Strekken in Brain microvasculaire endotheelcellen (CEND) als een<em&gt; In Vitro</em&gt; Traumatisch Hersenletsel Model van de Blood Brain Barrier

Samenvatting

In vitro traumatisch hersenletsel modellen gewerkt te reproduceren in vivo hersenen vervorming. Stretch-geïnduceerde schade is werkzaam voor astrocyten, neuronen, gliacellen, aorta, en de hersenen endotheelcellen. Echter, maakt gebruik van ons systeem een bloed-hersenbarrière (BBB) ​​model dat eigenschappen die een legitiem model van de BBB om een te vestigen in vitro TBI model bezit.

Samenvatting

Vanwege de hoge mortaliteit incident teweeggebracht door traumatisch hersenletsel (TBI), methoden mogelijk zou men beter begrijpen van de onderliggende mechanismen bij betrokken zijn nuttig voor behandeling. Er zijn zowel in vivo en in vitro methoden daarvoor. In vivo modellen werkelijke hoofdletsel bootsen zoals optreedt tijdens TBI. Echter, in vivo technieken kunnen niet worden benut voor studie aan de cel fysiologie niveau. Dus in vitro werkwijzen zijn voordeliger hiervoor omdat zij gemakkelijker toegang tot de cellen en de extracellulaire omgeving te manipuleren.

Het protocol geeft een in vitro model van TBI met stretch letsel hersenen microvasculaire endotheelcellen. Het maakt gebruik van de druk waarbij de cellen gekweekt in flexibele-vormige putjes. De toegepaste druk kan gemakkelijk worden gecontroleerd en kunnen verwondingen die varieert van laag tot ernstig produceren. De murinehersenen microvasculaire endotheelcellen (CEND) gegenereerd in ons laboratorium is een geschikt model voor de bloed-hersen barrière (BBB) ​​waardoor voor een voordeel voor andere systemen die een soortgelijke techniek gebruiken. Bovendien, vanwege de eenvoud van de werkwijze proefopstelling gemakkelijk gedupliceerd. Zo kan dit model worden gebruikt bij het bestuderen van de cellulaire en moleculaire mechanismen betrokken bij TBI op de BBB.

Inleiding

Traumatisch hersenletsel (TBI) is een van de belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd. Ongeveer 10 miljoen mensen worden jaarlijks getroffen door TBI waardoor het een belangrijk gezondheidsprobleem en medisch probleem ^1. Vanwege dit, verschillende in vivo en in vitro modellen van TBI zijn opgericht en ontwikkeld om de mechanismen te bestuderen ^2,3,4. Een beter begrip van TBI kan helpen bij het ​​verbeteren van de behandeling van patiënten en verminderen de bijbehorende mortaliteit, morbiditeit en kosten.

Vele modellen voor hersenletsel die zowel in vivo en in vitro methoden gebruiken bestaan. In vivo modellen kunnen de feitelijke gebeurtenis van hoofdletsel nabootsen. Vanwege de complexiteit van de in vivo situatie, toegankelijkheid van het weefsel van belang wordt beperkt ^2. Het begrijpen van de fysiologische respons van individuele cellen als gevolg van de verwonding toegebracht, is het belangrijk dat de cellen worden geïsoleerd uit de systemische effecten diekunnen remmen of te wijzigen hun individuele respons ^5. Daarom cellulaire modellen van trauma waardevolle voordelen boven dierlijke modellen omdat de mechanische omgeving van de cellen nauwkeurig kan worden geregeld ^6.

In vitro systemen die het gebruik van mechanische belasting cellen of weefsels veranderingen geïnduceerd door deze wijze van schade vast te stellen dienst ontwikkeld. Bijvoorbeeld, een methode voor het bestuderen van het effect van mechanische schade aan cellen vastgesteld voor astrocyten, neuronen, gliacellen en endotheelcellen ^7,8,9. De in vitro trauma model opgesteld voor de studie van knaagdieren en menselijke astrocyten reactiviteit ¹⁰ tewerkgesteld een drukregelinrichting identiek aan wat we gebruiken voor ons model. Dezelfde methode werd toegepast om beschadiging te induceren door rek in muizenhersenen microvaatje endotheelcellen (bEnd3) ¹¹ en corticale neuronen ^12,13 en, cerebrale endothEliel cellen van pasgeboren biggen ^14. Het apparaat vervormt de bodem van de cultuur en daardoor mechanische stretch verwondingen ¹⁰ produceren. Het kwaad doet op gekweekte cellen door de toepassing van luchtdruk boven de cellen. Deze druk kan het membraan waarop de cellen groeien buigen, waardoor het strekken van de cellen. Verschillende graden van rek (dat wil zeggen "laag" matige "of" ernstig ") kan worden bereikt door de luchtdruk pulsduur en de intensiteit daarvan. Deze methode van rek geïnduceerde schade werd gecorreleerd met ernstige verwondingen in vivo ^7. Bovendien deze wijze van schade maakt de nauwkeurige regeling van de extracellulaire omgeving en kan gemakkelijk worden gereproduceerd.

Hoewel een soortgelijke benadering is gebruikt voor vele andere celtypen waaronder hersenen bEnd3 ons model is een voordeel dat het gebruik maakt van de murine brein microvasculaire endotheelcellen (CEND) gegenereerdin ons laboratorium. Deze cellijn is een zeer geschikt model van de bloed-hersenbarrière (BBB). In vitro celculturen gebruikt als BBB modellen moeten kenmerken die hen in staat stelt om te dienen als permeabiliteit scherm bezitten. Een belangrijk criterium voor een in vitro cel model een voorspeller van BBB permeabiliteit is dat het fysiologisch realistisch cellenarchitectuur moet bezitten ^15. Ook al bEnd3 cellen weer onderscheidend spindel-achtige plaveiselcelcarcinoom morfologie in cultuur ^16, ze vertonen onregelmatige morfogenetische gedrag in vitro waarbij zij vormen cyste-achtige holtes in plaats van de reguliere buisvormige structuren in fibrine gels ^17. Bovendien, wanneer de cellen werden geïnjecteerd in embryonale en pasgeboren muizen, geïnduceerd zij snel groeiende tumoren dodelijk embryonale muizen maar niet bij pasgeboren en jonge muizen. Derhalve wordt gesuggereerd dat een of meer processen die normale endotheliale groei, migratie en differentiatie zijn veranderd of eliminated in deze cellijn ^18. Anderzijds, morfologische, immunocytochemische evaluatie van endotheliale en BBB markerexpressie, bioelectric en paracellulaire flux-metingen dat ons model CEND BBB inderdaad een geschikt model van de BBB ^19.

Brain endotheel in vivo wordt gekenmerkt door een zeer strakke permeabiliteit trans-endotheliale elektrische weerstand (TEER) variërend van 2,000-5,000 Qcm ^2. Voor studies van de hersenen microvasculatuur barrière-eigenschappen aan geneesmiddelen, moet paracellulaire restrictiviteit en dichtheid van de cellen worden beschouwd. In de meeste hersenen capillaire endotheelcellen (BCEC), is deze niet behouden als de cellen vertonen TEER variërend 50-100 Qcm ^{2 20.} De geïmmortaliseerde hersenen endotheelcellijn bEnd3 genereert TEER waarden van niet meer dan 60 Qcm ^{2 15.} Daarentegen differentiatie van CEND cellen met medium met verminderde serum schermTEER waarden variërend 300-500 Qcm ^{2 19,21.}

Tot op heden, in vitro modellen van stretch letsel in de hersenen gekweekte endotheelcellen schaars. Daarom moet een in vitro model voor trauma door letsel stretch middels hersenen gekweekte endotheelcellen die als model van de BBB kunnen nuttig blijken. In dit protocol, geven we een in vitro model van het feitelijke effect dat hersencellen, in het bijzonder hersenen microvasculaire endotheelcellen van de BBB, ontvangt gedurende TBI kan nabootsen. Het belangrijkste voordeel van dit model is dat de hoeveelheid schade aan de cellen toegediend en de extracellulaire omgeving kan gemakkelijk worden geregeld zodat een nauwkeurig gemakkelijk reproduceerbaar proefopstelling.

Protocol

1. Zaaien van endotheelcellen in Well Plates

1. Cultiveren murine brein microvasculaire endotheelcellen (CEND) in T75 kolf, waarbij het medium (DMEM met 10% FCS, 50 U / ml penicilline / streptomycine, 1% L-glutamine) tweemaal per week, tot confluentie bereikt. (Voor de opwekking en immortalisatie van de hersenen microvasculaire endotheelcellen, zie Burek et al., 2012;. Förster et al., 2005 ^21,19.).
2. Was de cellen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder de PBS en trypsinize de cellen met 2 ml warm trypsine-EDTA-oplossing.
3. Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 5 minuten of totdat de cellaag wordt gedispergeerd.
4. Voeg 8 ml kweekmedium in de cellen. Tik op de kolf meerdere keren om de cellen los.
5. Bekijk cellen onder de microscoop om volledige onthechting zorgen uit fles.
6. Pipet medium met vrijstaande cellen op en neer. Swirl de kolf aan de cel suspensi mengenop.
7. Neem 20 pi van de celsuspensie, zet in een hemocytometer en tel het aantal cellen.
8. Bepaal de celdichtheid zaad 20.000 cellen / cm ² in de put.
9. Breng de celsuspensie in collagen1 geprecoat 6 putjes flexibele bodem kweekplaten (57,75 ^cm2) in een totaal volume van 3 ml / putje. Elke well heeft een oppervlakte van 9,62 cm ^2.
10. Groeien de cellen bij 37 ° C gedurende een week tot confluent. Wijzig het kweekmedium twee keer per week.

2. Celdifferentiatie Voorafgaand aan Stretch-veroorzaakte letsel

1. Verander het kweekmedium van de cellen met differentiatie medium (DMEM dat 1% serum-gestript foetaal kalfsserum (ssFCS), 50 U / ml penicilline / streptomycine).
2. Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 24 uur.

3. Stretch-veroorzaakte letsel van endotheelcellen

1. Schakel de celschade controller apparaat.
2. Stel de vertraging tot 50 msec.
3. Stel de regelaar druk tot 15 psi en druk op de trekker een paar keer totdat het geregistreerde piekdruk wordt stabiel.
4. Stel de drukregelaar op de gewenste waarde. Gebruik tabel 1 als leidraad voor het genereren van verschillende gradaties van stretch letsel.
5. Plaats de 6-well flexibele bodem kweekplaat (57,75 cm ²⁾ in de houder lade. Zorg ervoor dat het goed staat ingesteld op de juiste goed formaat (dwz grote goed).
6. Plaats de stekker van de adapter stevig over de put. Houd de stekker stevig vast met een hand terwijl de andere hand duwt de trekker.
7. Noteer de piekdruk gegenereerd.
8. Onmiddellijk zette de plaat terug in de 37 ° C incubator voor de gewenste lengte van de tijd of onmiddellijk te gebruiken voor het slagen experimenten of evaluatie.

4. Beoordeling van Stretch Letsel door Dye Opname Assay

1. Onmiddellijk nadat de cellen waren strgeëtst (stap 3.7), voeg 30 ul van een 1 mg / ml oplossing van de levensvatbaarheid vlek, dat fungeert als een marker cytotoxiciteit (gelieve zie aanvullende tabel van materialen en apparatuur) om de celkweek medium (Let op: 10 ul van de kleurstof oplossing wordt gebruikt voor elk ml celkweekmedium).
2. Na toevoeging van de kleurstof aan de cellen onmiddellijk bekijken onder een fluorescentiemicroscoop.

5. Beoordeling van Stretch Letsel door lactaatdehydrogenase (LDH) Releasedatum

1. Onmiddellijk na het strekken van de cellen (stap 3.7), verwijder 200 pi celkweekmedium uit de put. Doe hetzelfde voor elk tijdstip na het letsel dat u wilt opnemen in uw onderzoek van LDH-afgifte (dwz bv 30 min, 1 uur, 2 uur, enz.)
2. Centrifugeer het celkweekmedium in de hoogste stand van een microcentrifuge gedurende 5 minuten om alle celresten te verwijderen. Verwijder de bovenstaande vloeistof en gebruik dit voor de volgende stappen.
3. Zodra je have afgewerkt stap 5.1 en de nodige monsters u zou willen hebben uit de diverse tijdstippen dat u wilt onderzoeken, lyseren van de cellen met behulp van de lysisoplossing opgenomen in het LDH assay kit (zie aanvullende tabel van materialen en apparatuur) hebben genomen.
4. Plaats 100 pl van het testmedium in de assay kitto elk putje van een 96-wells plaat die in de kit.
5. Plaats 100 pi van het celvrije celkweekmedium in twee parallelle putjes van een 96-wells plaat in de testkit.
6. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
7. Lees de absorptie bij 492 nm.

Resultaten

Cellen gekweekt op collageen I geprecoat 6-well flexibele bodem cultuur platen (57,75 cm ²⁾ werden onderworpen aan verschillende mate van stretch letsel met behulp van de cel brancard apparaat. Na het onderwerpen van de cellen aan schade werden ze onder de microscoop onderzocht de effecten van door strekking geïnduceerd letsel aan celmorfologie. Er werd waargenomen dat een grotere mate van rek werd op de cellen een grotere cel verstoring kan ook worden waargenomen (figuur 1). Zoals getoond in figuur 1A, controlecellen die niet werden onderworpen aan schade verschijnen regelmatig gevormde cerebrovasculaire endotheelcellen (CEND) zonder vermelding van cel zwelling of vervalst. Toen stretch schade werd aangebracht (Figuren 1B-D), kan vervorming worden waargenomen onder de lichtmicroscoop. Na het rekken van de cellen ernstig met een piek druk tussen 3,5-4,5 psi, de CEND cellen bleek sterk teruggetrokken, opgezwollen en misvormd met niet staat intercellulaire ruimten. Bovendien opname van levensvatbaarheid kleuring (100 nM eindconcentratie) ook naarmate de mate van rek schade werd verhoogd (Figuur 2). De levensvatbaarheid vlek die een kleurstof impermeant om gezonde cellen die permeant bij de plasmamembraan integriteit van cellen in het gedrang komt. De kleurstof werd uitgesloten van de meeste van de controle cellen, dus slechts een paar van de cellen werden gekleurd (Figuur 2A) in vergelijking met gestrekte cellen (Figuren 2B-D). Meer cellen fluoresceren groen met een verhoogde mate van stretch letsel.

Als een biochemische marker van letsel, vrijkomen van lactaat dehydrogenase (LDH) enzym ook werd onderzocht volgens de instructies van de fabrikant. Figuur 3 laat zien dat een toenemende cel stretch letsel veroorzaakt toenemende LDH-afgifte.

928/50928fig1.jpg "width =" 500px "/>
Figuur 1. Lichtmicroscopie onderzoek van normale versus beschadigde cellen. (A) Normaal ongerekte samenvloeiing celmonolaag istightly verpakt en langwerpig. Wanneer cellen werden uitgerekt door een piekdruk puls 1.8-2.0 psi (bijv. een lage rek) zij lijken minder compact, zijn aangegeven met pijlen (B). Wanneer de cellen matig werden verwond met een 2,5-3,0 piekdruk pols, een aantal van hen verscheen gezwollen en misvormd (C). De cellen worden teruggetrokken met ernstige strook 3.5-4.5 psi, zoals aangegeven door pijl (D). 100X vergroting. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 2. FluorEscence microscopisch onderzoek van normale versus beschadigde cellen Cellen behandeld met levensvatbaarheid vlek 2 uur na het letsel A: controle uitgerekte cellen BD: uitgerekte cellen (B - laag, C - matig, D - ernstig).... 100X vergroting. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 3. Lactaat dehydrogenase (LDH) vrijgave enzym in de supernatant na rek verwonding. LDH vrij in het cultuurmedium werd gemeten op verschillende tijdsintervallen na rek geïnduceerde verwonding. LDH werd uitgedrukt als percentage van de totale LDH losmaakbare (LDH in media plus cellen). Waarden zijn gemiddelden ± SEM. De n voor elk tijdstip is 5, behalve voor de 0 uur value onder zware traject waar n = 3. LDH afgifte uit cellen die waren blootgesteld aan lage en strekt niet verschilde niet significant van die van controles en gerekte van elkaar. Cellen die ernstig werden uitgerekt bezit een aanzienlijk grotere hoeveelheid LDH in vergelijking met alle andere monsters, behalve voor de matig gestrekt monster bij 1 uur. (P <0,05, Een factor ANOVA, Holm-Sidak methode). Klik hier voor grotere afbeelding .

Tabel 1. Leidraad voor het genereren van verschillende gradaties van stretch letsel.

Regulator Pressure	Peak Pressure	Mate van letsel
15 psi	1.2-1.5 psi
20-25 psi	1,8-2,0 psi	Laag
30-35 psi	2,5-3,0 psi	Matig
40-50 psi	3.5-4.5 psi	Zwaar
60 psi	4,8-6,0 psi	> Ernstige

Discussie

De effecten van mechanische schade in vitro bestudeerd en methoden zijn vastgesteld voor astrocyten, neuronen, gliacellen en endotheelcellen ^{8, 9, 22.} Er is echter tot op heden in vitro model van stretch schade in gekweekte endotheelcellen hersenen nog niet bekend. Cellulaire modellen trauma waardevolle voordelen boven dierlijke modellen omdat de mechanische omgeving van de cellen nauwkeurig kan worden geregeld ^6. Daarom moet een in vitro model voor trauma door stretch letsel met gekweekte endotheliale hersencellen die als model van de bloed-hersen barrière (BBB) ​​zoals wat ons protocol stelt kan nuttig blijken.

Dit protocol maakt gebruik van CEND cellen, een gevestigde BBB model in ons laboratorium. Daar-hersenbarrière wordt vaak gedocumenteerd in patiënten TBI en TBI wordt vaak gekoppeld aan de verstoring van de BBB die kan leiden tot oedeemvorming ^{23, 24,} de methode presHier teerde kunnen specifiek worden gebruikt BBB studies uitvoeren met betrekking tot TBI.

In dit model is het belangrijk om te zorgen hoeveel mate van rek wordt schade aan de cellen toegediend. Voorzover de cellen geblesseerd elk geval, en met welke hoeveelheid druk wordt toegepast, de mate van verwonding die invloed kunnen endotheelcellen veel verschillen sterk van andere celtypen. Endotheelcellen zijn beter bestand tegen schade dan rekken astrocyten of gemengde gliacellen ^9. Bovendien zijn ze sneller herstellen na beschadiging in vergelijking met de andere celtypen. Daarom is voor de hersenen endotheelcellen, vooral CEND cellen grotere hoeveelheid rek schade nodig is om een ​​hoge mate van letsel veroorzaken. Men kan de gewenste mate van letsel bereikt door toepassing van de overeenkomstige druk in tabel 1. Voor CEND cellen echter ernstig letsel heeft de voorkeur vanwege hun weerstand te belasten. De LDH assays uitgevoerd toondedat de mate van rek toeneemt, meer LDH wordt uitgescheiden in het supernatant. In tegenstelling tot de cellen die waren een lage hoeveelheid rek schade geproduceerde LDH in een hoeveelheid gelijk aan cellen te controleren. Zoals in het protocol, moet men ervoor zorgen dat de juiste hoeveelheid van het medium wordt gebruikt aangezien een toename of afname van de hoeveelheid medium kan leiden tot verschillen in de piekdruk aangebracht op de putjes. Bijvoorbeeld, een putje met 5 ml vloeistof toont een piekdruk in het gemiddelde van 4,0 psi terwijl een lege put registreert gemiddeld 3,8 psi bij 45 psi druk wordt uitgeoefend. Daarom is het het beste om de trigger meerdere malen duwen een controleputje dat de piekdruk die worden gegenereerd overeenkomt met de gewenste hoeveelheid.

In onze experimenten gebruikten we een levensvatbaarheid kleuring om het effect van rek op de permeabiliteit van het celmembraan te bepalen. De optiek van de flexibele bodem cultuur borden we gebruiken kunnen wij view de gekleurde cellen direct onder de microscoop. Echter, wanneer men wil immunolabel studies uit te voeren direct na de stretch-letsel, kunnen problemen ontstaan. Ten eerste kan de grootte en dikte van de plaat een probleem met sommige microscoop uitkijkplatforms vormen. Ten tweede, kan de optiek van het flexibele membraan van de put een belemmering voor bezichtiging duidelijk zijn.

Ondanks de bovengenoemde beperkingen, maar de procedure kan worden toegepast als een model van in vitro mechanische beschadigingen van de BBB. Traumatisch hersenletsel (TBI) bestaat uit twee componenten, namelijk, ischemie en trauma. Ischemie kan optreden als een secundaire schade na TBI in gevallen wanneer een ernstig bloedverlies resulteert in lage bloeddruk of als gevolg van zwelling van de hersenen beperkt zuurstoftoevoer naar de hersenen. Het wordt beschouwd als een vertraagde-mechanische schade die opeenvolgende pathologische processen begint op het moment van letsel ^25. Het optreden van een hypoxiefter ernstig traumatisch hersenletsel is gebruikelijk ^26. Zuurstof glucosedeprivatie (OGD) is de methode die momenteel wordt gebruikt om het model ischemie in vitro. Zo, het onderwerpen van cellen aan OGD als secundaire belediging voor de cellen na rek kan de incidentie van TBI gevolgd door ischemie na te bootsen. Vandaar onze huidige verbetering in vitro model van TBI en patroon zo dicht mogelijk een echte TBI zoals het in vivo, in de toekomst zullen we ook gebruik OGD in combinatie met stretch letsel.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Cell Injury Controller II	Custom Design and Fabrication, Virginia, USA
Bioflex Culture Plate - Collagen Type I	Flexcell, Dunn Labortechnik	BF - 3001C
Dulbecco’s gemodificeerd Eagle’s medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796
Fetaal Kalfs Serum (FCS)	PAA Laboratories	A15110-1333	eindconcentratie 10%, hitte-geïnactiveerd (30 min bij 56 °C)
L-glutamine	Biochrom AG	K0282	Opslag: ≤ -15 °C
MEM Vitamine	Biochrom AG	K0373	Opslag: ≤ -15 °C
Na-pyruvaat	Biochrom AG	L0473
Niet-essentiële aminozuren (NEA)	Biochrom AG	K0293	Opslag bij 4 °C
Penicilline/Streptomycine	Biochrom AG	A2212	Opslag: ≤ -15 °C
Fetaal Kalfs Serum, houtskool gestrept (ssFCS)	Life Technologies	12676-011
Trypsine-EDTA oplossing	PAA Laboratories	L11-004	Opslag: ≤ -15 °C
Image-iT DEAD Green	Life Technologies	I10291	Opslag: ≤ -15 °C, beschermd tegen licht
Cytotoxiciteit Detectie Kit PLUS (LDH)	Roche	4744926001	Opslag: ≤ -15 °C