Single-plant, Steriel Microcosmi voor nodulatie en groei van de peulvrucht installatie<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Met de stikstofbindende Symbiont<em&gt; Sinorhizobium meliloti</em

Samenvatting

Groei van Medicago truncatula planten in symbiose met de stikstofbindende bacteriën Sinorhizobium meliloti in individuele, steriele microkosmossen gemaakt van standaard laboratorium platen maakt veelvuldig onderzoek van het wortelstelsel en knobbeltjes, zonder afbreuk te doen aan de steriliteit. Planten kunnen in deze groeikamers worden gehandhaafd tot 9 weken.

Samenvatting

Stikstofbindende bacteriën vormen symbiotische, stikstofbindende knobbeltjes op de wortels van compatibele host vlinderbloemige planten. Een van de meest goed ontwikkelde modelsystemen voor de studie van deze interacties is de plant Medicago truncatula cv. Jemalong A17 en de stikstofbindende bacterie Sinorhizobium meliloti 1021. Herhaalde beeldvorming van plantenwortels en scoren van symbiotische fenotypes vereist methoden die niet-destructief om ofwel planten of bacteriën. De symbiotische fenotypes van sommige planten en bacteriële mutanten duidelijk worden na relatief korte perioden van groei, en geen langdurige observatie van de gastheer / symbiont interactie vereisen. Echter, subtiele verschillen in symbiotische efficiëntie en knobbeltje veroudering fenotypes die niet zichtbaar zijn in de vroege stadia van de nodulatie proces vereisen relatief lange periodes groei voordat ze kunnen worden gescoord. Verscheidene werkwijzen zijn ontwikkeld voor groei en observatie van de gastheer / symbiont paar lange termijn.Echter, veel van deze methoden vereisen herhaalde water, die de mogelijkheid van verontreiniging met andere microben vergroot. Andere methoden vereisen een relatief grote ruimte voor de groei van grote aantallen planten. De beschreven methode hier, symbiotische groei van M. truncatula / S. meliloti in steriele, single-fabriek microkosmos, heeft verschillende voordelen. Planten in deze batches voldoende vocht en voedingsstoffen zodat water niet nodig tot 9 weken, voorkomen kruisbesmetting tijdens drenken. Hierdoor kunnen fenotypes te worden gekwantificeerd die kunnen worden gemist op korte termijn groei systemen, zoals subtiele vertragingen in knobbeltje ontwikkeling en vroege knobbeltje veroudering. Ook zijn de wortels en knobbeltjes in de microcosmos gemakkelijk gezien door de plaat deksel, zodat actuele beworteling van de planten waarneming is niet vereist.

Inleiding

De interactie tussen de peulvruchten waardplant Medicago truncatula A17 en de stikstofbindende bacterie Sinorhizobium meliloti 1021 is een van de meest handelbare modelsystemen voor de studie van de wortel nodule ontwikkeling en stikstofbindende symbiose. De genomen van beide symbiotische partners zijn gesequenced ^1,2 en zowel plant als bacterie vatbaar zijn voor genetische manipulatie ^3,4. Analyse van de fenotypen van zowel plantaardige en bacteriële mutanten vereist het vermogen om de stadia van ontwikkeling nodule observeren en de symbiotische productiviteit kwantificeren tijd. Hier beschrijven we een methode voor de waarneming van de wortel knobbel ontwikkeling van M. truncatula cv. Jemalong A17 geënt met S. meliloti 1021 binnen afzonderlijke microkosmos gemaakt van standaard, rond 100 mm diameter, 15 mm diep laboratorium platen (Figuur 1A). De shoot is blootgesteld en groeit door een getande portaal in de zijkant van de plaat (Figures 1B, 1C en 1E). Wortels zijn vervat in de microkosmossen en hield steriele, terwijl waarneming door het deksel van de plaat (figuur 1D). Aangezien de shoot toegankelijk is, is de groei niet beperkt en kan worden gemeten periodiek zonder de steriliteit van de wortel. De methode om getande plaat batches werd oorspronkelijk ontwikkeld door Leigh, et ​​al.. ⁵ voor het kweken alfalfa planten, maar het was niet wijd goedgekeurd ondanks zijn vele voordelen boven andere methoden. Een variant op deze methode werd ontwikkeld voor de analyse van de interactie tussen plantenwortels en mycorrhizae ^6. We hebben nu aangepast en geoptimaliseerd deze methode voor de groei van M. truncatula planten. De voordelen van dit protocol dan meer gebruikelijke methoden worden hieronder beschreven.

Er zijn verschillende methoden die momenteel veel gebruikt voor nodulatie studies van M. truncatula inoculatieberekend met S. meliloti ^7. De meest gebruikte methode voor grootschalige bereiding van bladnodulerende wortels is de groei in luchtteelt caissons ^7. In deze methode worden planten opgehangen over een groot vat en wortels worden belucht met een mengsel van S. meliloti en voedingsoplossing ^7. Deze methode is handig als slechts een genotype van S. meliloti worden uitgetest. Aangezien aërosolvorming van hoge concentraties bacteriën vereist, is er een grote kans op kruisbesmetting tussen caissons geïnoculeerd met verschillende bacteriestammen. Een andere methode die vaak wordt gebruikt om grote hoeveelheden geïnoculeerde planten bereiden is groei in kuipen of potten van perliet, vermiculiet, zand of gecalcineerde klei die zijn doordrenkt met voedingsoplossing en geïnoculeerd met S. meliloti ^7. Deze methode vereist het gebruik van open bakken of potten, en vereist drenken en het bijvullen van de voedingsoplossing. Een ander nadeel van potten is dat plantenmoeten worden verwijderd uit deze deeltjes matrix voor het onderzoek van de wortels en knobbeltjes. Een ander nadeel van deze werkwijze is dat een groot gebied van incubator ruimte nodig wanneer veel verschillende S. meliloti genotypen worden vergeleken, omdat een aparte pot worden gebruikt voor elke bacteriële genotype. De "Leonard jar" is een variant op deze methode ^8,9. Een Leonard pot bestaat uit twee gesteriliseerd vaartuigen gestapeld bovenop elkaar en verbonden door een lont. Groeimedium geplaatst in het onderste vat opgesteld door de lont door capillaire werking in een groeimatrix perliet, vermiculiet, zand of gecalcineerde klei in het bovenste vat. De zaailing (s) in de groei matrix geplaatst en geïnoculeerd met S. meliloti. Deze methode vereist geen water geven, maar onderzoek van wortels en knobbeltjes vereist dat de zaailing van de deeltjes groei matrix worden verwijderd.

Er zijn verschillende methoden die wel toestaan ​​eenvoudig onderzoek van roots. Een daarvan is de doorzichtige plastic "growth etui" ^7. Een nadeel van deze werkwijze is dat vaak water nodig aangezien slechts ≤ 10 ml vloeibaar medium voor optimale groei M. truncatula in zakjes ^7. Pouch experimenten worden ook meestal beperkt tot ~ 2 weken ^7, als gevolg van afbraak van het papier lont in het zakje. Twee andere methoden die algemeen worden gebruikt zijn vergelijkbaar met onze werkwijze dat de planten gekweekt op agar en wortels zichtbaar, maar deze werkwijzen hebben ook nadelen dat onze procedure vermijdt. In deze werkwijzen worden planten geheel opgenomen binnen 24.5 cm x 24.5 cm agarplaten afgedicht rond de bovenkant met poreuze chirurgische tape of gekweekt in-agar schuine buizen afgesloten met prop watten of plastic doppen ^7. Beide methoden maken een eenvoudige onderzoek van wortels en kunnen steriel worden gehouden. Echter, de agarslant buizen meestal gekweekt met slechts 20 ml agar medium ⁷ en vereisen drenken en voedingsstoffen eenddition voor lange termijn groei van planten. Planten binnen de 24,5 cm x 24,5 cm agar plaat microkosmossen voldoende vocht en voedingsstoffen voor de groei op lange termijn, maar de groeiende shoot snel wordt beperkt binnen de bijgevoegde plaat microkosmos en ethyleen gas kan opbouwen remmen nodulatie ^7. In de hier beschreven procedure, wordt de shoot blootgesteld en groeit vrij buiten de microkosmos die ~ bevat 70 ml van de media, waardoor de groei op lange termijn.

De hier beschreven procedure kan niet alleen nuttig zijn voor de studie van nodulatie van vlinderbloemige planten, maar ook voor de studie van wortel fenotypen andere middelgrote planten. Het verschil tussen deze microkosmossen en een traditionele polycarbonaat plantenweefsel cultuur pot is dat wortels in de plaat batches beschreven groeien op het verticale oppervlak van de agar dan naar beneden in een horizontale laag van agar onderaan de pot. Hierdoor kan de wortel worden getild van het agar oppervlak met minimale dAmage naar wortelharen en minimale hechting van agar aan de wortel oppervlak, dat het onderzoek van wortelharen vergemakkelijkt door microscopie.

Protocol

Stappen 1, 2, 4 en 6 in een steriele laminaire stroming kap wordt aanbevolen.

1. Bereiding van M. truncatula A17 Zaailingen

Opmerking: M. truncatula A17 zaden die in deze studies worden geproduceerd onder kas condities gekoeld bij ongeveer 22 ° C, of een plantengroei kamer gehandhaafd op 22-26 ° C ~ 150-400 mmol / m ^-2 s ^-1 licht.

1. Giet zaadgerminatie platen: Gebruik 100 mm vierkante platen (15 mm diep) en giet geautoclaveerd 1,1-1,2% w / v gezuiverd agar ¹⁰ tot een diepte van 3-5 mm. Elke plaat wordt gebruikt ~ 0,25-0,5 g zaad (equivalent aan 63-125 zaden / plaat) ontkiemen.
   Opmerking: Het is cruciaal om plantencel-cultuur getest, gezuiverd agar gebruiken voor alle platen beschreven in dit protocol. De verkoper en catalogusnummer informatie voor de agar is opgenomen in de tabel van specifieke reagentia en apparatuur.
2. Gispen / steriliseren van de M. truncatula A17 zaads: Weeg voldoende zaden voor het gewenste aantal zaailingen. (M. truncatula A17 zaden zijn ~ 4 mg elk) Plaats zaden in steriele 125 ml flesjes met steriele folie covers (0.25-0.5 g zaad / fles, dit is ~ 63-125 zaden) en pipetteer 20 ml geconcentreerd (96%) H ₂ SO ₄ langs de zijkanten van de kolf.
   Opmerking: Acid scarification zal de zaden steriliseren. Ook, door pipetteren het zuur aan de zijkanten van de kolf opnieuw zal steriliseren de binnenzijde van de fles in contact met de gesteriliseerde zaden is gekomen.
3. Break up groepjes van zaad met een steriele glazen pipet. Swirl elke kolf vaak voor 10-12 minuten. Kleine, bruine putten zal zichtbaar zijn op de zaden worden. Dit zijn kleine gaatjes in de zaadhuid ^11.
   Opmerking: Draag oogbescherming en handschoenen bij het ​​werken met geconcentreerd H ₂ SO _4.
4. Verwijder H ₂ SO ₄ en spoel zaden: Als ten minste 10% van de zaden kleine bruine putjes, of 12 minuten zijn verstreken, welkekomt eerst, verwijder alle zuur uit de kolven met een steriele glazen pipet. (Plaats afval zuur in een 1-2 L bekerglas met ten minste 300 ml leidingwater. Hierdoor wordt het zuur te verdunnen en oververhitting te voorkomen.) Kantel de kolf met het resterende zuur in de bocht van de kolf verzamelen en gebruiken een kleine glazen pipet Verwijder alle resterende zuur. Als resterende zuur blijft, zal het reageren met het spoelwater, verwarm de zaden en hen doden.
   1. Spoel zaden door snel gieten 100 ml steriel ultrapuur water in elke kolf. De overmaat hoeveelheid water wordt het zuur verdund en gedurende de reactie van het zuur met water te voorkomen oververhitting en zaden schade. Giet het water en vlam steriliseren de lip van de kolf.
   2. Spoel zaden 8-10x met 50 ml steriel ultrapuur water. Schud de fles tijdens elke spoeling. De kolf moet steriel worden beschouwd op dit punt en de lip van de kolf moet worden gevlamd voor elke spoeling.
5. Laat zaden indrinken 's nachts: Na delaatste spoelwater, giet 50 ml steriel ultrapuur water in elke kolf, vervangt de steriele folie deksel op elke kolf en plaats bij 4 ° C in het donker 's nachts.
6. Plaats zaden op kieming plaat: Na het te laten zaden indrinken 's nachts, giet water, spoel 2x met ~ 25 ml ultrapuur water, voeg dan 20 ml steriel ultrapuur water, werveling om zaden opnieuw in suspensie en giet ze op een 1,1-1,2% agar kieming plaat uit stap 1.1. Als zaden blijven in de kolf, voeg meer water en giet het opnieuw. Verdeel de zaden uit elke kolf een plaat (63-125 zaden / plaat).
   1. Swirl de plaat om de zaden te verspreiden. Het zaad wordt gelijkmatig verdeeld in een 4-5 cm band aan een uiteinde van de plaat. Dit zal de "top" van de plaat zijn. De "onderkant" 5-6 cm moet vrij zijn van zaden (Figuur 2A) worden gehouden.
   2. Trekken uit het water met een steriele pipet. Kantel de plaat bij een hoek van 45 ° om het resterende water afvoer naar de bodem van de plaat te laten. Plaats de deksel op de tilted bord en bescherming tegen licht. De platen moeten worden toegestaan ​​om 10-20 minuten uitlekken. (Figuur 2B).
7. Stel kieming: verwijderen water heeft verzameld op de bodem van de afscheider met een steriele pipet.
   1. Plaats het deksel en sluit de plaat met parafilm. Draag handschoenen en steriel te houden (figuur 2C).
   2. Stapel de kieming borden en zet ze allemaal op naar een hoek van 90 °. De zaden worden liggend op het verticale oppervlak van de agar. Volledig ingezogen zaden moet gemakkelijk houden aan de agar. De wortels zullen naar beneden groeien (figuur 2D).
   3. Wikkel de stapel kieming platen in folie om licht te blokkeren en te houden bij 25 ° C gedurende 3 dagen.

Opmerking: Als de kieming opbrengst voor minder dan 3 dagen, kan de wortels te kort om de agar bereiken in microkosmossen zijn. Als kieming verloopt meer dan 4 dagen vóór de overdracht aan microkosmos platen, overleving van zaailingen zalslecht zijn. Als M. truncatula ecotypes of mutanten met langzamere ontkiemingspercentages worden vergeleken, moeten langzaam kiemende ecotype mogen langer dan 3 dagen ontkiemen.

2. Voorbereiding van de individuele Plate Microcosmi

1. Bereid Jensen medium ¹² (zie tabel 1 voor samenstelling), waardoor ~ 70 ml medium voor elke microkosmos. Bereiden in kruiken of kolven die handig voor zijn snelle gieten (niet meer dan 1-2 L per werper) en een magnetische roerstaaf in de werper tijdens autoclaveren.
   1. Nadat medium is afgekoeld tot ~ 55-65 ° C, supplementen toegevoegd en de pH werd gecontroleerd (zie tabel 1), giet in rond 100 mm, 15 mm diepe borden. De platen moeten worden gegoten ~ 0,9-1 cm diep (~ 70 ml / plaat).
   2. Onderdelen van Jensen medium kan een troebel precipitaat vormen, dus is het belangrijk om de werper periodiek terugkeren naar de magnetische roerplaat onderdelen voorkomen bezinking. Precipitatie kan tennis van het bord nadat ze stollen, en hebben geen invloed op de prestaties, zolang deze gelijkmatig zijn verdeeld over de platen.
   3. Stapel platen tijdens het storten aan de vorming van condensatie op de plaat deksels voorkomen.
2. Na Jensen platen gestold, notch beide platen en deksels met een gewicht spatel die is gebogen in een U-vorm ⁵ (Figuur 3A). Verhit de bocht van de spatel met een brander tot roodgloeiend, inkeping 5-6 borden en verwarm dan weer. Wanneer de getande deksel op de schuine plaat wordt geplaatst, zal deze een ovale poort waardoor de shoot van de zaailing zal groeien (Figuur 3B) te creëren. Als getande platen moeten worden opgeslagen, wikkel individueel met paraffine film ..

3. Voorbereiding van Sinorhizobium meliloti Culturen

Twee dagen voor planten inentingen, start culturen van alle S. meliloti stammen worden geïnoculeerd zaailingen. Cultures moeten worden gekweekt in LBMC (Luria-Bertani [Miller]) medium ¹³ aangevuld met 2,5 mM _MgSO4, 2,5 mM _CaCl2, en geschikte antibiotica (TY medium werkt ook goed). Zo weinig als 2-3 ml van elke kweek voldoende.

1. Groeien bij 30 ° C onder schudden gedurende 2 dagen tot cellen dicht.
2. Voor de meeste planten inentingen, de groeifase van de S. meliloti is niet kritisch. Typisch, laat inloggen of vroeg-stationaire cellen worden gebruikt.

4. Het opmaken van M. truncatula Zaailingen op Individuele Microcosmi

1. Na 3 dagen, open een kieming plaat (bereid in stap 1) en onmiddellijk te overspoelen met steriel ultrapuur water. Dip pincet in ethanol en vlam kort te steriliseren. Gebruik steriele tang om duw de wortel tips van alle zaailingen onder water om uitdroging te voorkomen. Wortels zullen variëren 2-6 cm lang. De meerderheid zal 3-4 cm zijn. Selecteer zaailingen met rechte wortels en geen duidelijkedefecten.
2. Controleer de deksels van medium microkosmossen de Jensen's voor de opbouw van condensatie. Flick de deksel om de condensatie te verwijderen of te vervangen door een nieuwe getande deksel. Als er een overmaat van condensatie op het deksel, kan de zaailing wortel zich aan het deksel en sterven na de condensatie droogt.
3. Met behulp van de tang, voorzichtig kies een zaailing van de kieming plaat door de zaadlobben en leg de root op medium microkosmos een Jensen. Controleer de wortelpunt in contact met de agar.
4. Verwijder voorzichtig de zaadhuid als het nog steeds aanwezig. De zaadvliezen moet los na weken in water gedurende 5-10 minuten. Zachtjes plagen de zaadhuid met de tang totdat het geeft weg, en gooi ze weg. De zaadlobben en ongeveer 0,5 cm van shoot moet uit de U-notch uitsteken in de plaat (Figuur 4A). Plaats voorzichtig de deksel van de plaat met de U-uitsparing van de deksel op de zaailing, het creëren van een portaal voor de zaailing (Figuur 4B).Zet platen opzij in horizontale stapels totdat alle zaailingen op microkosmossen geplaatst.
5. Gebruik alle zaailingen van elkaar kieming plaat die levensvatbaar kijken en hebben een rechte wortel. (Indien mogelijk, laat een plaat van zaailingen ongeopend te gebruiken als vervanging voor verwelkte zaailingen net voor inenting.)
6. Na het leggen van alle zaailingen, hen in staat stellen om te zitten op de horizontale Jensen's microkosmossen terwijl de S. meliloti inoculum suspensies zijn in voorbereiding.

5. Bereiding van S. meliloti Inoculum Schorsingen

1. Controleer S. meliloti culturen periodiek na enten om zeker te zijn dat ze groeien. Na 2 dagen groei, moet de OD ₆₀₀ tussen 2 en 4.
2. Pipetteer 0,5 ml van elke kweek in een steriele buis van 1,5 ml en centrifugeer tot pellet. Verwijder supernatant.
3. Was de cellen twee keer in beide 0,85% steriel NaCl of steriel ultrapuur water. Resuspendeer cellen in 0,5 ml 0,85% sterile NaCl of ultrapuur water.
4. Meet de OD ₆₀₀ van een 1/10 verdunning van geresuspendeerd S. meliloti culturen uit stap 5.3. Op basis van deze lezing, maak een schorsing van elke cultuur in steriele ultrapuur water bij OD ₆₀₀ = 0,05. Als de celdichtheid te hoog is, kan nodulatie worden geremd. Maak genoeg van het verdunde suspensie zodat 100 pi kan worden geënt op elke zaailing. De troebelheid van de OD ₆₀₀ = 0,05 schorsing moet gewoon nauwelijks waarneembaar met het blote oog.

6. Inenting en afdichten van Microcosmi

1. Onmiddellijk voorafgaand aan het begin van inentingen, controleer verlepte zaailingen die niet de overdracht aan medium microkosmos van het Jensen hebben overleefd. Vervangen die zaailingen met verse zaailingen van kieming platen.
2. Open elke microkosmos en te enten 100 ul van de juiste S. meliloti schorsing op de zaailing wortel. Plaats het deksel en zet apart in horizontale stacks van 6-10 microkosmos. Voor elke S. meliloti stam te vergelijken, inoculeren tenminste 15 planten. Voor stammen die subtiele verschillen in symbiotische productiviteit, te enten 30-35 planten. Laat minstens 10 planten ongeënt als een negatieve controle. Beënt 30-35 planten met S. meliloti 1021 of een andere geschikte wild-type stam om te dienen als de positieve controle.
3. Na de S. meliloti schorsing heeft tijd om te adsorberen gehad op de wortel oppervlak en de suspensie vloeistof is gedrenkt in de agar (ten minste 20 minuten.), wikkel elke plaat afzonderlijk met paraffine film. De platen moeten worden verpakt tot de rand van de uitsparing, maar het paraffine film niet de groei van de zaailing (figuur 4C) blokkeren.
4. Op het moment van verpakking een laatste controle wortels gehecht aan de binnenzijde van de deksel plaat. Om gehandeld wortels uit het deksel te verwijderen, leg de plaat plat op de bank en tik of veeg het deksel aan de wortel slaan terug op de agar surface.
5. Line up de zaailing portalen van elke stapel van 6-10 borden. Leg de stapel in een hoek van 90 ° met de zaailingen naar boven gericht (Figuur 4D). De kleverigheid van het paraffine film de platen op zijn plaats lang genoeg om de hele stapel verpakken in folie, waardoor een 1-2 cm strip uitgepakt wanneer de zaailingen komen (figuur 4E). De folie zal de wortels te beschermen tegen licht.
6. Plaats de folie verpakte stapels in een verlichte groeikamer of de groei ruimte bij 21-25 ° C, 60-70% relatieve vochtigheid en 100-175 umol / m ^-2 s ^-1 licht op een 16 uur licht / 8 uur donker cyclus ( Figuur 1A). Onder deze groeicondities, langdurige incubatie op licht hoger dan 200 umol / m ^-2 s ^-1 kan een nadelig effect hebben op de groei van planten te hebben.

7. Onderzoek van Root Systems en kwantificering van symbiotische Fenotypes

Planten kunnen worden gehandhaafdmicrokosmos voor maximaal 9 weken.

1. Knobbeltje nummer kan op een aantal tijdstippen worden gekwantificeerd door het uitpakken van de folie van elke stapel en het tellen van knobbeltjes. Ontwikkeling knobbeltjes op planten geïnoculeerd met S. meliloti 1021 wild type zijn duidelijk zichtbaar door 10-14 dagen na inenting.
2. Symbiotische productiviteit kan op elk tijdstip worden bepaald door de lengte van de opkomende schieten.
3. Uiteindelijke kwantificering van symbiotische productiviteit wordt meestal uitgevoerd bij 7 weken na de inenting door het losmaken van de shoot en het meten van het versgewicht van de shoot. Deze stap kan zo laat 9 weken worden uitgevoerd indien langer groei gewenst is.

Resultaten

De bereiding en inoculatie van deze plaat microcosmos is relatief eenvoudig in vergelijking met andere methoden in de inleiding beschreven. Het gebruik van deze microkosmos laat ook langdurig plantengroei (maximaal 9 weken) zonder water of voedingssupplementen, onderhoud van wortel steriliteit, zowel gemakkelijk onderzoek van wortels en de bescherming van de wortels van het licht, groei van de vrije plant scheuten, gemakkelijke toegang tot de shoot voor lengtemeting, en verwijdering van planten uit de batches met minima...

Discussie

Er zijn verschillende stappen van het protocol dat van cruciaal belang voor het succes zijn: 1) De noodzaak van het gebruik van gezuiverd, plantencel-cultuur getest agar kan niet genoeg benadrukt worden. Dit is niet kritisch voor alfalfa zaailingen, maar het is essentieel voor de groei van M. truncatula A17. 2) Het is belangrijk dat zaailingen ontkiemen inzake verticale agarplaten zoals beschreven in stap 1. De veel gebruikte techniek van kiemende zaailingen op een omgekeerde horizontaal oppervlak in een 15 mm ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agar gezuiverd, getest op plantencelcuur	Sigma	A7921