Laser-scanning fotostimulatie van optogenetisch gerichte voorhersenencircuits

Samenvatting

We beschrijven een methode voor het karakteriseren van de functionele topografie en synaptische eigenschappen van voorhersenencircuits met behulp van een optogenetische aanpak om neuronale populaties in vitro te fotostimuleren.

Samenvatting

De sensorische voorhersenen zijn samengesteld uit ingewikkeld verbonden celtypen, waarvan de functionele eigenschappen nog niet volledig zijn opgehelderd. Het begrijpen van de interacties van deze voorhersenencirkels is recent bevorderd door de ontwikkeling van optogenetische methoden voor licht-gemedieerde modulatie van neuronale activiteit. Hier beschrijven we een protocol voor het onderzoeken van de functionele organisatie van voorhersenencirkels in vitro door middel van laser-scanning foto-stimulatie van channelrhodopsine, optogenetisch tot expressie gebracht via viraan-gemedieerde transfectie. Deze aanpak benut ook het nut van cre-lox recombinatie in transgene muizen om expressie in specifieke neuronale celtypen te targeten. Na transfectie worden neuronen fysiologisch opgenomen in plakpreparaten met behulp van gehele-cel patch clamp om hun geëvokeerd responsen op laser-scanning foto-stimulatie van channelrhodopsine expresserende vezels te meten. Deze aanpak maakt een evaluatie van functionele topografie en synaptische eigenschappen mogelijk. Morfologische correlaties kunnen worden verkregen door beeldvorming van de neuroanatomische expressie van channelrhodopsine expresserende vezels met behulp van confocale microscopie van de levende plak of post-gefixeerd weefsel. Deze methoden maken functionele onderzoeken van voorhersenencirkels mogelijk die uitbreiden op meer conventionele benaderingen.

Inleiding

De uitgebreide circuitstructuur van de voorhersenen van zoogdieren levert een experimentele uitdaging op voor het ontcijferen van de functionele rollen van de onderling verbonden componenten. Het ontwarren van deze relaties is onlangs vergemakkelijkt door de ontwikkeling van optogenetische methoden om specifiek neuronale populaties en hun projecties te stimuleren en te remmen^1-3. Deze benaderingen maken gebruik van de genetisch gecontroleerde expressie van membraankanalen die reageren op licht^4-6. Van bijzonder belang is channelrhodopsine, een lichtgevoelige ionenkanaal, dat neuronale membranen depolariseert na optische stimulatie, wat leidt tot excitatie van de expresserende neuron en zijn projecties^4,7. Omgekeerd hyperpolariseert halorhodopine, een lichtgevoerde chloorpump, het membraan, waardoor de gerichte projectie wordt geremd^6,8,9. Er zijn verschillende varianten van deze opsines ontworpen, er zijn meerdere vectoren geproduceerd voor transfectie en expressie in neuronale populaties van belang, en er zijn transgene muislijnen ontwikkeld die deze opsines constitutief expresseren of die cre-lox-gemedieerde controle van hun expressie mogelijk maken^1,2,10,11.

De bruikbaarheid van deze optogenetische methoden en materialen heeft een revolutie teweeggebracht in de moderne experimentele neurowetenschap, waardoor de rol van specifieke neurale circuits in de fysiologie en het gedrag van het organisme kan worden ontrafeld^12-15. In het bijzonder kunnen deze methoden krachtig worden toegepast op de functionele dissectie van hersencircuits met behulp van in vitro plakpreparaten^16-20. In deze context is een van de belangrijkste voordelen van deze methode de mogelijkheid om de fysiologie van langeafstandsprojecties te karakteriseren die moeilijk, zo niet onmogelijk, te behouden zijn in een dikke plak, zoals de commissurale verbindingen tussen de hersenhemisferen¹⁶. Bovendien maakt deze technologie manipulaties mogelijk die met andere methoden niet mogelijk zijn, zoals de selectieve remming van projecties met fijne temporele precisie met behulp van halorhodopsine^6,8,9. Bovendien maakt de celtypespecifieke expressie van deze opsines het mogelijk om geïsoleerde componenten in een neurale circuit selectief te stimuleren of te remmen^1,2,11,15,21. Als zodanig maken deze nieuwe optogenetische tools de ongekende analyse van de neuronale bijdragen aan de fysiologie en het gedrag mogelijk.

Hier beschrijven we een protocol voor het tot expressie brengen van channelrhodopsine in de muizenhersenen met behulp van adeno-geassocieerde virale (AAV) vectoren^1,2. Specifieke transfectie van gerichte neuronale populaties kan worden bereikt met behulp van dit protocol, met de juiste keuze van promotorconstructen of transgene muizen die Cre-recombinase tot expressie brengen in de gerichte neuronen van belang en een 'floxed' virale construct^1,11,15,21 (Figuur 1). Als voorbeelden onderzoeken we hier de corticocorticale projecties tussen de primaire visuele cortex (V1) en de secundaire visuele cortex (V2) en we onderzoeken ook de laag 6 corticothalamische projectie van de primaire somatosensorische cortex (S1) naar de ventroposterior mediale kern (VPm). We combineren deze specifieke expressie met laser-scanning fotostimulatie in vitro  om de synaptische fysiologie en functionele topografie te beoordelen. De hier gepresenteerde setup maakt de nauwkeurige ruimtelijke positionering en controle van de loci van fotostimulatie mogelijk. Ten slotte beschrijven we de visualisatie van expressiepatronen met behulp van confocale microscopie.

Protocol

1. Surgery en injecties

1. Anesthesier muizen met een intraperitoneaal injectie (22-25 G naald aanbevolen) van ketamine (100-120 mg/kg) en xylazine (7,5-16 mg/kg).
   1. Beoordeel sedatie met krachtige vingersnufjes totdat geen reacties worden opgewekt. Voor alle beschreven dierprocedures, wijzig indien nodig om lokale IACUC-richtlijnen te volgen.
2. Plaats gesedeerd muizen in een stereotactisch apparaat door het hoofd en de oren in hun respectievelijke houders te bevestigen.
   1. Smeer de ogen voor het plaatsen van het dier in het stereotactisch apparaat met een steriele oftalmische zalf.
3. Scheer de hoofdhuid met een scheermes en steriliseer het gebied met Betadine-watten.
4. Snij met een scalpel een midline-incisie en vouw de huid en onderliggende spieren boven het te injecteren gebied omhoog.
5. Gebruik een scalpelblad als trefiene om een craniotomie uit te voeren boven het te blootleggen gebied. Gebruik alternatief een kleine boorbijtel die is bevestigd aan een Dremel om de craniotomie uit te voeren.
   1. Om de craniotomie uit te voeren, plaats het scalpelblad of de boorbijtel op het oppervlak van de schedel en draai langzaam totdat er voldoende bot is uitgegraven om de pia mater eronder te onthullen.
   2. Zodra de eerste uitgraving is gemaakt, vergroot de craniotomie met behulp van fijne pincetten om voorzichtig bot van de randen te verwijderen.
6. Vul een 1 µl spuit met de te injecteren virale oplossing (UNC Vector Core).
   1. Om de transfectie-efficiëntie te verbeteren, bereid de virale oplossing voor met 4 µg/ml polybreen.
7. Laat de naald zakken in het te injecteren gebied en drukinfuseer 200 nl oplossing met virus met een spuitpomp.
   1. Laat de spuit 10 min staan voordat u de naald terugtrekt.
8. Naai de huid met niet-opneembaar monofilament Nylon en bedek de incisie met antibioticumzalf.
   1. Hechtingen moeten na 7-10 dagen worden verwijderd.
9. Injecteer buprenorfine (0,05-0,1 mg/kg) voor postoperatieve pijnbestrijding.
10. Laat dieren postoperatief herstellen gedurende 14-21 dagen om adequate expressie van kanaal rhodopsine mogelijk te maken.

2. Snijvoorbereiding

1. Na de herstelperiode, anesthesier het dier diep met isoflurane anesthesie, zoals geverifieerd door afwezigheid van onttrekkingsreflex wanneer de achterpoot en/of tenen stevig worden geknepen.
2. Dissecteer de hersenen door onthoofding gevolgd door midline en frontale sneden in de schedel.
3. Trek de schedel vanaf de midline omhoog om de hersenen bloot te leggen.
4. Verwijder voorzichtig de hersenen met behulp van een fijne lepelspatel om de hersenzenuwen te scheiden van de basis van de hersenen.
5. Plaats het gedissecteerde brein snel in een kleine 100 ml beker met gekoelde, ijskoud kunstmatig hersenvocht (ACSF; in mM: 125 NaCl, 3 KCl, 1,25 NaH₂PO₄, 1 MgCl₂, 2 CaCl₂, 25 NaHCO₃, 25 glucose).
6. Verwijder het brein van ACSF en plaats het op een microscoopglaasje bedekt met filterpapier voorgeweekt met ACSF.
7. Maak een blokkerende snede van het brein in de gewenste oriëntatie met behulp van een schone scheermes.
8. Bevestig het geblokkeerde oppervlak van het brein op het snijoppervlak met behulp van instant kleeflijm.
9. Breng het snijoppervlak over naar een vibratome snijkamer (bewaard in de vriezer totdat klaar voor snijden).
10. Pour ijskoud ACSF in de snijkamer.
11. Snijd hersensneden van 400-500 µm met behulp van een vibrerende weefselsnijder.
12. Breng hersensneden over naar een houderkamer met geoxygeneerd ACSF en incubeer gedurende minimaal 1 uur bij 30 °C voor het experiment.

3. Fysiologische opname

1. Na de incubatieperiode, breng een snede over naar een opnamekamer op een gemodificeerde microscooptafel.
2. Beveilig de snede in het bad tijdens het experiment met behulp van enkele draden Nylon-filamenten die zijn bevestigd aan een platinadraad snedehouder.
3. Perfuseer de snede constant met ACSF.
4. Trek opnamepipetten naar een tipweerstand van 3-6 MΩ wanneer gevuld met intracellulaire oplossing met de volgende samenstelling (in mM): 127 K-gluconaat, 3 KCl, 1 MgCl₂, 0,07 CaCl₂, 10 HEPES, 2 Na₂-ATP, 0,3 Na-GTP, 0,1 EGTA. De intracellulaire oplossing moet een pH van 7,3 hebben, aangepast met KOH of gluconzuur en de osmolalitéit van 280-290 mOsm.
5. Gebruik een standaard gevisualiseerde geheelcel-opnameopstelling en plaats de opnamepijpen dicht bij het te opnemen neuron terwijl u positieve druk toepast^22,23.
6. Laat de positieve druk los terwijl u zuiging toepast om een Gigaohm-seal te vormen.
7. Breng een korte zuiging toe om het membraan te breken en een geheelcel-configuratie-opname te vormen.
8. Neem de reacties van neuronen op in voltage of stroomklem.

4. Laser-scanning Foto-stimulatie

1. Start

Resultaten

Laser-scanning fotostimulatie van projecties tussen het primaire visuele gebied (V1) en het secundaire visuele gebied (V2) bij de muis werd bereikt na injecties van pAAV-CaMKIIa-hChR2(H134R)-EYFP in V1 van een Balb/C muis (Figuur 3). De CaMKIIa promotor in deze virale construct drijft specifieke expressie van channelrhodopsine-EYFP aan in excitatoire glutamaterge neuronen^1,15. Na voorbereiding van de plakjes voor fysiologische opname, werd expressie van channelrhodopsine-EYFP vezels, d.w.z. epifluorescentie van het geconjugeerde EYFP, waargenomen die zich uitstrekten van V1 naar V2 (Figuur 3A). Bovendien werden de corticothalamische vezels in de laterale geniculate kern (LGN) ook waargenomen (Figuur 3A). Whole-cell patch clamp opnames van een neuron in V2 onthulden EPSC's die werden geïnduceerd na laser-scanning fotostimulatie van channelrhodopsine-EYFP expresserende vezels in de lagere lagen van V2 (Figuur 3B).

In een ander voorbeeld werd laser-scanning fotostimulatie van de corticothalamische projecties van laag 6 van de primaire somatosensorische cortex (S1) naar de ventroposterior nucleus (VP) bereikt door gebruik van dit protocol. Hier gebruikten we een Cre-Lox aanpak om de expressie van channelrhodopsine specifiek te richten in de laag 6 neuronen en corticothalamische projecties van belang. Uiteindelijk injecteerden we pAAV-Ef1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pA in S1 van B6.Cg-Tg(Ntsr1-cre)GN220Gsat/Mmcd muizen (Figuur 1 en 4). Dit transgene muizenras drukt Cre-recombinase specifiek uit in laag 6 corticothalamische neuronen²¹, en resulteert daarom in ChR-YFP expressie alleen in die neuronen na transfectie door de 'floxed' AAV construct. Na voorbereiding van de plakjes, werden channelrhodopsine-EYFP vezels waargenomen in de laag 6 neuronen en vezels die zich projecteerden naar laag 4 en VP (Figuur 4A en 4B). Fysiologische opname van een VPm neuron met gebruik van whole-cell patch clamp onthulde dat EPSC's konden worden geïnduceerd na laser-scanning fotostimulatie in de buurt van het opgenomen neuron (Figuur 4C en 4D).

De morfologie van de gelabelde vezels werd gemakkelijker beoordeeld na fysiologische opnames. Hier hebben we (50 μm) snijpreparaten met channelrhodopsine-EYFP expressie in laag 6 corticothalamische neuronen opnieuw gesneden (Figuur 5). Dit onthulde een fijn patroon van gelabelde vezels dat zich uitstrekte van laag 6 naar laag 4, waar ze eindigden en zich uitgebreid arboriseerden (Figuur 5A). Bovendien werden corticothalamische vezels waargenomen die de witte substantie binnenkwamen en zich richtten naar de thalamus (Figuur 5A en 5B).

Figuur 1. Schematische illustratie van gerichte expressie van channelrhodopsine via een Cre-Lox aanpak. Transgene muizen die Cre-recombinase uitdrukken in de neuronale populaties van belang worden geïnjecteerd met een 'floxed' virus dat channelrhodopsine codeert die gefuseerd is met een fluorescerende eiwit, zoals YFP. Na transfectie zullen alleen neuronen met Cre-recombinase channelrhodopsine-EYFP gaan uitdrukken. Klik hier om de grotere afbeelding te bekijken.

Figuur 2. Schematische illustratie van de fotostimulatie setup. (A) Diagram van de laser-scanning fotostimulatie setup. De laserstraal wordt opeenvolgend door een open straalsysteem geleid naar een sluiter en een neutraal dichtheids (N.D.) filter. Een dekglas reflecteert een deel van de straal naar een fotodiode verbonden aan een versterker voor laservermogen metingen. Spiegelgalvanometer worden gebruikt om de laserstraal door een scanlens te positioneren, die de straal geleidt door een zijpoort aan de bovenkant van de microscoop. De straal wordt vervolgens naar beneden gereflecteerd door het objectief naar de plaksnede met behulp van een dichroische spiegel. Voor verdere details zie Lam en Sherman²³ en Shepherd²⁹. (B) Voorbeeld van het fotostimulatie rasterpatroon voor het representatieve experiment getoond in Figuur 3. Het 16 x 16 stimulatieraster is overlegd op een fotomicrograaf van de plaksnede. Een rode ster geeft de locatie van een neuron weer dat is opgenomen met behulp van whole-cell patch clamp. De laserstraalpositie wordt geleid naar elk van de 256 posities in het stimulatieraster door gecomputeriseerde positionering van de spiegelgalvanometer. De laserposities van de eerste 5 stimulatiesites zijn in de figuur afgebeeld. De reacties van het opgenomen neuron op fotostimulatie op elk van de sites zijn weergegeven in Figuur 3. Klik hier om de grotere afbeelding te bekijken.

Discussie

Het beschreven protocol beschrijft een aanpak voor de in vitro beoordeling van functionele topografie en fysiologie van neuronale circuits, die niet beperkt is tot het onderzoek van voorhersencircuits, d.w.z. die van de thalamus en cortex. Er zijn verschillende virale constructen voor optogenetische transfectie beschikbaar gesteld aan de wetenschappelijke gemeenschap en zijn gemakkelijk verkrijgbaar bij de UNC Vector Core. Voor een beschrijving van de beschikbare virale constructen, zie de UNC Vector Core³¹, de optogenetische bronnenpagina op het Deisseroth Lab aan de Stanford University³² en het Boyden synthetische neurobiologie-lab aan de MIT³³. Varianten van deze opsins zijn ontwikkeld door deze labs en maken een breed scala aan modi mogelijk voor het controleren van neuronale exciteerbaarheid^1,2. Het verkrijgen van deze vectoren van de UNC Vector Core vereist een materiaaloverdrachtovereenkomst van de oorspronkelijke labs. In dit protocol merken we op dat het toevoegen van polybrene de transfectie-efficiëntie verbetert. Bovendien is een andere variabele die de expressie beïnvloedt de post-chirurgische herstelperiode, waarbij we opmerken dat een periode van minimaal 14 dagen voldoende is om een robuuste expressie in de voorhersenbanen van muizen te verkrijgen.

Voor de gerichte transfectie van specifieke neuronale groepen zijn verschillende Cre-transgene muislijnen ontwikkeld, die kunnen worden gebruikt in combinatie met 'floxed' omgekeerde open leesraam virale constructen die zijn ontwikkeld¹¹. Verschillende stamsoorten die relevant zijn voor neurowetenschappelijk onderzoek zijn verkrijgbaar via de Mutant Mouse Regional Resource Centers³⁴. Atlassen van Cre-recombinase-expressiepatronen in deze transgene lijnen worden aangeboden via de GENSAT-database³⁵. Daarnaast biedt Jackson Labs verschillende Cre-transgene stammen, evenals andere die opsins constitutief tot expressie brengen in specifieke neuronale groepen. Een cruciale stap bij het gebruik van deze muislijnen is het meenemen van de tijd die nodig is voor het verkrijgen en vestigen van een fokkolonie, wat kan variëren op basis van de specifieke stam van belang.

Voor fotostimulatie hebben we het opgezette apparaat gebruikt en aangepast dat is ontwikkeld door het Shepherd Lab aan de Northwestern University, beschreven in een recent protocol²⁹. Hoewel geoptimaliseerd voor het ontketenen van glutamaat, is dit apparaat ook geschikt voor fotostimulatie van channelrhodopsine zonder aanpassing. Dit apparaat maakt nauwkeurige ruimtelijke controle en positionering van de loci van fotostimulatie mogelijk, wat een beoordeling van de functionele topografie van channelrhodopsine innervatie van opgenomen neuronen mogelijk maakt. Hoewel ruimtelijke controle wordt verbeterd met deze methode van fotostimulatie, is het kostenintensiever dan methoden die gebruik maken van LED-gebaseerde veldverlichting²⁰. Bovendien is de nonuniformiteit van hersenweefsel een beperking van optogenetiek, of enige technieken die manipulatie van licht omvatten. In de praktijk is het echter zelden een factor omdat resultaten meestal kwalitatief worden geïnterpreteerd. In het geval dat een meer kwantitatief vergelijk tussen hersengebieden nodig is, kan men altijd de maximale lichtintensiteit gebruiken om 'verzadigde' reacties te bereiken.

Bovendien hebben we zowel Tidelwave als Ephus softwareprogramma's geschreven in Matlab gebruikt voor het besturen van laser-scanning fotostimulatie en data-acquisitie^25,26. Het wordt echter aanbevolen dat degenen die een soortgelijk systeem opzetten, de nieuwere Ephus-software²⁶ gebruiken, die beschikbaar is via de Janelia Farms ontwikkelsite³⁰. Een sleutelstap is het kiezen van welke van deze softwarepakketten te gebruiken, omdat hun hardwarevereisten enigszins verschillen. Bovendien zijn de kaartanalyseprogramma's afgestemd op hun respectieve data-acquisitieprogramma's.

Verschillende van deze stappen kunnen worden aangepast om aan de specifieke setup van de beoefenaar te voldoen. Injecties van virale oplossingen kunnen worden uitgevoerd met leveringsmechanismen naast een spuit, bijv. capillaire glazen pipetten getrokken naar tipdiameters van ~40 μm werken ook goed. Voor operaties kan een niet-stereotaxische hoofdhouder worden vervangen als dergelijke coördinaten niet vereist zijn voor het begeleiden van injecties. Bovendien kunnen de samenstellingen van ACSF en intracellulaire oplossing worden gewijzigd, afhankelijk van de specifieke experimentele vereisten, bijv. het vervangen van een cesium of hoge chloride intracellulaire oplossing om remmende stromen te isoleren. Ook kan een alternatief voor het beeldvormen van expressiepatronen in vaste plakken ook worden gedaan in de levende plak op een geschikte beeldvormingsstelling met een badperfusiesysteem.

Kortom, dit protocol stelt de beoefenaar in staat om de functionele topografie en synaptische fysiologie van projecties in vitro te karakteriseren, wat mogelijk niet mogelijk is met standaardmethoden, bijv. karakterisering van langeafstandsprojecties die niet in een plak kunnen worden bewaard. Het beschreven transfectieprotocol kan worden toegepast op in vivo optogenetische experimenten^1-3,12,14, aangezien het afleveringsmechanisme hetzelfde is. Ten slotte, hoewel dit protocol transfectie van muizen beschrijft, kunnen veel van de beschikbare virale vectoren theoretisch worden gebruikt om deze opsins in een breed scala aan zoogdiersoorten te transfecteren en tot expressie te brengen, waardoor een groot aantal vergelijkende en soortspecifieke studies mogelijk zijn^1-3.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Polybrene	Santa Cruz Biotech	SC134220
Paraformaldehyde 32% oplossing	EMS	15714
VECTASHIELD	Vector Labs	H-1400
AAV virale constructies	UNC Vector Core	NA
Muis stereotactische hoofdhouder	Stoelting	51730
Nanocool-injector	Harvard Apparatus	703040
UV-laser: 355 nm, Nd:YVO4; 1 W;	DPSS Lasers, Inc	3500
Galvanometer	Cambridge Scanning	6210
spiegels	Cambridge Scanning	6m2003S-A
montage	Cambridge Scanning	6102103L
kabel	Cambridge Scanning	6010-19-120
driver/controller	Cambridge Scanning	67121-1
Shutter - ZM gecoat (UV-compatibel)	Uniblitz	L23-ZM2
Shutter Controller	Uniblitz	VMM-D1
Stroomversterker	Stanford Research Systems	SR570
6713 board	National Instruments	777741-01
2110 break-out box	National Instruments	777643-01
PCI-MIO-16E-4	National Instruments	777383-01
BNC-2090	National Instruments	777270-01
Kabels	National Instruments	184749-01
MATLAB	Mathworks
TCS SP2	Leica Microsystems