Methodenartikel

Laser-scanning fotostimulatie van optogenetisch gerichte voorhersenencircuits

9.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50915

⸱

27 december 2013

 ,  ,  , 
1Department of Comparative Biomedical Sciences, School of Veterinary Medicine, Louisiana State University, 2Department of Neurobiology, University of Chicago

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een methode voor het karakteriseren van de functionele topografie en synaptische eigenschappen van voorhersenencircuits met behulp van een optogenetische aanpak om neuronale populaties in vitro te fotostimuleren.

Samenvatting

De sensorische voorhersenen zijn samengesteld uit ingewikkeld verbonden celtypen, waarvan de functionele eigenschappen nog niet volledig zijn opgehelderd. Het begrijpen van de interacties van deze voorhersenencirkels is recent bevorderd door de ontwikkeling van optogenetische methoden voor licht-gemedieerde modulatie van neuronale activiteit. Hier beschrijven we een protocol voor het onderzoeken van de functionele organisatie van voorhersenencirkels in vitro door middel van laser-scanning foto-stimulatie van channelrhodopsine, optogenetisch tot expressie gebracht via viraan-gemedieerde transfectie. Deze aanpak benut ook het nut van cre-lox recombinatie in transgene muizen om expressie in specifieke neuronale celtypen te targeten. Na transfectie worden neuronen fysiologisch opgenomen in plakpreparaten met behulp van gehele-cel patch clamp om hun geëvokeerd responsen op laser-scanning foto-stimulatie van channelrhodopsine expresserende vezels te meten. Deze aanpak maakt een evaluatie van functionele topografie en synaptische eigenschappen mogelijk. Morfologische correlaties kunnen worden verkregen door beeldvorming van de neuroanatomische expressie van channelrhodopsine expresserende vezels met behulp van confocale microscopie van de levende plak of post-gefixeerd weefsel. Deze methoden maken functionele onderzoeken van voorhersenencirkels mogelijk die uitbreiden op meer conventionele benaderingen.

Inleiding

De uitgebreide circuitstructuur van de voorhersenen van zoogdieren levert een experimentele uitdaging op voor het ontcijferen van de functionele rollen van de onderling verbonden componenten. Het ontwarren van deze relaties is onlangs vergemakkelijkt door de ontwikkeling van optogenetische methoden om specifiek neuronale populaties en hun projecties te stimuleren en te remmen1-3. Deze benaderingen maken gebruik van de genetisch gecontroleerde expressie van membraankanalen die reageren op licht4-6. Van bijzonder belang is channelrhodopsine, een lichtgevoelige ionenkanaal, dat neuronale membranen depolariseert na optische stimulatie, wat leidt tot excitatie van de expresserende neuron en zijn projecties4,7. Omgekeerd hyperpolariseert halorhodopine, een lichtgevoerde chloorpump, het membraan, waardoor de gerichte projectie wordt geremd6,8,9. Er zijn verschillende varianten van deze opsines ontworpen, er zijn meerdere vectoren geproduceerd voor transfectie en expressie in neuronale populaties van belang, en er zijn transgene muislijnen ontwikkeld die deze opsines constitutief expresseren of die cre-lox-gemedieerde controle van hun expressie mogelijk maken1,2,10,11.

De bruikbaarheid van deze optogenetische methoden en materialen heeft een revolutie teweeggebracht in de moderne experimentele neurowetenschap, waardoor de rol van specifieke neurale circuits in de fysiologie en het gedrag van het organisme kan worden ontrafeld12-15. In het bijzonder kunnen deze methoden krachtig worden toegepast op de functionele dissectie van hersencircuits met behulp van in vitro plakpreparaten16-20. In deze context is een van de belangrijkste voordelen van deze methode de mogelijkheid om de fysiologie van langeafstandsprojecties te karakteriseren die moeilijk, zo niet onmogelijk, te behouden zijn in een dikke plak, zoals de commissurale verbindingen tussen de hersenhemisferen16. Bovendien maakt deze technologie manipulaties mogelijk die met andere methoden niet mogelijk zijn, zoals de selectieve remming van projecties met fijne temporele precisie met behulp van halorhodopsine6,8,9. Bovendien maakt de celtypespecifieke expressie van deze opsines het mogelijk om geïsoleerde componenten in een neurale circuit selectief te stimuleren of te remmen1,2,11,15,21. Als zodanig maken deze nieuwe optogenetische tools de ongekende analyse van de neuronale bijdragen aan de fysiologie en het gedrag mogelijk.

Hier beschrijven we een protocol voor het tot expressie brengen van channelrhodopsine in de muizenhersenen met behulp van adeno-geassocieerde virale (AAV) vectoren1,2. Specifieke transfectie van gerichte neuronale populaties kan worden bereikt met behulp van dit protocol, met de juiste keuze van promotorconstructen of transgene muizen die Cre-recombinase tot expressie brengen in de gerichte neuronen van belang en een 'floxed' virale construct1,11,15,21 (Figuur 1). Als voorbeelden onderzoeken we hier de corticocorticale projecties tussen de primaire visuele cortex (V1) en de secundaire visuele cortex (V2) en we onderzoeken ook de laag 6 corticothalamische projectie van de primaire somatosensorische cortex (S1) naar de ventroposterior mediale kern (VPm). We combineren deze specifieke expressie met laser-scanning fotostimulatie in vitro  om de synaptische fysiologie en functionele topografie te beoordelen. De hier gepresenteerde setup maakt de nauwkeurige ruimtelijke positionering en controle van de loci van fotostimulatie mogelijk. Ten slotte beschrijven we de visualisatie van expressiepatronen met behulp van confocale microscopie.

Protocol

1. Surgery en injecties

  1. Anesthesier muizen met een intraperitoneaal injectie (22-25 G naald aanbevolen) van ketamine (100-120 mg/kg) en xylazine (7,5-16 mg/kg).
    1. Beoordeel sedatie met krachtige vingersnufjes totdat geen reacties worden opgewekt. Voor alle beschreven dierprocedures, wijzig indien nodig om lokale IACUC-richtlijnen te volgen.
  2. Plaats gesedeerd muizen in een stereotactisch apparaat door het hoofd en de oren in hun respectievelijke houders te bevestigen.
    1. Smeer de ogen voor het plaatsen van het dier in het stereotactisch apparaat met een steriele oftalmische zalf.
  3. Scheer de hoofdhuid met een scheermes en steriliseer het gebied met Betadine-watten.
  4. Snij met een scalpel een midline-incisie en vouw de huid en onderliggende spieren boven het te injecteren gebied omhoog.
  5. Gebruik een scalpelblad als trefiene om een craniotomie uit te voeren boven het te blootleggen gebied. Gebruik alternatief een kleine boorbijtel die is bevestigd aan een Dremel om de craniotomie uit te voeren.
    1. Om de craniotomie uit te voeren, plaats het scalpelblad of de boorbijtel op het oppervlak van de schedel en draai langzaam totdat er voldoende bot is uitgegraven om de pia mater eronder te onthullen.
    2. Zodra de eerste uitgraving is gemaakt, vergroot de craniotomie met behulp van fijne pincetten om voorzichtig bot van de randen te verwijderen.
  6. Vul een 1 µl spuit met de te injecteren virale oplossing (UNC Vector Core).
    1. Om de transfectie-efficiëntie te verbeteren, bereid de virale oplossing voor met 4 µg/ml polybreen.
  7. Laat de naald zakken in het te injecteren gebied en drukinfuseer 200 nl oplossing met virus met een spuitpomp.
    1. Laat de spuit 10 min staan voordat u de naald terugtrekt.
  8. Naai de huid met niet-opneembaar monofilament Nylon en bedek de incisie met antibioticumzalf.
    1. Hechtingen moeten na 7-10 dagen worden verwijderd.
  9. Injecteer buprenorfine (0,05-0,1 mg/kg) voor postoperatieve pijnbestrijding.
  10. Laat dieren postoperatief herstellen gedurende 14-21 dagen om adequate expressie van kanaal rhodopsine mogelijk te maken.

2. Snijvoorbereiding

  1. Na de herstelperiode, anesthesier het dier diep met isoflurane anesthesie, zoals geverifieerd door afwezigheid van onttrekkingsreflex wanneer de achterpoot en/of tenen stevig worden geknepen.
  2. Dissecteer de hersenen door onthoofding gevolgd door midline en frontale sneden in de schedel.
  3. Trek de schedel vanaf de midline omhoog om de hersenen bloot te leggen.
  4. Verwijder voorzichtig de hersenen met behulp van een fijne lepelspatel om de hersenzenuwen te scheiden van de basis van de hersenen.
  5. Plaats het gedissecteerde brein snel in een kleine 100 ml beker met gekoelde, ijskoud kunstmatig hersenvocht (ACSF; in mM: 125 NaCl, 3 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 25 NaHCO3, 25 glucose).
  6. Verwijder het brein van ACSF en plaats het op een microscoopglaasje bedekt met filterpapier voorgeweekt met ACSF.
  7. Maak een blokkerende snede van het brein in de gewenste oriëntatie met behulp van een schone scheermes.
  8. Bevestig het geblokkeerde oppervlak van het brein op het snijoppervlak met behulp van instant kleeflijm.
  9. Breng het snijoppervlak over naar een vibratome snijkamer (bewaard in de vriezer totdat klaar voor snijden).
  10. Pour ijskoud ACSF in de snijkamer.
  11. Snijd hersensneden van 400-500 µm met behulp van een vibrerende weefselsnijder.
  12. Breng hersensneden over naar een houderkamer met geoxygeneerd ACSF en incubeer gedurende minimaal 1 uur bij 30 °C voor het experiment.

3. Fysiologische opname

  1. Na de incubatieperiode, breng een snede over naar een opnamekamer op een gemodificeerde microscooptafel.
  2. Beveilig de snede in het bad tijdens het experiment met behulp van enkele draden Nylon-filamenten die zijn bevestigd aan een platinadraad snedehouder.
  3. Perfuseer de snede constant met ACSF.
  4. Trek opnamepipetten naar een tipweerstand van 3-6 MΩ wanneer gevuld met intracellulaire oplossing met de volgende samenstelling (in mM): 127 K-gluconaat, 3 KCl, 1 MgCl2, 0,07 CaCl2, 10 HEPES, 2 Na2-ATP, 0,3 Na-GTP, 0,1 EGTA. De intracellulaire oplossing moet een pH van 7,3 hebben, aangepast met KOH of gluconzuur en de osmolalitéit van 280-290 mOsm.
  5. Gebruik een standaard gevisualiseerde geheelcel-opnameopstelling en plaats de opnamepijpen dicht bij het te opnemen neuron terwijl u positieve druk toepast22,23.
  6. Laat de positieve druk los terwijl u zuiging toepast om een Gigaohm-seal te vormen.
  7. Breng een korte zuiging toe om het membraan te breken en een geheelcel-configuratie-opname te vormen.
  8. Neem de reacties van neuronen op in voltage of stroomklem.

4. Laser-scanning Foto-stimulatie

  1. Start

Resultaten

Laser-scanning fotostimulatie van projecties tussen het primaire visuele gebied (V1) en het secundaire visuele gebied (V2) bij de muis werd uitgevoerd na injecties van pAAV-CaMKIIa-hChR2(H134R)-EYFP in V1 van een Balb/C-muis (Figuur 3). De CaMKIIa-promoter in dit viraal construct stuurt de specifieke expressie van channelrhodopsin-EYFP aan in excitatoire glutamaterge neuronen1,15. Na de preparatie van coupes voor fysiologische registratie werd de expressie van channelrhodopsin-EYFP-vezels, i.e. de epifluorescentie van het geconjugeerde EYFP, waargenomen terwijl deze van V1 naar V2 liepen (Figuur 3A). Daarnaast werden ook de corticothalamische vezels in de nucleus geniculatus lateralis (LGN) waargenomen (Figuur 3A). Whole-cell patch clamp-registraties van een neuron in V2 onthulden EPSC's die werden opgewekt na laser-scanning fotostimulatie van channelrhodopsin-EYFP-expresserende vezels in de onderste lagen van V2 (Figuur 3B).

In een ander voorbeeld werd laser-scan fotostimulatie van de corticothalamische projecties van laag 6 van de primaire somatosensorische cortex (S1) naar de ventroposteriore nucleus (VP) uitgevoerd met behulp van dit protocol. Hierbij hebben we een Cre-Lox benadering gebruikt om specifiek de expressie van channelrhodopsine in de neuronen van laag 6 en de betreffende corticothalamische projecties te targeten. Concreet hebben we pAAV-Ef1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pA geïnjecteerd in S1 van B6.Cg-Tg(Ntsr1-cre)GN220Gsat/Mmcd muizen (Figuren 1 en 4). Deze transgene muizenstam tot expressie van Cre-recombinase specifiek in de corticothalamische neuronen van laag 621, wat resulteert in ChR-YFP expressie uitsluitend in die neuronen na transfectie door het 'floxed' AAV-construct. Na bereiding van de coupes werden channelrhodopsine-EYFP vezels waargenomen in de neuronen van laag 6 en vezels die projecteren naar laag 4 en VP (Figuren 4A en 4B). Fysiologische registraties van een VPm-neuron met behulp van whole-cell patch clamp onthulden dat er EPSC's konden worden opgewekt na laser-scan fotostimulatie nabij het geregistreerde neuron (Figuren 4C en 4D).

De morfologie van de gelabelde vezels kon gemakkelijker worden beoordeeld na de fysiologische opnames. Hierbij hebben we coupes (50 μm) opnieuw gesneden die channelrhodopsin-EYFP expressie vertoonden in corticothalamische neuronen van laag 6 (Figuur 5). Dit onthulde een fijn patroon van gelabelde vezels die van laag 6 naar laag 4 liepen, waar ze eindigden en uitgebreid vertakten (Figuur 5A). Daarnaast werden corticothalamische vezels waargenomen die de witte stof binnengingen en richting de thalamus liepen (Figuren 5A en 5B).

Diagram van genbewerking met gebruik van Cre-loxP voor gerichte ChR-YFP expressie in een muismodel.
Figuur 1. Schematische weergave van de gerichte expressie van channelrhodopsine via een Cre-Lox benadering. Transgene muizen die Cre-recombinase tot expressie brengen in de neuronale populaties van belang worden geïnjecteerd met een 'gefloxed' virus dat codeert voor channelrhodopsine gefuseerd aan een fluorescent eiwit, zoals YFP. Na transfectie zullen alleen neuronen met Cre-recombinase channelrhodopsine-EYFP tot expressie brengen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Lasermicroscopie-diagram met laseroptica, dichroïsche spiegel, CCD-camera en scanning-opstelling.
Figuur 2. Schematische illustratie van de fotostimulatie-opstelling. (A) Diagram van de laser-scanning fotostimulatie-opstelling. De laserstraal wordt opeenvolgend via een open straalsysteem naar een sluiter en een neutraal dichtheidsfilter (N.D.-filter) geleid. Een dekglas reflecteert een deel van de straal naar een fotodiode die is verbonden met een versterker voor laservermetingen. Spiegelgalvanometers worden gebruikt om de laserstraal via een scanlens te positioneren, die de straal door een zijpoort aan de bovenzijde van de microscoop leidt. De straal wordt vervolgens via een dichroïsche spiegel naar beneden door de objectieflens naar de coupe-preparaat gereflecteerd. Voor verdere details zie Lam en Sherman23 en Shepherd29. (B) Voorbeeld van het fotostimulatie-rasterpatroon voor het representatieve experiment getoond in Figuur 3. Het 16 x 16 stimulatieraster is overgelegd op een fotomicrografie van het coupe-preparaat. Een rode ster geeft de locatie aan van een neuron dat is geregistreerd met whole-cell patch clamp. De positie van de laserstraal wordt naar elk van de 256 posities in het stimulatieraster geleid door computergestuurde positionering van de spiegelgalvanometers. De laserposities van de eerste 5 stimulatieplaatsen zijn in de figuur afgebeeld. De responsen van het geregistreerde neuron op fotostimulatie op elk van de plaatsen zijn weergegeven in Figuur 3. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Neuro-imagingkaart diagram; analyse van LGN, V1, V2 visuele cortex; studie naar neurale verbindingen.
Figuur 3. Laser-scanning fotostimulatie van corticocorticale projecties van de primaire visuele cortex (V1) naar de secundaire visuele cortex (V2) bij de muis. (A) Epifluorescentiebeeld van de slice-preparatie waarop channelrhodopsine-EYFP-vezels van V1 naar V2 en in de nucleus geniculatus lateralis (LGN) te zien zijn. Specifieke expressie van channelrhodopsine-EYFP in excitatoire glutamaterge neuronen wordt aangestuurd door een viraal construct met de CaMKIIa-promotor. (B) Excitatoire postsynaptische stromen (EPSC's) opgewekt in een neuron in V2 na laser-scanning fotostimulatie. De rode ster geeft de registratieplaats aan. Schaalbalken: (A) 500 µm, (B) 200 pA, 100 msec. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Diagram van de corticale laag met analyse van de VP-regio; brengt micro-elektrische activiteit in kaart; elektrofysiologische gegevens.
Figuur 4. Laser-scanning fotostimulatie van corticothalamische projecties van de primaire somatosensorische cortex (S1) naar de ventroposterieure nucleus (VP) in de muis. (A) Epifluorescentiebeeld van de coupespreparaat waarop channelrhodopsine-EYFP-vezels in S1 te zien zijn. (B) Epifluorescentiebeeld van gelabelde vezels in VP. (C) Excitatoire postsynaptische stromen (EPSCs) opgewekt in een VP-neuron na laser-scanning fotostimulatie. (D) Grafiek van de gemiddelde EPSCs. De rode ster geeft de registratieplaats aan. De omkaderde sporen in (C) komen overeen met de omkaderde waarden in (D). Schaalbalken: (A) 250 µm, (B) 250 µm, (C) 100 pA, 100 msec. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Fluorescentiemicroscopie die neuronale structuren laat zien, gelabeld met groene markers; vergelijkingsdiagram.
Figuur 5. Beeldvorming van laag 6-neuronen die channelrhodopsin-EYFP tot expressie brengen in de primaire somatosensorische cortex (S1) van de muis. (A-B) Gelabelde neuronen in laag 6 en vezels die projecteren naar laag 4 en de witte stof. Schaalbalken: (A) 250 µm, (B) 250 µm. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Discussie

Het beschreven protocol beschrijft een aanpak voor de in vitro beoordeling van functionele topografie en fysiologie van neuronale circuits, die niet beperkt is tot het onderzoek van voorhersencircuits, d.w.z. die van de thalamus en cortex. Er zijn verschillende virale constructen voor optogenetische transfectie beschikbaar gesteld aan de wetenschappelijke gemeenschap en zijn gemakkelijk verkrijgbaar bij de UNC Vector Core. Voor een beschrijving van de beschikbare virale constructen, zie de UNC Vector Core31, de optogenetische bronnenpagina op het Deisseroth Lab aan de Stanford University32 en het Boyden synthetische neurobiologie-lab aan de MIT33. Varianten van deze opsins zijn ontwikkeld door deze labs en maken een breed scala aan modi mogelijk voor het controleren van neuronale exciteerbaarheid1,2. Het verkrijgen van deze vectoren van de UNC Vector Core vereist een materiaaloverdrachtovereenkomst van de oorspronkelijke labs. In dit protocol merken we op dat het toevoegen van polybrene de transfectie-efficiëntie verbetert. Bovendien is een andere variabele die de expressie beïnvloedt de post-chirurgische herstelperiode, waarbij we opmerken dat een periode van minimaal 14 dagen voldoende is om een robuuste expressie in de voorhersenbanen van muizen te verkrijgen.

Voor de gerichte transfectie van specifieke neuronale groepen zijn verschillende Cre-transgene muislijnen ontwikkeld, die kunnen worden gebruikt in combinatie met 'floxed' omgekeerde open leesraam virale constructen die zijn ontwikkeld11. Verschillende stamsoorten die relevant zijn voor neurowetenschappelijk onderzoek zijn verkrijgbaar via de Mutant Mouse Regional Resource Centers34. Atlassen van Cre-recombinase-expressiepatronen in deze transgene lijnen worden aangeboden via de GENSAT-database35. Daarnaast biedt Jackson Labs verschillende Cre-transgene stammen, evenals andere die opsins constitutief tot expressie brengen in specifieke neuronale groepen. Een cruciale stap bij het gebruik van deze muislijnen is het meenemen van de tijd die nodig is voor het verkrijgen en vestigen van een fokkolonie, wat kan variëren op basis van de specifieke stam van belang.

Voor fotostimulatie hebben we het opgezette apparaat gebruikt en aangepast dat is ontwikkeld door het Shepherd Lab aan de Northwestern University, beschreven in een recent protocol29. Hoewel geoptimaliseerd voor het ontketenen van glutamaat, is dit apparaat ook geschikt voor fotostimulatie van channelrhodopsine zonder aanpassing. Dit apparaat maakt nauwkeurige ruimtelijke controle en positionering van de loci van fotostimulatie mogelijk, wat een beoordeling van de functionele topografie van channelrhodopsine innervatie van opgenomen neuronen mogelijk maakt. Hoewel ruimtelijke controle wordt verbeterd met deze methode van fotostimulatie, is het kostenintensiever dan methoden die gebruik maken van LED-gebaseerde veldverlichting20. Bovendien is de nonuniformiteit van hersenweefsel een beperking van optogenetiek, of enige technieken die manipulatie van licht omvatten. In de praktijk is het echter zelden een factor omdat resultaten meestal kwalitatief worden geïnterpreteerd. In het geval dat een meer kwantitatief vergelijk tussen hersengebieden nodig is, kan men altijd de maximale lichtintensiteit gebruiken om 'verzadigde' reacties te bereiken.

Bovendien hebben we zowel Tidelwave als Ephus softwareprogramma's geschreven in Matlab gebruikt voor het besturen van laser-scanning fotostimulatie en data-acquisitie25,26. Het wordt echter aanbevolen dat degenen die een soortgelijk systeem opzetten, de nieuwere Ephus-software26 gebruiken, die beschikbaar is via de Janelia Farms ontwikkelsite30. Een sleutelstap is het kiezen van welke van deze softwarepakketten te gebruiken, omdat hun hardwarevereisten enigszins verschillen. Bovendien zijn de kaartanalyseprogramma's afgestemd op hun respectieve data-acquisitieprogramma's.

Verschillende van deze stappen kunnen worden aangepast om aan de specifieke setup van de beoefenaar te voldoen. Injecties van virale oplossingen kunnen worden uitgevoerd met leveringsmechanismen naast een spuit, bijv. capillaire glazen pipetten getrokken naar tipdiameters van ~40 μm werken ook goed. Voor operaties kan een niet-stereotaxische hoofdhouder worden vervangen als dergelijke coördinaten niet vereist zijn voor het begeleiden van injecties. Bovendien kunnen de samenstellingen van ACSF en intracellulaire oplossing worden gewijzigd, afhankelijk van de specifieke experimentele vereisten, bijv. het vervangen van een cesium of hoge chloride intracellulaire oplossing om remmende stromen te isoleren. Ook kan een alternatief voor het beeldvormen van expressiepatronen in vaste plakken ook worden gedaan in de levende plak op een geschikte beeldvormingsstelling met een badperfusiesysteem.

Kortom, dit protocol stelt de beoefenaar in staat om de functionele topografie en synaptische fysiologie van projecties in vitro te karakteriseren, wat mogelijk niet mogelijk is met standaardmethoden, bijv. karakterisering van langeafstandsprojecties die niet in een plak kunnen worden bewaard. Het beschreven transfectieprotocol kan worden toegepast op in vivo optogenetische experimenten1-3,12,14, aangezien het afleveringsmechanisme hetzelfde is. Ten slotte, hoewel dit protocol transfectie van muizen beschrijft, kunnen veel van de beschikbare virale vectoren theoretisch worden gebruikt om deze opsins in een breed scala aan zoogdiersoorten te transfecteren en tot expressie te brengen, waardoor een groot aantal vergelijkende en soortspecifieke studies mogelijk zijn1-3.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrentieel belang hebben. De auteur (CCL) ontving een publicatiesubsidie van Leica Microsystems, dat een instrument produceert dat bij het filmen van dit protocol werd gebruikt.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door NIH/NIDCD-subsidie R03 DC 011361, SVM CORP-subsidie LAV3202, NSF-LA EPSCoR-subsidie PFUND86, en een publicatiesubsidie van Leica Microsystems (CCL) en NIH/NIDCD-subsidie R01 DC 008794 (SMS).

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
PolybreneSanta Cruz BiotechSC134220
Paraformaldehyde 32% oplossingEMS15714
VECTASHIELDVector LabsH-1400
AAV virale constructiesUNC Vector CoreNA
Muis stereotactische hoofdhouderStoelting51730
Nanocool-injectorHarvard Apparatus703040
UV-laser: 355 nm, Nd:YVO4; 1 W;DPSS Lasers, Inc3500
GalvanometerCambridge Scanning6210
spiegelsCambridge Scanning6m2003S-A
montageCambridge Scanning6102103L
kabelCambridge Scanning6010-19-120
driver/controllerCambridge Scanning67121-1
Shutter - ZM gecoat (UV-compatibel)UniblitzL23-ZM2
Shutter ControllerUniblitzVMM-D1
StroomversterkerStanford Research SystemsSR570
6713 boardNational Instruments777741-01
2110 break-out boxNational Instruments777643-01
PCI-MIO-16E-4National Instruments777383-01
BNC-2090National Instruments777270-01
KabelsNational Instruments184749-01
MATLABMathworks
TCS SP2Leica Microsystems
```

Referenties

  1. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat. Rev. Neurosci. 13, 251-266 (2012).
  2. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends Cog. Sci. 15, 592-600 (2011).
  3. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71, 9-34 (2011).
  4. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13940-13945 (2003).
  5. Zemelman, B. V., Lee, G. A., Ng, M., Miesenbock, G. Selective photostimulation of genetically ChARGed neurons. Neuron. 33, 15-22 (2001).
  6. Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications. Brain Cell Biol. 36, 129-139 (2008).
  7. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. M. illisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
  8. Lanyi, J. K. Halorhodopsin: A light-driven chloride ion pump. Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 15, 11-28 (1986).
  9. Han, X., Boyden, E. S. Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution. PLoS One. 2, (2007).
  10. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodpsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-755 (2011).
  11. Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat. Neurosci. 15, 793-802 (2012).
  12. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).
  13. Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. Optical deconstruction of parkinsonian neural circuit. Science. 324, 354-359 (2009).
  14. Olsen, S. R., Bortone, D. S., Adesnik, H., Scanziani, M. Gain control by layer six in cortical circuits of vision. Nature. 483, 47-52 (2012).
  15. Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).
  16. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Na. Neurosci. 10, 663-668 (2007).
  17. Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons. Neuron. 65, 230-245 (2010).
  18. Lee, C. C., Lam, Y. W., Sherman, S. M. Intracortical convergence of layer 6 neurons. Neuroreport. 23, 736-740 (2012).
  19. Mancuso, J. J., et al. Optogenetic probing of functional brain circuitry. Exp. Physiol. 96, 26-33 (2011).
  20. Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. Using affordable LED arrays for photo-stimulation of neurons. J. Vis. Exp. (57), (2011).
  21. Gong, S., et al. Targeting Cre recombinase to specific neuron populations with bacterial artificial chromosome constructs. J. Neurosci. 27, 9817-9823 (2007).
  22. Cox, C. L., Sherman, S. M. Control of dendritic outputs of inhibitory interneurons in the lateral geniculate nucleus. Neuron. 27, 597-610 (2000).
  23. Lam, Y. W., Sherman, S. M. Mapping by laser photostimulation of connections between the thalamic reticular and ventral posterior lateral nuclei in the rat. J. Neurophysiol. 94, 2472-2483 (2005).
  24. Lam, Y. W., Sherman, S. M. Functional organization of the somatosensory cortical layer 6 feedback to the thalamus. Cereb Cortex. 20, 13-24 (2010).
  25. Shepherd, G. M., Pologruto, T. A., Svoboda, K. Circuit analysis of experience-dependent plasticity in the developing rat barrel cortex. Neuron. 38, 277-289 (2003).
  26. Suter, B. A., et al. Ephus: multipurpose data acquisition software for neuroscience experiments. Front Neural Circuits. 4, (2010).
  27. Lee, C. C., Sherman, S. M. Topography and physiology of ascending streams in the auditory tectothalamic pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 372-377 (2010).
  28. Lee, C. C., Sherman, S. M. Intrinsic modulators of auditory thalamocortical transmission. Hear Res. , 287-2843 (2012).
  29. Shepherd, G. M. Circuit mapping by ultraviolet uncaging of glutamate. , Cold Spring. 998-1004 (2012).
  30. ScanImage, Ephus, and other DAQ software [Internet]. , Janelia Farms. Ashburn (VA). Available from: http://www.ephus.org (2003).
  31. UNC Gene Therapy Center [Internet]. , University of North Carolina. Chapel Hill (NC). Available from: http://genetherapy.unc.edu/services.htm (2003).
  32. Optogenetics Resource Center [Internet]. , Stanford University. Stanford (CA). Available from: http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics (2003).
  33. Synthetic Neurobiology Group [Internet]. , MIT. Cambridge (MA). Available from: http://syntheticneurobiology.org (2003).
  34. Mutant Mouse Regional Resource Centers [Internet]. , NIH. Bethesda (MD). Available from: http://www.mmrrc.org (2003).
  35. GENSAT Brain Atlas [Internet]. , NIH. Bethesda (MD). Available from: http://www.gensat.org/cre.jsp (2003).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Optogenetische targetingChannelrhopsine expressiewhole cell patchclampconfocale microscopievirale transfectieCre lox recombinatieslice preparatiefunctionele topografiesynaptische eigenschappen
Laser-scanning fotostimulatie van optogenetisch gerichte voorhersenencircuits
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.