Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Onderzoeken Receptor-ligand systemen van de Cellulosome met AFM-gebaseerde Single-molecule Force Spectroscopie

7.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50950

⸱

20 december 2013

 ,  ,  , 
1Lehrstuhl für Angewandte Physik and Center for Nanoscience, Ludwig-Maximilians-Universität

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Cellulosomen zijn multi-enzymcomplexen die zijn ontworpen voor het verteren van cellulose. AFM-gebaseerde SMFS werd gebruikt om de mechanische eigenschappen en vouwconfiguratie van cellulosome-geassocieerde eiwitassemblages te bestuderen. We presenteren een complete workflow voor eiwit-immobilisatie, dataverzameling en data-analyse om de interacties van individuele receptor-ligandcomplexen te bestuderen die betrokken zijn bij cellulosome-assemblage.

Samenvatting

Cellulosomen zijn discrete multi-enzymcomplexen die worden gebruikt door een deel van anaërobe bacteriën en schimmels om lignocellulosische substraten te verteren. De assemblage van de enzymen op het niet-katalytische scaffold-eiwit wordt gereguleerd door interacties tussen een familie van verwante receptor-ligandparen, bestaande uit interacterende cohesie- en dockerine-modules. De extreem sterke binding tussen cohesie- en dockerine-modules resulteert in dissociatieconstanten in het bereik van lage picomolar tot nanomolar, wat nauwkeurige off-rate metingen met conventionele bulkmethoden kan belemmeren. Enkelmolecuulkrachtspectroscopie (SMFS) met de atoomkrachtmicroscoop meet het antwoord van individuele biomoleculen op kracht en is, in tegenstelling tot andere methoden voor manipulatie van enkele moleculen ( i.e. optische pincetten), optimaal voor het bestuderen van hoge-affiniteit receptor-ligandinteracties vanwege zijn vermogen om het hoge-krachtregime (>120 pN) te onderzoeken. Hier presenteren we ons volledige protocol voor het bestuderen van cellulosome eiwitassemblages op het niveau van enkele moleculen. Met behulp van een eiwittopologie afgeleid van het native cellulosome, werkten we met enzym-dockerine en koolhydraatbindingsmodule-cohesie (CBM-cohesie) fusie-eiwitten, elk met een toegankelijke vrije thiolgroep op een geëngend cysteïneresidu. We presenteren ons protocol voor plaatsspecifieke oppervlakte-immobilisatie, samen met onze meet- en data-analyseprocedure voor het verkrijgen van gedetailleerde bindingsparameters voor het hoog-affiniteit complex. We demonstreren hoe single subdomein ontvouwing krachten, complexe scheuringskrachten, kinetische off-rates en potentiële breedtes van de bindingsput worden gekwantificeerd. De succesvolle toepassing van deze methoden bij het karakteriseren van de cohesie-dockerine interactie verantwoordelijk voor de assemblage van multidomein cellulolytische complexen wordt verder beschreven.

Inleiding

Cellulosomen zijn grote multi-enzymcomplexen die zichtbaar zijn op het oppervlak van anaërobe cellulytische bacteriën (bijv. C. thermocellum) die zijn geëvolueerd om plantencelbewonde lignocellulose efficiënt te depolymeriseren tot oplosbare oligosachariden1. Een centraal kenmerk van cellulosomen is de hoogwaardige cohesin-dockerin interactie. In het meest prominente paradigma wordt een sterk geconserveerd type I dockerin module van 60-75 aminozuren weergegeven aan het C-terminale uiteinde van de verschillende bacteriële enzymen. Het dockerin module dirigeert de assemblage van synergetische combinaties van enzymen op het niet-katalytische scaffold-eiwit ('scaffoldin'), dat bestaat uit een polyproteïne van cohesine domeinen die specifiek zijn voor het type I dockerin module. Op hogere niveaus kan de architectuur van cellulosomen zeer complex worden, waarbij alternatieve cohesine-dockerin paren (bijv. type II, type III) worden geïncorporeerd die de structuren aan het celoppervlak verankeren en de assemblage van vertakkingsstructuren met meerdere scaffoldinen mogelijk maken2. De verschillende cohesine-dockerin typen, ondanks gerelateerde structuren, vertonen differentiële bindingsspecificiteit, wat kruisreactiviteit onderdrukt met onbedoelde scaffoldinen of componenten van andere cellulosome-producerende bacteriesoorten. Terwijl bio-informatica benaderingen met succes duizenden unieke cellulosomale componenten op genetisch niveau hebben geïdentificeerd, zijn er relatief weinig bekende eiwitstructuren, en de mechanismen die werkzaam zijn bij de bepaling van de cohesin-dockerin specificiteit blijven een actief onderzoeksgebied binnen de structurele biologie.

Sinds de uitvinding van de atoomkrachtmicroscoop (AFM) door Binnig et al.3, zijn er verschillende operationele modi van de AFM ontwikkeld en continu verbeterd, waaronder non-contact beeldvorming, oscillatiemodus beeldvorming4, en enkele molecuulkrachtspectroscopie (SMFS)5,6. SMFS is uitgegroeid tot een veelgebruikt techniek om individuele eiwitten7-11, nucleïnezuren12-15, en synthetische polymeren16-19 rechtstreeks te onderzoeken. In een typische SMFS-experiment om receptor-ligand binding te onderzoeken20,21, is een AFM cantilever-tip gemodificeerd met een van de bindpartners, terwijl een vlakke glasoppervlak gemodificeerd is met de complementaire bindpartner. De gemodificeerde cantilever wordt dan in contact gebracht met het oppervlak waardoor de partners kunnen binden. De basis van de cantilever wordt vervolgens met constante snelheid teruggetrokken en de kracht wordt gemeten met behulp van de optische hefbomen-uitwijkingsmethode. De resulterende kracht-afstand data-traces vertonen zaagtand-achtige pieken als binding is tot stand gekomen. In gevallen waar de bindpartners zijn gefuseerd met meerdere eiwitdomeinen, kan elke piek in de kracht-afstand trace worden gecorreleerd aan het ontvouwen van een enkel eiwitdomein of gevouwen subdomein, terwijl de laatste piek overeenkomt met het breken van de eiwitbindingsinterface. De specifieke posities van de kracht-bestendige elementen kunnen worden gebruikt als een vingerafdruk om de verschillende eiwitdomeinen van belang te identificeren. Deze methode kan worden gebruikt om belangrijke aminozuren te ondervragen die betrokken zijn bij eiwitvouwing en stabilisatie. Er zijn veel modellen in de literatuur gerapporteerd om het karakteristieke kracht-extensiegedrag dat in SMFS-experimenten wordt waargenomen, te behandelen. De meest gebruikte modellen zijn het vrij gekoppelde kettingmodel (FJC) model22, het wormachtige kettingmodel (WLC) model18,23-25, en het vrij roterende kettingmodel (FRC) model25,26.

In ons eerdere werk11, hebben we enkele molecuulkrachtspectroscopie gebruikt om de interactie van cohesine en dockerin modules te onderzoeken. Hier presenteren we een experimenteel protocol voor glasoppervlak en cantilever functionelering met enzym-dockerin en CBM-cohesine-eiwitconstructen. We presenteren ook een AFM-gebaseerd SMFS-protocol inclusief data-acquisitie en analyseprocedures. Het beschreven protocol kan gemakkelijk worden gegeneraliseerd naar andere moleculaire systemen, en zou bijzonder nuttig blijken te zijn voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in hoogwaardige receptor-ligandparen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Een schema van de trekkingsgeometrie die in dit werk is gebruikt om de cohesine-dockerine-interactie te onderzoeken, wordt getoond in Figuur 1A. Het hier beschreven protocol voor eiwitimmobilisatie voor de functionalisering van de cantilever en het dekglas is een aangepaste versie van de eerder gepubliceerde procedure27. De eiwitten werden tot expressie gebracht vanuit plasmidvectoren in E. coli met behulp van conventionele methoden. De eiwitten werden ontworpen met een oplosmiddel-toegankelijke thiolgroep, die in combinatie met maleïmidechemie werd gebruikt om het eiwit via een stabiele thioetherbinding aan het dekglasoppervlak en de cantilever te verankeren. De gemodificeerde cysteïneresiduen in zowel de CBM-cohesine- als de xylanase-dockerine-fusie-eiwitten waren gelokaliseerd aan de N-terminale zijde van de eiwitten, verwijderd van het cohesine-dockerine-bindingsinterface11. Een gedetailleerd overzicht van de chemische binding die is toegepast bij de eiwitimmobilisatie wordt getoond in Figuur 1B.

1. Monstervoorbereiding

  1. Buffers
    1. Bereid Tris-gebufferde zoutoplossing aangevuld met calcium (TBS) voor: 25 mM TRIS, 75 mM NaCl, 1 mM CaCl2, pH 7,2
    2. Bereid natriumboraatbuffer: 50 mM Na2B4O7, pH 8,5
      Het processtroomdiagram met de stappen voor monsterpreparatie is weergegeven in Figuur 2.
      Bij het hanteren van cantilevers en dekglasjes worden zelfsluitende pincetten aanbevolen.
  2. Aminosilanisering van het dekglas (ongeveer 1,5 uur)
    1. Plaats het dekglas (24 mm diameter, 0,5 mm dikte) in een PTFE-houder.
    2. Soniciseer het dekglas in 1:1 ethanol : ultrapuur water (v/v) gedurende 15 min.
    3. Spoel het dekglas af met ultrapuur water.
    4. Plaats het dekglas gedurende 30 min in piranha-oplossing (1:1 H2SO4 (geconcentreerd) : H2O2 (30%) (v/v)) en spoel daarna grondig af met ultrapuur water. Droog het dekglas onder een zachte stroom N2. Let op: piranha-oplossing is extreem corrosief. Oog- en huidbescherming zijn vereist.
    5. Dompel het dekglas onder in 45:5:1 ethanol : ultrapuur water : 3-aminopropyl dimethyl ethoxysilaan (v/v). Plaats dit gedurende 60 min op een shaker bij RT (ongeveer 50 rpm).
    6. Dompel het dekglas opeenvolgend onder in ethanol en ultrapuur water (elk 2x). Droog het dekglas onder een zachte stroom N2.
    7. Bak het dekglas in een oven (80 °C gedurende 30 min).
    8. Gesilaniseerde dekglasjes kunnen tot 6 weken onder argon worden bewaard.
  3. Aminosilanisering van cantilevers (ongeveer 1,5 uur)
    OPMERKING: Het gepresenteerde protocol voor tip-functionalisatie is geschikt voor silicium cantilever-tips.
    1. Plaats de cantilevers op een schoon glazen objectglas. Behandel deze gedurende 15 min met UV-ozon.
    2. Dompel de cantilevers gedurende 3 min onder in 1:1 ethanol : 3-aminopropyl dimethyl ethoxysilaan (v/v) met een katalytische hoeveelheid (0,25%, (v/v)) ultrapuur water.
    3. Spoel de cantilevers onder voorzichtig roeren opeenvolgend gedurende 60 sec af in bekerglazen met tolueen, ethanol en ultrapuur water. Droog de cantilevers tussen de spoelstappen door voorzichtig op filterpapier.
    4. Plaats de levers op een schoon glazen objectglas en bak deze (80 °C gedurende 30 min).
  4. Proteïne-disulfide-reductie (ongeveer 3 uur)
    Alle oplossingen moeten zo worden bereid dat er ongeveer 30 µl verdunde proteïne per cantilever en 20 µl verdunde proteïne per dekglasje wordt verkregen. Proteïne-oplossingen moeten worden gemengd met Tris(2-carboxyethyl)fosfine (TCEP) disulfide-reducerende gel in een verhouding van 1:2 (v/v).
    1. Bereid aliquoten van TCEP disulfide-reducerende beads in microtubes. Het wordt aanbevolen om micropipet-tips met een schaar door te knippen om de opening te verbreden bij het pipetteren van de TCEP-bead-suspensie.
    2. Spoel de TCEP-bead-suspensie met 1 ml TBS-buffer en centrifugeer bij 850 rcf gedurende 3 min.
    3. Verwijder en verwijder het supernatant voorzichtig met een micropipet.
    4. Herhaal stappen 1.4.2-1.4.3 2x.
    5. Voeg geconcentreerde proteïne-oplossing (1-10 mg/ml) toe aan de TCEP-beads (1:2 proteïne : TCEP-bead-suspensie (v/v)) en meng voorzichtig door te roeren met een micropipet-tip. Vermijd het introduceren van luchtbellen.
    6. Plaats het mengsel van proteïne/TCEP-bead-suspensie gedurende 2,5 uur op een rotator.
  5. PEGylering van dekglasjes en cantilevers (ongeveer 1,5 uur)
    1. Week voor modificatie met NHS-PEG-maleïmide-linkers de aminosilaniseerde cantilevers en dekglasjes gedurende 45 min in natriumboraatbuffer (pH 8,5) om de primaire aminegroepen op het oppervlak te deprotoneren.
    2. Zorg ervoor dat het NHS-PEG-maleïmide-poeder is opgewarmd tot RT voordat de dop wordt geopend en de juiste hoeveelheid voor een 25 mM oplossing wordt afgewogen. Ongebruikt NHS-PEG-maleïmide moet onder argon bij -20 °C worden bewaard. Er is ongeveer 30 µl polymeeroplossing per cantilever en 90 µl per 2 dekglasjes (als sandwich) nodig.
    3. Voeg na het afwegen van de 5 kDa NHS-PEG-maleïmide natriumboraatbuffer toe en vortex tot een 25 mM oplossing is verkregen.
      Opmerking: De oplossing moet zo snel mogelijk worden gebruikt vanwege de extreem korte halfwaardetijd van NHS bij pH 8,5. Het vortexen en overbrengen van de vloeistof naar de cantilevers/dekglasjes moet binnen 1-2 min worden voltooid.
    4. Incubeer de cantilevers in druppels van 30 µl NHS-PEG-maleïmide-oplossing in een Petrischaal. Plaats voor de dekglasjes 90 µl NHS-PEG-maleïmide-oplossing op één dekglasje en plaats een tweede dekglasje erbovenop, zodat een sandwich van dekglasjes ontstaat met de NHS-PEG-maleïmide-oplossing ertussen.
    5. Incubeer de cantilevers/dekglasjes met de NHS-PEG-maleïmide-oplossing in een waterverzadigde atmosfeer bij RT gedurende 1 uur.
  6. Proteïne-conjugatie (ongeveer 2 uur)
    Kritisch: Minimaliseer de blootstelling van PEGylereerde cantilevers en dekglasjes aan lucht.
    1. Centrifugeer de TCEP-bead/gereduceerde proteïne-oplossingen bij 100 rcf gedurende 1 min en verzamel het supernatant.
    2. Verdun de proteïne-oplossing met TBS. Streef naar een proteïneconcentratie tijdens de oppervlakteconjugatie in een bereik van 0,5-2 mg/ml. Zet de gereduceerde en verdunde proteïne-oplossingen enkele minuten apart terwijl de cantilevers en dekglasjes worden afgespoeld.
    3. Spoel de cantilevers en dekglasjes af in drie opeenvolgende bekerglazen met ultrapuur water.
    4. Verwijder voorzichtig resterende vloeistof van de dekglasjes door de randen voorzichtig tegen filterpapier te houden onder een zachte stroom N2. Verwijder voorzichtig resterende vloeistof van de cantilevers door ze tegen filterpapier te houden. Breng de verdunde proteïne-oplossing onmiddellijk aan.
    5. Monteer de dekglasjes in een geschikte monsterhouder die compatibel is met het AFM-instrument.
    6. Incubeer de PEGylereerde dekglasjes en cantilevers met de respectievelijke verdunde proteïne-oplossingen bij RT gedurende 1-2 uur.
    7. Spoel de cantilevers in drie opeenvolgende bekerglazen met TBS om ongebonden proteïnen te verwijderen. Spoel de dekglasjes minstens 10x af met een pipet.
    8. Bewaar de cantilevers en dekglasjes in TBS voorafgaand aan de meting.

2. Gegevensverwerving

In dit werk werd een op maat gebouwde AFM28 gebruikt, aangestuurd door een MFP-3D AFM-controller van Asylum Research met speciaal geschreven Igor Pro-software. De uitbuiging van de cantilever wordt gemeten via de optische straalafbuigingsmethode29. De hier beschreven protocollen voor monstervoorbereiding en data-analyse zijn toepasbaar ongeacht het exacte gebruikte AFM-model. Het AFM-model moet echter geschikt zijn voor metingen in vloeistoffen en een bereikbaar snelheidstraject op de z-piezo ondersteunen van ongeveer 200-5.000 nm/sec.

  1. Monteer de gefunctionaliseerde cantilever en het glasoppervlak op de AFM. Tijdens de gehele procedure moet het oppervlak bedekt blijven met buffer. Minimaliseer bij het monteren van de cantilever de blootstelling aan lucht. Laat het systeem na een correcte afstelling van de laserstraal ten minste 30 min equilibreren om drift-effecten te verminderen en stel indien nodig opnieuw af.
  2. Registreer een thermisch ruisspectrum met de cantilever ver verwijderd van het oppervlak, d.w.z. in afwezigheid van dempingseffecten.
  3. Gebruik een minimaal invasieve methode, zoals de akoestische benadering, om het oppervlak te vinden zonder de tip van de cantilever vóór de meting te beschadigen. Benader indien mogelijk het oppervlak handmatig met de cantilever en gebruik een koptelefoon om naar de thermische ruis op de ruwe deflectie-output van de AFM-controller te luisteren. Zodra de cantilever het oppervlak nadert, is een duidelijke verandering in geluid hoorbaar.
    Opmerking: De tip van de cantilever moet zich nu binnen 2-5 µm van het oppervlak bevinden. De aard van de geluidsverandering is afhankelijk van de gebruikte cantilever. De resonantiefrequentie van de in dit werk gebruikte cantilever is ongeveer 25 kHz in water, wat boven het menselijk hoorbare bereik ligt. Door dempingseffecten nabij het oppervlak verschuift de resonantie naar lagere frequenties, waardoor de resonantie van de cantilever in het hoorbare bereik komt. Hierdoor wordt een schijnbare toename in frequentie en geluidsintensiteit waargenomen.
    In gevallen waarin een audio-output van het deflectiesignaal niet beschikbaar is, kan het oppervlak worden benaderd met de z-piezo terwijl een actieve feedback op het deflectiesignaal is ingeschakeld. Zodra het deflectiesignaal met een gedefinieerde hoeveelheid toeneemt door indentatie van het oppervlak, wordt de benadering gestopt.
  4. Bepaal de inverse optische hefboomsensitiviteit (InvOLS), die de verplaatsingsafstand van de tip (in nm) per volt deflectiesignaal vertegenwoordigt. Doe dit door het oppervlak te indenteren met de tip van de cantilever. Een ingestelde deflectiespanning die overeenkomt met een verplaatsing van de cantilevertip van ongeveer 3 nm wordt aanbevolen.
  5. Bepaal de veerconstante van de cantilever door een responsfunctie van een eenvoudige harmonische oscillator te fitten op het thermisch ruisspectrum, overeenkomstig het equipartitietheorema30,31.
  6. Initialiseer een experimentele routine. Voor dit werk is de volgende set meetparameters gebruikt: benaderingssnelheid: 3.000 nm/sec; indentatiekracht: 180 pN; verblijftijd op het oppervlak: 10 msec; retractiesnelheden: 0,2, 0,7, 2,0, 5,0 µm/sec met bemonsteringssnelheden van respectievelijk 2.000, 5.000, 15.000, 20.000 Hz; retractieafstand: 500 nm.
    Opmerking: De bemonsteringssnelheid mag niet hoger worden ingesteld dan 10 punten/nm om oversampling te voorkomen en om de datagrootte redelijk te houden.
  7. Activeer na elke kracht-afstandscurve de x- en y-piezopodia om bij elke kracht-afstandscurve een nieuwe locatie op het oppervlak aan de cantilever bloot te stellen. Met deze techniek wordt tijdens langdurige metingen een groter gebied van het dekglasoppervlak bemonsterd.
  8. Gebruik tijdens langdurige metingen periodieke hernulstelling van de deflectietrap (d.w.z. fotodiodepositie) en de hoogte van het z-piezochassis voor het geval het deflectiesignaal buiten het bereik drift of het contact met het oppervlak verloren gaat.
  9. Voer na voltooiing van de meetreeks nogmaals een InvOLS-meting uit met een aanzienlijk hogere indentatiekracht dan vóór de metingen is gebruikt om een nauwkeurigere InvOLS-waarde te verkrijgen.
  10. Registreer nog een thermisch ruisspectrum ver verwijderd van het oppervlak. Bepaal de veerconstante aan het einde van de experimentele reeks.

3. Data-analyse

Het stroomschema in Figuur 3 illustreert het proces van data-analyse. Voer alle datamanipulaties uit met een geschikt softwarepakket zoals Igor Pro of MATLAB. Zet eerst het ruwe signaal van de detector om in eenheden van kracht, en corrigeer voor offset en drift. Gebruik vervolgens modellen van biopolymeerelasticiteit om energiebarrières in de ontvouwingspaden te lokaliseren en eiwitsubdomeinen te identificeren. Ten slotte worden de kinetische en energetische parameters van de receptor-ligandinteractie bepaald.

  1. Eenheidconversie en datacorrecties
    1. Vermenigvuldig het ruwe deflectiesignaal (volt) met de InvOLS (nm/volt) en de veerconstante (pN/nm) om de detectorspanning om te rekenen naar eenheden van kracht.
    2. Kalibreer de data zodanig dat de onbelaste cantilever een krachtwaarde van nul pN heeft door eerst de gemiddelde krachtwaarden van de laatste 10% van de kracht-afstandscurve (verkregen op de grootste afstand van het oppervlak) te berekenen en vervolgens dit gemiddelde van alle krachtwaarden in de datatrace af te trekken.
    3. Verschuif elke trace in de x-richting zodat het eerste snijpunt met de afstandas plaatsvindt op een afstand van 0 nm.
    4. De InvOLS is afhankelijk van de positie van de laserspot op de cantilever. Zelfs kleine hoeveelheden drift in het optische uitleessysteem kunnen merkbare veranderingen in de InvOLS veroorzaken wanneer de voetafdruk van de cantilever vergelijkbaar is met de grootte van de laserspot. Corrigeer hiervoor door de ruis op het deflectiesignaal bij nul kracht te analyseren. Uitgaande van constante omgevingsomstandigheden is de ruis op het deflectiesignaal direct proportioneel aan de InvOLS.
      1. Meet de root mean square (RMS) deflectiewaarde (ruisniveau bij nul kracht) van de laatste 10% van elke kracht-afstandscurve.
      2. Zet de ruis uit tegen het curve-nummer en pas een geschikte fit toe. Normaal gesproken werkt een exponentiële fit in de vorm van Exponentiële vervalformule, N(n_i)=N_0 * e^(-kn_i), wiskundige weergave. het best, waarbij N de ruis is, ni het curve-nummer, en N0 en k fitparameters zijn. Een lineaire fit kan ook passend zijn voor bepaalde datasets.
      3. Bepaal een schalingsfactor (SF) voor elke curve:

        Vergelijking 1:
        statische evenwichtsvoorschrift; (SF)=(N₀e^(-knᵢ)+C)/(N₀e^(-knₓ)+C); wiskundige formule
        waarbij ni het curve-nummer is, nf het uiteindelijke curve-nummer, en C een offset.
      4. Deel vervolgens alle krachtwaarden in elke individuele curve door de schalingsfactor. Deze procedure schaalt elke curve volgens de verhouding van de RMS-ruiswaarde van de huidige curve tot de RMS-ruiswaarde van de laatste trace die direct voorafgaand aan de InvOLS-meting is verkregen.
      5. Voer een deflectiecorrectie uit om de afstandsas (z) om te zetten naar moleculaire extensie (z*). Hiermee wordt rekening gehouden met de buiging van de cantilever onder kracht, waardoor de afstand tussen de cantilever-tip en het monster kleiner wordt dan de waarde die wordt gerapporteerd door de positie van de z-piëzosensor.

        Vergelijking 2:
        Statisch evenwichtsvoorschrift, z* = z - F/k, formule; fysische berekeningen, krachtanalyse
        Waarbij z de gemeten z-sensorpositie is, F de kracht die op de cantilever werkt en k de veerconstante.
  2. Contourlengte-analyse
    De contourlengte van een eiwit is de maximale uitgerekte lengte van de polypeptideketen. De vouwingsstaat van een eiwit verwijst naar de geometrie en de afstand van uiteinde tot uiteinde, bepaald door de secundaire en tertiaire structuur. De contourlengte van een eiwit is direct gerelateerd aan zijn vouwingsstaat9,25,32. De positie van specifieke rupturen in kracht-extensietraces varieert sterk door de polydispersiteit van PEG-linkers, evenals externe parameters zoals temperatuur, buffereigenschappen en belastingsnelheden. Dit bemoeilijkt de directe data-analyse, maar kan worden overwonnen door kracht-extensiedata om te zetten naar de contourlengte-ruimte. Deze techniek maakt middeling over enorme datasets mogelijk en staat automatische patroonherkenning toe om karakteristieke ontvouwingsgebeurtenissen te identificeren. Het is daarom mogelijk om individuele krachttraces te sorteren afhankelijk van het type interactie dat wordt vertoond. De volgende eerder beschreven procedure25 wordt gebruikt om kracht-extensiedata om te zetten naar de contourlengte-ruimte.
    1. Het oplossen van het WLC-model (Vergelijking 3)23 voor de contourlengte L bij een vaste persistentielengte p resulteert in Vergelijking 4, die de contourlengte L(x,u) verschaft. Hierbij is x de afstand en u=F*p/kBT, waarbij kB de constante van Boltzmann is en T de temperatuur. Alleen reële oplossingen kunnen worden overwogen. Aanvullende beperkingen zijn x, F>0, L>0, x>0;

      Vergelijking 3:
      Kracht-extensieformule, F(x,L), polymeerfysica-vergelijking, illustreert entropische elasticiteit.

      Vergelijking 4:
      Statisch evenwicht, L(x,u), complexe formule, educatief diagram, analytische expressie interpretatie.
      waarbij,
      Polynomische functie \( g(u) \) vergelijking, wiskundige analyse, symbolische berekening.
    2. Zet de getransformeerde datapunten uit in een plot van kracht versus contourlengte. Pas een krachdrempel van ongeveer 10 pN toe om ruis uit te sluiten. Aspecifieke interacties kunnen worden uitgesloten door een long-pass lengtefilter toe te passen. Stel een histogram van contourlengtes samen.
    3. Kruiscorreleer33 de verkregen histogrammen met een sjabloonhistogram en verschuif deze langs de x-as om te corrigeren voor PEG-polydispersiteit. Gebruik de resulterende correlatiewaarden om de gelijkenis van individuele datatraces te meten. Hierdoor kunnen datatraces worden gesorteerd in vooraf gedefinieerde klassen om verdere analyse te vereenvoudigen.
    4. Gebruik een soortgelijke techniek om repeterende kenmerken in een enkele trace te vinden via autocorrelatie, bijv. voor meervoudige Ig-domein ontvouwing.
    5. Sorteer traces handmatig om andere ontvouwingsgebeurtenissen te onderzoeken.
  3. Belastingsnelheidsanalyse
    Extraheer kinetische en energetische informatie over receptor-ligand dissociatie door geschikte modellen toe te passen op het krachtspectrum, d.w.z. de plot van ruptuurkracht versus ln(belastingsnelheid).
    1. Bepaal voor een gegeven treksnelheid de ruptuurkracht en de belastingsnelheid voor de ruptuurgebeurtenissen van belang:
      1. Voer een lineaire fit uit op een kracht-tijdtrace in de nabijheid van de betreffende ruptuurgebeurtenis. Bepaal de belastingsnelheid uit de helling van de lineaire fit naar de piek. Herhaal deze procedure voor elke trace die de betreffende ruptuurgebeurtenis vertoont.
      2. Bepaal de meest waarschijnlijke ruptuurkracht door een Gaussische fit toe te passen op een histogram van de ruptuurkrachten. Alternatieve fitfuncties zijn mogelijk.
      3. Bepaal de meest waarschijnlijke belastingsnelheid.
    2. Herhaal stappen 3.3.3.1 - 3.3.3.3 voor alle treksnelheden.
    3. Zet de meest waarschijnlijke ruptuurkrachten uit tegen de natuurlijke logaritme van de meest waarschijnlijke belastingsnelheden om het krachtspectrum te verkrijgen.
    4. Pas een geschikt theoretisch model toe op het krachtspectrum om kinetische en energetische parameters te extraheren (Figuur 4C). In veel gevallen kan het lineaire Bell-Evans-model20,34 worden gebruikt, wat goede schattingen oplevert voor koff, de dissociatiesnelheid in afwezigheid van kracht, en Dx, de afstand tot de transitietoestand langs de reactiecoördinaat, zoals getoond in Vergelijking 5.

      Vergelijking 5:
      statische krachtvergelijking ⟨F⟩, k_B T/Δx, formule-analyse voor thermische fluctuatie-experimenten

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We hebben de beschreven procedure gebruikt om een type I cohesine-dockerine-paar van C. thermocellum te onderzoeken. Na succesvolle binding van het cohesine-dockerine-paar vertoonden de geregistreerde kracht-afstandscurves karakteristieke piekpatronen. Een typische curve is weergegeven in Figuur 4a. Elke piek in de curve vertegenwoordigt de ontvouwing van één eiwit-subdomein, waarbij de laatste piek overeenkomt met de dissociatie van het receptor-ligandcomplex.

Voor h...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Om zinvolle gegevens te verkrijgen uit single molecule force spectroscopy experimenten, is het cruciaal om goed gedefinieerde en reproduceerbare trekgeometrieën te bereiken. Het hier gebruikte protocol resulteert in locatiespecifieke immobilisatie van eiwitcomplexen in een gedefinieerde trekgeometrie.

De cantilevers die in dit onderzoek werden gebruikt, werden gekozen vanwege hun krachtgevoeligheid en hoge resonantiefrequentie in water. Bovendien is de kleine tipkromming van ongeveer 10 nm voo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

De auteurs erkennen financiering van een gevorderde subsidie van de European Research Council toe aan Hermann Gaub. Michael A. Nash dankt graag de financiering van Society in Science - The Branco Weiss Fellowship programma. De auteurs danken Edward A. Bayer, Yoav Barak en Daniel B. Fried aan het Weizmann Institute of Science voor het genereus verstrekken van de eiwitten die in dit onderzoek zijn gebruikt. De auteurs danken Hermann E. Gaub, Elias M. Puchner en Stefan W. Stahl voor nuttige discussies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3-Aminopropyl dimethyl ethoxysilaneABCR GmbHAB110423
5 kDa NHS-PEG-maleimideRapp Polymer13 5000-65-35
TCEP Disulfide reducing gelThermo Scientific, Pierce77712www.thermoscientific.com/pierce
Tris(hydroxymethyl)aminomethane
BioLever mini silicon nitride cantileversOlympusBL-AC40TS-C2Soft batches
XYZ Piezoelectric actuatorsPhysik Instrumente GmbH
Infrared “broad spectrum” IR laserSuperlum
MFP-3D AFM ControllerAsylum Research
Igor Pro 6.31WavemetricsGegevensverzameling en -analyse
Natriumchloride
Calciumchloride
pH-meter
Natriumboraat
Pincet
DekglazenThermo Scientific, Menzel-Gläser24 mm diameter, 0,5 mm dikte
PTFE monsterhouderop maat gemaakt
Sonicator-bad
Ethanolanalysekwaliteit
Zwavelzuur (geconcentreerd)analysekwaliteit
Waterstofperoxide (30%)analysekwaliteit
Orbitaalschudder
Tolueenanalysekwaliteit
Filterpapier
Glazen plaatjes
Microbuisjes
Micropipetten
Centrifugegeschikt voor microbuisjes
Rotator
Petrischalen
Bekers
Optische microscoop

Referenties

  1. Bayer, E. A., Belaich, J. P., Shoham, Y., Lamed, R. The cellulosomes: Multienzyme machines for degradation of plant cell wall polysaccharides. Annu. Rev. Microbiol. 58, 521-554 (2004).
  2. Bayer, E. A., Lamed, R., White, B. A., Flint, H. J. From Cellulosomes to Cellulosomics. Chem. Rec. 8 (6), 364-377 (2008).
  3. Binnig, G., Quate, C. F. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56 (9), 930-933 (1986).
  4. Garcı́a, R., Perez, R. Dynamic atomic force microscopy methods. Surf. Sci. Rep. 47 (6), 197-301 (2002).
  5. Engel, A., Müller, D. J. Observing single biomolecules at work with the atomic force microscope. Nat. Struct. Biol. 7 (9), 715-718 (2000).
  6. Li, H., Cao, Y. Protein Mechanics: From Single Molecules to Functional Biomaterials. Acc. Chem. Res. 43 (10), 1331-1341 (2010).
  7. Florin, E. -L., Moy, V. T., Gaub, H. E. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264 (5157), 415-417 (1994).
  8. Oberhauser, A., Hansma, P., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (2), 468-472 (2001).
  9. Puchner, E. M., Gaub, H. E. Force and function: probing proteins with AFM-based force spectroscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 19 (5), 605-614 (2009).
  10. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J., Gaub, H. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Sci. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  11. Stahl, S. W., Nash, M. A., et al. Single-molecule dissection of the high-affinity cohesin–dockerin complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (50), 20431-20436 (2012).
  12. Boland, T., Ratner, B. D. Direct measurement of hydrogen bonding in DNA nucleotide bases by atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5297-5301 (1995).
  13. Morfill, J., Kühner, F., Blank, K., Lugmaier, R. A., Sedlmair, J., Gaub, H. E. B-S Transition in Short Oligonucleotides. Biophys. J. 93 (7), 2400-2409 (2007).
  14. Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nat. Struct. Biol. 6 (4), 346-350 (1999).
  15. Severin, P. M. D., Zou, X., Gaub, H. E., Schulten, K. Cytosine methylation alters DNA mechanical properties. Nucleic Acids Res. 39 (20), 8740-8751 (2011).
  16. Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor. Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).
  17. Giannotti, M. I., Vancso, G. J. Interrogation of Single Synthetic Polymer Chains and Polysaccharides by AFM-Based Force Spectroscopy. Chem. Phys. Chem. 8 (16), 2290-2307 (2007).
  18. Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Phys. Rev. Lett. 94 (4), 10-1103 (2005).
  19. Nash, M. A., Gaub, H. E. Single-Molecule Adhesion of a Stimuli-Responsive Oligo(ethylene glycol) Copolymer to Gold. ACS Nano. 6 (12), 10735-10742 (2012).
  20. Merkel, R., Nassoy, P., Leung, A., Ritchie, K., Evans, E. Energy landscapes of receptor-ligand bonds explored with dynamic force spectroscopy. Nature. 397 (6714), 50-53 (1999).
  21. Morfill, J., Neumann, J., et al. Force-based Analysis of Multidimensional Energy Landscapes: Application of Dynamic Force Spectroscopy and Steered Molecular Dynamics Simulations to an Antibody Fragment–Peptide. Complex. J. Mol. Biol. 381 (5), 1253-1266 (2008).
  22. Ortiz, C., Hadziioannou, G. Entropic Elasticity of Single Polymer Chains of Poly(methacrylic acid) Measured by Atomic Force Microscopy. Macromolecules. 32 (3), 780-787 (1999).
  23. Bustamante, C., Marko, J. F., Siggia, E. D., Smith, F. Entropic Elasticity of l-phage DNA. Science. 265 (5178), 1599-1600 (1994).
  24. Marko, J. F., Siggia, E. D. Stretching DNA. Macromolecules. 28 (26), 8759-8770 (1995).
  25. Puchner, E. M., Franzen, G., Gautel, M., Gaub, H. E. Comparing Proteins by Their Unfolding Pattern. Biophys. J. 95 (1), 426-434 (2008).
  26. Livadaru, L., Netz, R. R., Kreuzer, H. J. Stretching Response of Discrete Semiflexible Polymers. Macromolecules. 36 (10), 3732-3744 (2003).
  27. Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. Thiol-based, site-specific and covalent immobilization of biomolecules for single-molecule experiments. Nat. Protoc. 5 (6), 975-985 (2010).
  28. Gumpp, H., Stahl, S. W., Strackharn, M., Puchner, E. M., Gaub, H. E. Ultrastable combined atomic force and total internal fluorescence microscope. Rev. Sci. Instrum. 80 (6), 063704 (2009).
  29. Gustafsson, M. G. L., Clarke, J. Scanning force microscope springs optimized for optical-beam deflection and with tips made by controlled fracture. J. Appl. Phys. 76 (1), 172 (1994).
  30. Cook, S. M., Lang, K. M., Chynoweth, K. M., Wigton, M., Simmonds, R. W., Schäffer, T. E. Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants. Nanotechnology. 17 (9), 2135-2145 (2006).
  31. Proksch, R., Schäffer, T. E., Cleveland, J. P., Callahan, R. C., Viani, M. B. Finite optical spot size and position corrections in thermal spring constant calibration. Nanotechnology. 15 (9), 1344-1350 (2004).
  32. Ainavarapu, S. R. K., Brujic, J., et al. Contour Length and Refolding Rate of a Small Protein Controlled by Engineered Disulfide Bonds. Biophys. J. 92 (1), 225-233 (2007).
  33. Dietz, H., Rief, M. Detecting Molecular Fingerprints in Single Molecule Force Spectroscopy Using Pattern Recognition. Jap. J. Appl. Phys. 46, 5540-5542 (2007).
  34. Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophys. J. 72 (4), 1541-1555 (1997).
  35. Dietz, H., Rief, M. Protein structure by mechanical triangulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1244-1247 (2006).
  36. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Intrinsic Rates and Activation Free Energies from Single-Molecule Pulling Experiments. Phys. Rev. Lett. 96 (10), 108101 (2006).
  37. Friddle, R. W., Noy, A., De Yoreo, J. J. Interpreting the widespread nonlinear force spectra of intermolecular bonds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (34), 13573-13578 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

atoomkrachtmicroscopiecohesine dockerine interactieassemblage van cellulosomeneiwitontvouwingskrachtendynamisch krachtspectrumBell Evans modelsite specifieke immobilisatiereceptor ligandbindingkinetische off rates
Onderzoeken Receptor-ligand systemen van de Cellulosome met AFM-gebaseerde Single-molecule Force Spectroscopie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.