Hier beschrijven we een procedure om virale complexen in vloeistof met nanometerresolutie in beeld te brengen met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Ter plaatse TEM van biologische assemblages in vloeistof
* These authors contributed equally
In dit artikel
Erratum-melding
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Samenvatting
Samenvatting
Onderzoekers gebruiken regelmatig Transmission Electron Microscopes (TEMs) om biologische entiteiten te onderzoeken en nieuwe materialen te beoordelen. Hier beschrijven we een extra toepassing voor deze instrumenten- het bekijken van virale assemblages in een vloeibare omgeving. Deze spannende en nieuwe methode voor het visualiseren van biologische structuren maakt gebruik van een recent ontwikkelde op microfluïdische basis gebaseerde monsterhouder. Ons videoartikel laat zien hoe u een microfluïdische houder kunt monteren en gebruiken om vloeibare monsters binnen een TEM in beeld te brengen. In het bijzonder gebruiken we simian rotavirus dubbellaagse deeltjes (DMP's) als ons modelsysteem. We beschrijven ook stappen om het oppervlak van de vloeistofkamer te coaten met affiniteitsbiofilms die DMP's aan het kijkvenster vastklappen. Dit stelt ons in staat om assemblages in beeld te brengen op een manier die geschikt is voor 3D-structuurbepaling. Zo presenteren we een eerste glimp van subvirale deeltjes in een inheemse vloeibare omgeving.
Inleiding
Een gemeenschappelijk doel van biologen en ingenieurs is om de innerlijke werking van moleculaire machines te begrijpen. Transmissie elektronenmicroscopen (TEM's) zijn ideale instrumenten om deze ingewikkelde details te visualiseren bij bijna-atomaire resolutie1-2. Om het hoogvacuümsysteem van een TEM in stand te houden , zijn biologische monsters doorgaans ingebed in dunne films van glasachtig ijs3, suikers4, zware metaalzouten5, of een combinatie daarvan6. Als gevolg hiervan kunnen afbeeldingen van ingesloten exemplaren slechts beperkte momentopnamen van dynamische processen onthullen.
Vroege pogingen om biologische monsters gehydrateerd in vloeibare omgevingskamers te behouden, werden uitgevoerd door Parsons en collega's met behulp van differentiële pompfasen. Elektronendiffractiepatronen van niet-aangetaste catalasekristallen werden met succes geregistreerd tot een resolutie van 3 Å in een gehydrateerde toestand7-8. Bovendien kunnen fase-gescheiden lipidedomeinen worden onderzocht in gehydrateerde membranen van menselijke erytrocyten9-10. Beweging veroorzaakt door diffusievloeistof en zijn interferentie met de elektronenbundel resulteerde echter in ernstig resolutieverlies en verdere experimenten met biologische monsters werden tot voor kort niet geprobeerd.
Nieuw ontwikkelde microfluïdische monsterhouders zijn geïntroduceerd die halfgeleidermicrochips gebruiken om een microgeschaalde milieukamer te vormen. Deze apparaten kunnen monsters in vloeistof bewaren terwijl ze in eenTEM-kolom 11-12worden geplaatst. Deze technische doorbraak in TEM-beeldvorming heeft onderzoekers in staat gesteld om voor het eerst progressieve gebeurtenissen op moleculair niveau13te bekijken. We verwijzen naar deze nieuwe modaliteit als "in situ moleculaire microscopie" omdat experimenten nu "binnen" deEM-kolom 14-15kunnen worden uitgevoerd. Het algemene doel van deze methode is om biologische assemblages in vloeistof te beelderen om hun dynamische gedrag bij nanometerresolutie te observeren. De reden achter de ontwikkelde techniek is het registreren van real-time waarnemingen en het onderzoeken van nieuwe eigenschappen van biologische machines in oplossing. Deze methodologie breidt het gebruik van TEM's uit voor bredere doeleinden in de cellulaire en moleculaire biologie12-16.
In het huidige videoartikel presenteren we een uitgebreid protocol om een in de handel verkrijgde microfluïdische monsterhouder te assembleren en te gebruiken. Deze gespecialiseerde houders maken gebruik van siliciumnitride microchips geproduceerd met geïntegreerde afstandhouders om een vloeistofkamer te vormen die minuscule hoeveelheden oplossing omsluit. Dunne, transparante ramen zijn geëtst in de microchips voor beeldvormingsdoeleinden12. We demonstreren het juiste gebruik van een microfluïdische houder om simian rotavirus dubbellaagse deeltjes (DLL's) in vloeistof te onderzoeken met behulp van een TEM. Om ervoor te zorgen dat biologische assemblages, zoals DMP's, niet snel over grote afstanden diffuus worden tijdens de beeldvorming, gebruiken we de Affinity Capture-benadering om ze aan het oppervlak van de microfluïdische kamer te vast temaken 16. Deze moleculaire opnamestap heeft een groot voordeel ten opzichte van alternatieve technieken voor het weergeven van biologische monsters in vloeistof, omdat het de verwerving van beelden mogelijk maakt die zullen worden gebruikt voor downstream verwerkingsroutines. Deze opnamestap die wordt gebruikt in combinatie met microfluïdische beeldvorming is uniek voor onze procedures17. Lezers die structurele biologietoepassingen gebruiken met TEM of microfluïdische beeldvormingskamers kunnen het gebruik van affiniteitsopnametechnieken overwegen wanneer dynamische observaties op moleculair niveau het einddoel zijn.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Affiniteitsopnameapparaten voorbereiden16
- Reinig de siliciumnitride E-chips door ze gedurende 2 minuten in 15 ml aceton te incuberen, gevolgd door 15 ml methanol gedurende 2 minuten (figuur 1A). Laat chips drogen onder laminaire luchtstroom.
- Incubeer de gedroogde chips op een verwarmde roerplaat (zonder roeren) gedurende 1,5 uur bij 150 °C en laat ze vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur voor gebruik.
- Gebruik Hamilton spuiten om lipidemengsels samen te stellen in kleine glazen buisjes om 25% chloroform, 55% DLPC (1,2-dilauroyl-fosfocholine) in chloroform (1 mg/ml) en 20% Ni-NTA lipide (1,2-dioleoyl-iminodiazijnzuur-succinyl-nikkelzout) in chloroform (1 mg/ml) te bevatten voor een totaal volume van 4 mg/ml.
- Breng een 1 μl aliquot van het mengsel aan over elke druppel Milli-Q water van 15 μl op een stuk Parafilm in een vochtige petrischaal (figuur 1B). Incubeer monsters minstens 60 minuten op ijs.
2. Leg macromoleculen vast17
- Plaats een E-chip met een geïntegreerde afstandsstuk van 150 nm bovenop een monolaagmonster en incubeer gedurende 1 min (figuur 1C).
- Til de chip voorzichtig van het monster af en voeg een 3 μl aliquot his-tagged Protein A. Incubate toe gedurende 1 min bij kamertemperatuur (Figuur 1D).
- Vlek de overtollige druppel weg met Whatman #1 filterpapier en voeg onmiddellijk een 3 μl aliquot antilichaamoplossing toe. Incubeer gedurende 1 min bij kamertemperatuur.
- Verwijder de overtollige oplossing met een Hamilton-spuit en voeg onmiddellijk een 1 μl aliquot rotavirus DLPs (0,1 mg/ml) toe in bufferoplossing met 50 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 en 10 mM CaCl2. Incubeer minstens 2 minuten bij kamertemperatuur. De bereiding van DMP 's is eerder beschreven18.
3. Monteer de microfluïdische kamer en laad de in situ monsterhouder
- Plaats de natte E-chip met het virale monster in de punt van de microfluïdische monsterhouder. Gloei een tweede platte E-chip gedurende 1 minuut en laad vervolgens bovenop de spacerchip(afbeelding 2, panelen 1-5).
- Als alternatief, om het contrast van biologische macromoleculen te verhogen, kan zware metaalvlek(bijv. 0,2% uranylformaat) worden toegevoegd aan natte monsters voordat de tweede E-chip op het natte monster wordt geplaatst. De E-chip die het monster bevat, moet echter worden gewassen met Milli-Q-water voordat het contrastreagens wordt toegevoegd.
- Sandwich het geheel samen tot een afgedichte behuizing, mechanisch op zijn plaats gehouden in de houder door 3 messing schroeven(afbeelding 2,panelen 6-8).
- Na montage wordt de punt van de houder met behulp van een turbogepompt drooggemaal naar10 -6 Torr gepompt voordat de houder in de TEM wordt geplaatst.
4. Beeldvorming in vloeistof met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop
- Laad de in situ monsterhouder in een Transmission Electron Microscope (FEI Company) uitgerust met een LaB6 filament en werkt bij 120 kV.
- Schakel de TEM-gloeidraad in en stel de eucentrische hoogte van het microscoopstadium ten opzichte van het monster in door de wiebelfunctie te gebruiken om het monster van -15° naar +15° heen en weer in de kolom te kantelen. Deze procedure past het stadium in de z-richting aan om rekening te houden met de juiste dikte van de vloeistofkamer. Deze stap zorgt er ook voor dat een nauwkeurige vergroting wordt gebruikt bij het opnemen van afbeeldingen.
- Neem eerst afbeeldingen op langs de randen en in de hoekgebieden van de microfluïdische kamer. Deze gebieden bevatten meestal de dunste oplossing. Neem beelden op van specimens onder lage dosisomstandigheden (1-3 elektronen/Å2) met behulp van een CCD-camera. Gebruik nominale vergrotingen van 6.000X - 30.000X.
- Bepaal de juiste defocuswaarde door scherp te stellen aan de rand van de vloeistofkamer. Gebruik een waarde van -1,5 μm om afbeeldingen op te nemen met een vergroting van 30.000 x. Als er een dikke oplossing wordt aangetroffen of als er geen contrastmiddel wordt gebruikt in het monsterpreparaat, gebruik dan hogere defocuswaarden in het bereik van -2 tot -4 μm.
- Om ervoor te zorgen dat de oplossing zich tijdens de experimenten in de microfluïdische kamer bevindt, richt u de elektronenbundel totdat de bellen in de vloeistof in het apparaat worden gevormd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Representatieve afbeeldingen van DMP's in vloeistof met behulp van E-chips die gloeien (figuur 3A) tonen minder DMP's in een bepaald kijkgebied, vermoedelijk als gevolg van diffusie, in vergelijking met DMP's die zijn verrijkt op Affinity Capture-apparaten (Figuur 3B). De toevoeging van uranyl formate in de beeldvormingskamer verbetert het contrast van het monster en daarmee de zichtbaarheid van individuele DLL's in oplossing(figuur 3C, bovenpaneel). Een beter contrast m...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In ons gepresenteerde werk gebruikten we de affiniteitsregistratiebenadering om tether rotavirus DLL's tetheren naar een microfluïdisch platform. Dit maakte in situ beeldvorming van macromoleculaire complexen in een vloeibare micro-omgeving mogelijk. De vangstbenadering is belangrijk met betrekking tot andere microfluïdische beeldvormingstechnieken omdat het biologische exemplaren lokaliseert naar het beeldvormingsvenster om grote diffusieve problemen te ontkrachten die zich voordoen tijdens het ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteur, Madeline J. Dukes, is een werknemer van Protochips, Inc.
Dankbetuigingen
De auteurs erkennen Dr. Michael J. Friedlander, directeur van het Virginia Tech Carilion Research Institute voor het aanmoedigen van onze onderzoeksinspanningen. Dit project werd ondersteund door ontwikkelingsfondsen aan S.M.M en D.F.K. en gedeeltelijk door het Nano-Bio initiatief van het Institute for Critical Technology and Applied Science van Virginia Tech.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| E-chips, spacer chip | Protochips, Inc. | EPB-52TBD | 400 μm x 50 μm venster |
| E-chip, top chip | Protochips, Inc. | EPT-45W | 400 μm x 50 μm venster |
| Ni-NTA lipid | Avanti Polar Lipids | 790404P | Poedervorm |
| DLPC (12:0) lipid | Avanti Polar Lipids | 850335P | Poedervorm |
| Volumetrische kolven | Fisher Scientific | 20-812A; 20-812C | 1 ml; 5 ml |
| Hamilton spuiten | Hamilton Co. | 80300, 80400 | 1-10 μl; 1-25 μl |
| Whatman #1 filterpapier | Whatman | 1001 090 | 100 stuks, 90 mm |
| Glazen Petri schotels | Corning | 70165-101 | 100 mm x 15 mm |
| Glazen Pasteur pipetten | VWR | 14673-010 | 14673-010 |
| Glazen kweekbuisjes | VWR | 47729-566 | 6 mm x 50 mm |
| Aceton | Fisher Scientific | A11-1 | 1 L |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 L |
| Chloroform | Electron Microcopy Sciences | 12550 | 100 ml |
| His-getagd Proteïne A | Abcam, Inc. | ab52953 | 10 mg |
| Milli-Q watersysteem | EMD Millipore Corp. | Z00QSV001 | Ultrazuiver water |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | 500 g |
| Uitrusting | |||
| Poseidon In situ monsterhouder | Protochips, Inc. | FEI compatibel | |
| FEI Spirit BioTwin TEM | FEI Co. | 120 kV | |
| Eagle 2k HS CCD-camera | FEI Co. | 10 Å/pixel bemonstering bij 30.000X | |
| Gatan 655 Dry pompstation | Gatan, Inc. | Pomp houder tip tot 10-6 bereik | |
| PELCO easiGlow, ontlaadseenheid | Ted Pella, Inc. | Negatieve polariteitsmodus | |
| Isotemp verwarmde roerplaat | Fisher Scientific | Verwarmen tot 150 ºC gedurende 1,5 uur |
Referenties
- Zhou, Z. H. Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).
- Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Subunit interactions in bovine papillomavirus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6298-6303 (2010).
- Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988).
- Unwin, P. N., Henderson, R. Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens. J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).
- Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R. Cryo-negative staining. Micron. 29, 145-160 (1998).
- Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186, 407-414 (1974).
- Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects. Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184, 77-78 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).
- Ring, E. A., de Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).
- Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).
- Peckys, D. B., de Jonge, N. Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).
- Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. Transmission electron microscopy with a liquid flow cell. J. Microsc. 242, 117-123 (2011).
- Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).
- Gilmore, B. L., et al. Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere. Lab Chip. 13, 216-219 (2013).
- Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. Purification and characterization of bovine rotavirus cores. J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).
- Frank, J., et al. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).
- Zhang, X., et al. Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).
- Scheres, S. H. A Bayesian view on cryo-EM structure determination. J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).
- Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification. J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Erratum
Formal Correction: Erratum: In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid
Posted by JoVE Editors on 10/10/2024. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/50936
