie van complexe motorische gedrag ^11,12. Cilindrische arena samengesteld lichtdiode panelen zijn gebruikt voor deze virtuele-realiteit omgevingen waar vliegende insecten worden aangebonden in het midden en de beweging wordt gesimuleerd door het dynamisch bijwerken van de omliggende panoramische visuele weergave. Bij kleinere insecten zoals fruitvlieg Drosophila, wordt tethering bereikt door het aanbrengen van een metalen pin om de dorsale thorax van het insect en het de pen onder een permanente magneet ^13,14. Deze methode maakt het alleen kwantificering van motorische reacties door middel van visuele waarnemingen met high speed camera's zonder enige elektrofysiologische analyse. Bovendien, deze method is gebleken in de grotere en zwaardere lichaam van Manduca sexta schorsen geweest. Om dit probleem op te lossen, hebben we geprofiteerd van magnetisch zwevende frames waar lichtgewicht frames met magneten bevestigd aan de onderkant zijn zweven door elektromagnetische krachten. In combinatie met de in de handel verkrijgbare neurale versterkers en LED-arrays, biedt dit een platform voor vlucht-motorvermogen controleren en registreren de gerelateerde elektrofysiologie van Manduca sexta.

Protocol

OPMERKING: De bron van de materialen en reagentia vereist om het protocol te volgen wordt verwezen naar de "Reagents" onderstaande tabel.

1. Voorbereiden van Printed Circuit Boards (PCB's) voor de registratie-elektrode Connection

OPMERKING: Om een ​​praktische experimentele procedure te bieden, worden draadelektroden gesoldeerd aan een PCB op deze elektroden invoegen in een FFC (flexibele platte kabel) connector.

1. Snijd een 0.5x5 cm ² stuk koper bekleed laminaat.
2. Met behulp van een fijne punt marker, teken drie 0.1x5cm ² rechthoek pads als etsen masker patronen.
3. Ets het blootgestelde laminaat met behulp van een PCB etsmiddel in een geventileerde ruimte of zuurkast. Beslaan ongeveer 1 cm van de lengte van het laminaat uitsparing met niet-reactief tape. Vul een maatbeker met minstens 100 ml PCB etsmiddel en tape de koper laminaat uitsparing aan de binnenkant van de maatbeker met plakband. De helft van de koperlaminaat cutout moet worden ondergedompeld in de PCB etsmiddel.
4. Plaats het bekerglas op een roterend platform gedurende 20 minuten.
5. Verwijder de uitsparing van het etsmiddel en plaats deze in een bekerglas gevuld met water gedurende 10 minuten.
6. Met een tissue toepassing isopropylalcohol en verwijder de markeringen aan de niet-geëtste koperen pads bloot.
7. Snijd de printplaat in kleinere vierkantjes van ongeveer 1 cm lang.
8. Knip twee stukken van gecoate, gegloeid, roestvrij staaldraad (0.11 "coated, 0.008" kale) met een scherp mes om lengtes van 3 cm per stuk. Deze stukken van roestvrij staaldraad zijn de actieve elektroden in de thorax van het insect ingevoegd.
9. Met behulp van een mes, verwijder 4-5 mm van de plastic coating van elk uiteinde van elke draad. Gebruik van een microscoop wordt aanbevolen.
10. Snijd een 0,7 cm stuk geïsoleerde roestvrij staaldraad een tip extensie voor de massa-elektrode te creëren. Verwijder voorzichtig de coating met een mes of smelten met de hitte van een soldeerbout irop zoals uitgevoerd in stap 1.9.
11. Voor de massa-aansluiting, snijd een stuk van flexibele (litze of spoel) draad op een lengte van 4,5 cm.
12. Soldeer 0,7 cm stuk roestvrij staal vervaardigd in stap 1.10 aardverbinding draad bereid in stap 1.11. De blootgestelde roestvrij stalen punt moet aan het einde van de aardaansluiting.
13. Tape de geprepareerde elektrode bord stevig aan het solderen werkruimte met behulp van een niet-reactief tape. Gebruik de tape om alles maar 1-2 mm van de pads maskeren op het bord waar de elektroden worden gesoldeerd. Deze gemaskerde, soldeer-vrije uiteinde van de pads zullen worden ingebracht in de FFC connector in stap 4.1 beschreven.
14. Lijn de drie elektrodedraden zodanig dat een uiteinde van elk kan worden gesoldeerd aan de desbetreffende elektroden op de elektrode bord. Solliciteer roestvrij staal flux over de elektroden voor een eenvoudiger solderen.
15. Soldeer elk van de blootgestelde elektroden op de pads.
16. Dompel de elektroden in aceton en isopropylalcohol gedurende 10 minelk aan het soldeer resten te reinigen. Het gebruik van een ultrasoonbad verbetert de reinigingsprestatie.

2. Chirurgische Insertion de Manduca Sexta Poppen

OPMERKING: De insecten meest actief tijdens de overgangen tussen dag en nacht. Daarom moet een kunstmatige dag / nacht-cyclus binnen een insect kamer worden vastgesteld met behulp van automatische uitlaat timers. Deze moet worden ingesteld op een 7 uur donker en 17 uur licht cyclus te simuleren.

1. Onderzoek de Manduca sexta poppen per dag om een geschikte invoegtijd bepalen. De poppen zijn klaar voor het inbrengen ongeveer een dag na de vleugels vertonen donkere vlekken.
2. Om de poppen verdoven, leg ze in de koelkast (4C) voor ongeveer 6 uur.
3. Bereid de invoeging werkruimte. De werkruimte moet ook isopropylalcohol, scherpe pincet, messen, en een 30 G injectienaald. Optioneel kan cyanoacrylaat kleefmiddel gebruikt worden om de elektrode fixatie te verbeteren.
4. Steriliseer de naald, pincet, en de elektroden door dompelen ze in of af te vegen met isopropylalcohol.
5. Verwijder de pop uit de koelkast en breng het naar de werkruimte.
6. Bepaal de locatie op de thorax die overeenkomt met de spiergroep plaats. De focus van het werk in dit voorbeeld is de dorsoventral spieren die verantwoordelijk zijn voor de vleugel opgaande beweging.
7. Met behulp van een scherp mes voorzichtig krabben een 1x1 cm ² rechthoek door de exocutical laag. Met behulp van de pincet, langzaam loslaten van deze stukken.
8. (Optioneel) Gebruik een stofzuiger om vleugel haar van de blootgestelde gebied van de thorax te verwijderen.
9. Duw de naald langzaam ongeveer 5 mm in de mesothorax waar de vleugels hechten aan de thorax twee invoegpunten gericht op de spiergroep te creëren.
10. Met een pincet, begeleiden de twee registrerende elektroden in de twee invoegpunten.
11. (Optioneel) Als u de mechanische duurzaamheid te verbeteren, het reinigen van de haren rond de elektrodenen royaal van toepassing cyaanacrylaatlijm rond elk invoegpunt op de thorax met een draad applicator.
12. Bereid een kooi voor het optreden met de juiste materiaal (ruw en getextureerde) die de muren en het plafond, zodat het insect kan klimmen in opkomst. Geperforeerde kartonnen dozen of pakpapier mag worden gebruikt.
13. Bereid een rigide fixatie stick met ongeveer 6 cm lang en 2 mm diameter. Plastic roerders, een wattenstaafje of metalen draden kunnen worden gebruikt voor deze stap.
14. Schuif deze stick voorzichtig door het gat onder de vooruitstekende snuit.
15. Bevestig beide zijden van de stok op de kooi oppervlak zodat de pop niet kan rollen rond. Plaats de pop binnenkant van de kooi zodanig zijn dat de mesothorax naar boven is gericht. Uitgebreide beweging kan schade aan de elektrode, verlies van hemolymfe veroorzaken, of maken het inbrengen nutteloos.

3. Plaatsen van de massa-elektrode in Manduca Sexta

OPMERKING: De grond (zielingen) elektrode dient in de buik of de distale delen van de thorax signaalkoppeling voorkomen. Deze toevoeging kan zowel tijdens de latere stadia van de ontwikkeling popstadium of na het insect ontstaat. Het venster van de aardelektrode moet worden bereid in de popstadium voor zowel een pupal of volwassen stadium aardelektrode inbrengen.

1. Voor popstadium inbrengen: na het schillen van de mesothoracic nagelriem rond de actieve elektrode (zie stap 2.7), krabben andere rechthoek door de exocutical laag ⁽² rond 0.5x0.5 cm) op de rug buik dicht bij de thorax met behulp van de 30 G injectienaald naald. Plaats de massa-elektrode in dit venster met behulp van de in punt 2 beschreven techniek.
2. Voor volwassen stadium aardelektrode inbrengen: zodra het insect is gekomen, plaats het in de koelkast bij 4 ° C gedurende 6 tot 24 uur te immobiliseren.
   De overige stappen zijn hetzelfde voor zowel pupal en volwassen stadium inserties.
3. Bereid de insertie tie werkruimte waaronder isopropylalcohol, scherpe pincet, een 30 G injectienaald, cyaanacrylaatlijm, een stuk draad voor het aanbrengen van lijm, een thermische cauterizer (optioneel) en een tandheelkundige stok was (optioneel).
4. Zoek een invoegpositie ongeveer 1-2 cm van de registrerende elektroden langs de achterste buik.
5. Duw de naald langzaam naar de buik te prikken en zorgen voor een insertie plaats.
6. Met een pincet voorzichtig in de grond elektrode in de plaats van inbrengen en oefen druk uit totdat het is 3-4 mm diep. Houd de elektrode op zijn plaats en het gebruik van een draad om lijm aan te brengen rond de plaats van inbrengen.
7. (Optioneel) Als u de mechanische sterkte te verbeteren, gebruik maken van de thermische cauterizer en het verzamelen van een kleine (2-3 mm) kraal van was aan het uiteinde. Plaats de tip dicht bij de plaats van inbrengen en toe te passen warmte, zodat de was rondom de elektrode en houdt het stevig op zijn plaats.

4. Voorbereiding van de Adapter Board

NHOUD ">. OPMERKING: Een adapter board is nodig om de elektrode bord verbinding met het draadloze opname headstage via een FFC (Vlakke Flexibele Kabel) connector Voor deze, een raad vergelijkbaar met de elektrode bord moet worden voorbereid door het volgen van de stappen 1,1-1,7 .

1. Soldeer een FFC connector aan het ene uiteinde van de bereide bord.
2. Solderen drie 30 AWG (American Wire Gauge) aansluiten draden drie pads aan de andere kant.
3. Soldeer drie mini aan op de drie elektroden op de adapterkaart voor oscilloscoop metingen zoals beschreven in de volgende fase.
4. Soldeer het andere uiteinde van deze drie draden naar de headstage connector.
5. Zet de headstage printplaat bovenop het levitatie frame.

5. Vooropname met oscilloscoop (optioneel)

OPMERKING: Om de betrouwbaarheid van de elektroden te beoordelen en observeer de signaal-ruisverhouding, tethered oscilloscoop opnames kan worden verkregen voor de implementatie van de wireless opnamesysteem. De mini connectoren op de adapter boord moeten worden gebruikt.

1. Sluit de oscilloscoop aan een extracellulaire neurale opname versterker. Stel de versterker parameters om een ​​high-pass cut-off frequentie van 1 Hz, een low-pass-cut-off frequentie van 20 kHz en een winst van 100.
2. Sluit elk van de vrouwelijke mini kabel aansluitingen op de adapter bord om de versterker input kanalen.
3. Verwijder het insect met de geïmplanteerde elektrode bord uit de kooi wanneer het zich in een actieve toestand (tijdens de dageraad tijd). Leg een stukje weefsel papier onder het insect voor het te rusten voordat metingen verricht.
4. Met een pincet, schuif de elektrode bord in de FFC receptor op de adapter boord. Observeren een vlakke en laagspanning uitgangswaarde wanneer het insect rust en het genereren van elektromyogram (EMG) spikes als het insect met zijn vleugels slaat.
   OPMERKING: Raadpleeg Deel 6: Observeren insect vlucht met de Wireless Recording System voor representative oscilloscoop resultaten.
5. Pas de bekijkparameters van de oscilloscoop als nodig. Vastleggen van de gegevens op de oscilloscoop en sla de gegevens.

6. Observeren Insect Vlucht met de Wireless Recording System

OPMERKING: Een elektromagnetische levitatie platform kan worden gebouwd voor draadloze registratie van EMG signalen tijdens tethered Manduca sexta vlucht. De levitatie platform bestaat uit een frame dat een verankerings mechanisme evenwicht. De levitatie kan het frame, en derhalve de insecten te slingeren tijdens het testen zonder beperking van tethering draden. Het frame kan snel-prototype met behulp van een gefuseerde Deposition Modeling (FDM) machine. Een magneet moet worden aan de onderkant van dit frame te zweven door een reeks van magneten in het basisplatform. Het insect is aangesloten op de connector FFC opgehangen aan de bovenkant van het frame. Deze zwevende platform bevindt zich in de LED Arena, die werd gebouwd using 60 panelen bestaande uit een matrix van 5x7 individuele LEDs. Dit systeem is gebaseerd op aanvaarde methoden voor het ontwikkelen van een omgeving voor visuele stimulatie van fruitvliegen ^{15, 16, 17.} De arena wordt gestuurd door een microcontroller mogelijk simulatie van zowel rechtsom als linksom draaien en regeling van het toerental.

1. Stel het draadloze registratiesysteem door het aansluiten van de headstage op de adapter connector op de levitatie platform.
2. Verwijder het insect van de kooi wanneer deze in een actieve toestand voorkeur tijdens de dageraad tijd.
3. Met een pincet, Plaats de elektrode zorgvuldig bestuur in de FFC receptor op de zwevende frame zoals dat het insect stevig wordt geschorst binnen de setup.
4. Plaats de magnetische staaf in de buurt van de magnetische schakelaar op de headstage om draadloze gegevensoverdracht te activeren. Een blauw lampje branden wat aangeeft dat de headstage actief is.
5. Uitschakelen van de verlichting in deruimte voor volledige duisternis. Een rode lamp kan worden gebruikt om licht toe te voegen aan de kamer. Open de telemetrie dataverzameling software op een computer en selecteer het juiste voorgeladen configuratiebestand indien voorzien. Start de data-acquisitie te bekijken signalen beginnen.
6. Selecteer de gewenste gebruikersinterface voor observatie van EMG signalen op het draadloze opnamesysteem een ​​betrouwbare draadloze verbinding elektrode werking.
7. Schakel alle LED Arena componenten: Gereglementeerde DC voeding en microcontroller. De microcontroller kan de rotaties per minuut van de cyclische lichtpatroon passen en kan ook de controle van de richting van het licht rotatie.
8. Langzaam de balans van de levitatie platform binnen de arena. Lijn het frame boven het midden van de levitatie base voorzichtig, anders lijst snel worden getrokken om de grond eventueel verwonden het insect.
9. Start de video-opname systeem.
10. Selecteer het desbetreffende tabblad opname van de softwareinterface. Wijzen de opnametijd en Bestand opslaan bestemming. Kies de juiste uitgang van de instellingen om de gegevens op te slaan. Klik op de startknop om een ​​opnamesessie in de software te starten. Hierdoor wordt de data-bestand dat in numerieke computing-omgevingen kunnen worden geïmporteerd redden.
11. Neem de insecten vliegen in de richting die overeenkomt met de beweging van de LED. Keren de richting van de LED's en bevestigen dat het insect richting omkeert. Voer deze zo vaak als gewenst.

Results

Een schema van de totale EMIT procedure is weergegeven in figuur 1, waarin de belangrijkste fasen van de hawkmoth de metamorfe cyclus en de bijbehorende elektrode inbrengen stappen. De elektrode inbrengen moeten worden uitgevoerd in de late popstadium 4 tot 7 dagen vóór Eclosion. Hierdoor kan de spiervezels ontwikkelen rond de elektroden en zet het implantaat in het insect.

Het typisch resultaat van een over tijd popstadium insertie waarin de twee actieve elektroden en de ma...

Discussion

Er zijn verschillende kritische stappen tijdens de chirurgische inbrengen van de registrerende elektroden die het vermogen om data in de latere stappen van het protocol beïnvloeden. De registrerende elektroden moeten worden ingevoegd in de pop een dag na het tentoonstellen vleugel vlekken op zijn rugzijde. Als het inbrengen uitgevoerd twee of meer dagen na deze tijd, zal het weefsel van het insect niet genoeg tijd om te ontwikkelen en te stabiliseren rond de elektroden geplaatst. Dit kan leiden tot beweging van de geïmp...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gecoate roestvrijstalen draad	A-M Systems	791900	0,008’’ ongeblakerde, 0,011’’ gecoate, gegloeid
Flexibele elektrodendraad			Litz- of inductordraad kan worden gebruikt.
FFC-connector voor oppervlaktemontage	Hirose Connector	FH28E-20S-0.5SH(05)
Pincet	Grobet USA		Reinigen met 70% alcohol voor gebruik op het insect.
Kim-Wipes	Kimberly-Clark Worldwide	34155	Elke maat delicaat-vegende tissues kan worden gebruikt.
Teflon-tape			5 mm breedte Teflon-tape.
Hypodermische naald	Becton Dickinson & Co.	30511	20-30 G hypodermische naald kan worden gebruikt. Video toonde 30 G.
Rigide fixatiestok			Verschillende materialen kunnen worden gebruikt (bijv., koffiemixers)
Insecten-emergencieveng			Kunststof huisdierenkooi bekleed met inpakpapier of vergelijkbare padding. Ventilatiegaten zijn nodig.
Thermische cauterisatie	Advanced Meditech International	CH-HI CT2103 (tip)	Optioneel materiaal dat wordt gebruikt voor het aanbrengen van tandpasta.
Tandpasta	Orthomechanics LC., Broken Arrow, Oklahoma		Optioneel materiaal dat wordt gebruikt voor het stabiliseren van de elektroden op het insect.
Magneetlevitatioplatform			Op maat ontworpen frame gefabriceerd in-house met 3D-prototypering.