Generatie van lymfekliert-vetkussen-chimaeren voor de studie van de oorsprong van lymfekliert-stromacellen

Summary

Generatie van lymfeknoop-/vetcuilchimera's voor de studie van de oorsprong van lymfeknoopstromacellen wordt beschreven. De methode omvat de isolatie van lymfeklieren van pasgeboren muizen en embryonale vetkussens, de generatie van chimerische lymfeknoop-vetkussens en hun overdracht onder de niercapsule van een gastheermuis.

Abstract

Het stroma is een essentieel onderdeel van de structuur en functie van lymfeklieren. Er is echter weinig bekend over de oorsprong, de exacte cellulaire samenstelling en de mechanismen die de vorming ervan regelen. Lymfeklieren zijn altijd omhuld met vetweefsel en we hebben onlangs de belangrijkheid van deze relatie voor de vorming van lymfeklieron stroma aangetoond. Adipocyt-precursorcellen migreren tijdens de ontwikkeling van de lymfeklieren naar binnen en bij activering van de Lymphotoxin-b receptor schakelen ze adipogenese uit en differentiëren ze in lymfoïde stromale cellen (Bénézechet al.¹⁴). Op basis van het lymfoïde stromapotentieel van vetweefsel presenteren we een methode met behulp van een lymfeknood/vetkussen chimaer die het traceren van de lijn van lymfeknoodstroma-celprecursoren mogelijk maakt. We laten zien hoe pasgeboren lymfeklieren en EYFP⁺ embryonaal vetweefsel geïsoleerd kunnen worden en een LN/ EYFP⁺ vetkussen chimaer gemaakt kan worden. Na transfer onder de niercapsule van een gastheermuis, integreert de lymfeklieren lokale vetweefselprecursorcellen en voltooit zijn vorming. Afstammingsanalyse van EYFP⁺ vetkussencellen in de resulterende lymfeklieren kan worden uitgevoerd door middel van flow-cytometrische analyse van enzymatisch verteerde lymfeklieren of door immunofluorescentieanalyse van cryosecties van lymfeklieren. Door vetkussens van verschillende knockout muismodellen te gebruiken, zal deze methode een efficiënte manier bieden om de oorsprong van de verschillende lymfeklieron stroma-celpopulaties te analyseren.

Introduction

Lymfeklieren (LK) zijn belangrijke organen van het immuunsysteem, gelegen op strategische plaatsen in het lichaam, langs het lymfatische vaatstelsel. Ze maken filtratie van antigenen en pathogenen mogelijk en bieden een locatie voor antigeenpresentatie aan lymfocyten en inductie van adaptieve immuunresponsen. Het stroma, dat de basisstructuur van de LK vormt en de beweging van de verschillende hematopoëtische deelnemers van de adaptieve immuunrespons coördineert, is centraal voor de functie van deze organen. Verschillende populaties van stromacellen leveren essentiële en specifieke signalen voor de bewegingen, lokalisatie, overleving, proliferatie en rijping van de hematopoëtische component van het immuunsysteem^1-3. Stromacellen van volwassen LK vallen in drie categorieën: de bloed-endotheelcellen, de lymfatische endotheelcellen en fibroblasten. Deze drie categorieën omvatten heterogene populaties. De fibroblastische populaties bevatten fibroblastische reticulaire cellen (FRC), folliculaire dendritische cellen (FDC), marginale reticulaire cellen (MRC), terwijl de fibroblasten de capsule, het merg en andere cellen vormen die nog niet geïdentificeerd zijn^1-5. De oorsprong en de mechanismen die de rijping van de verschillende LK-stromacellenpopulaties regelen, zijn onduidelijk en het ontbreken van specifieke markers die de bestemmingsmapping van specifieke LK-stromacellenpopulaties mogelijk maken, maakt hun studie bijzonder moeilijk. Een volledig begrip van de ontwikkeling van LK-stromacellen is echter noodzakelijk voor het begrijpen van adaptieve immuunresponsen, de mechanismen die bijdragen aan tolerantie en ligt aan de basis van de ontwikkeling van kunstmatige LK.

Tot nu toe is de studie van de oorsprong en ontwikkeling van LK-stromacellen meestal beperkt gebleven tot de directe beoordeling van de ontwikkeling van LK bij embryo's en pasgeborenen bij wilde muizen en verschillende knockout-muizenstammen^6-9. Deze benaderingen worden beperkt door de embryonale en perinatale letaliteit van sommige muizenstammen met deleties in genen die belangrijk zijn voor de ontwikkeling van LK. Bovendien zijn sommige van de genen die essentieel zijn voor de ontwikkeling van lymfoïde weefsels ook betrokken bij een breed scala aan biologische processen, zoals het geval is voor RANK^10-11 of NF-κB2¹². Om deze problemen aan te pakken, is isolatie en transplantatie van embryonale LK's onder de niercapsule van een gastheermuis uitgevoerd^12-13. Deze techniek maakt bijvoorbeeld de overdracht van genetisch gemodificeerde embryonale LK's in een wildtype-omgeving mogelijk om orgaanontwikkeling en de rekrutering en organisatie van gastheercellen te beoordelen. Echter, de groei van embryonale LK's die onder de niercapsule van een volwassen gastheer zijn getransplanteerd, is gehinderd, waardoor het gebruik van deze techniek beperkt wordt.

LK's en vetafzettingen zijn anatomisch nauw verbonden en ze ontwikkelen zich gelijktijdig tijdens de embryogenese. We hebben onlangs aangetoond dat de associatie tussen LK en vetweefsel een cruciale rol speelt bij het leveren van stromacellen voor de LK's. In het bijzonder regelt de signaaltransductie via de LTβR het lot van adipocyte-precursorcellen door adipogenese te blokkeren en in plaats daarvan rijping naar een LK-stromacellenfenotype te bevorderen¹⁴. Hier beschrijven we een methode op basis van de generatie van LK-vetkussenchimeren die het traceren van vetweefsel-afgeleide cellen in de zich ontwikkelende LK mogelijk maakt. Deze methode zal nuttig zijn om de bijdrage van vetweefsel aan verschillende LK-stromacellenpopulaties te bepalen en in combinatie met het gebruik van weefsels van genetisch gemodificeerde muizenstammen, zal een beter begrip mogelijk maken van de mechanismen die de differentiatie van de verschillende LK-stromacellensubsets regelen.

Protocol

Muizen werden gefokt en onderhouden onder SPF-omstandigheden in de Biomedical Service Unit aan de Universiteit van Birmingham volgens de regelgeving van het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken en de lokale ethische commissie. Alle procedures die in dit protocol worden beschreven, vallen onder een projectlicentie die is goedgekeurd door zowel de lokale ethische commissie als het ministerie van Binnenlandse Zaken.

1. Isolatie van pasgeboren lymfeklieren

1. Offer de pasgeboren muizen door cervicale dislocatie.
2. Snijd het hoofd af en open het lichaam met een schaar vanaf de bovenkant van de thoracale regio tot de onderkant van de abdominale regio en verwijder voorzichtig alle viscera (hart, longen, lever, darm, nier, blaas) uit de buikholte.
3. Breng het lichaam over in een 90 mm petrischaal met RF10-medium (RPMI1640-medium aangevuld met 10% foetaal bovien serum, 100 U/ml penicilline, 100 mg/ml streptomycine en 2 mM L-glutamine). Vanaf deze stap zullen de weefsels onder steriele omstandigheden worden bewaard en in een weefselkweekkap worden behandeld.
4. Breng het lichaam over in een nieuwe 90 mm petrischaal met RF10.
5. Los onder de dissectiemicroscoop voorzichtig het peritoneum van de huid in de inguinale regio. De inguinale lymfeklier bevindt zich op het kruispunt van drie bloedvaten in de vetkussen.
6. Verwijder voorzichtig de lymfeklier. Zorg ervoor dat al het vetweefsel wordt verwijderd. Breng de lymfeklier over in een 50 mm petrischaal met RF10-medium. Houd de weefsels op ijs terwijl u doorgaat met de procedure.

2. Isolatie van E18.5-vetkussens

1. Om muizenembryo's op dag 18,5 van de zwangerschap (E18,5) te genereren, zet geplande zwangerschappen op door een vrouwtje en een mannetje per kooi een nacht lang te plaatsen. Scheid de muizen in de ochtend en controleer op vaginale pluggen (zwangerschapsdag E0,5).
   1. Euthaniseer de geplugde vrouwtjes op dag 18,5 van de zwangerschap door cervicale dislocatie.
   2. Verwijder de embryo's en plaats ze in een 90 mm petrischaal met RF10.
2. Vanaf deze stap moeten weefsels worden behandeld met behulp van steriele techniek in de weefselkweekkap. Onder de dissectiemicroscoop snijdt u het hoofd, opent u de embryo's met een schaar van de thoracale regio tot de onderkant van de abdominale regio en verwijdert u voorzichtig alle viscera (hart, longen, lever, darm, nier, blaas) uit de lichaamsholte.
3. Reinigt het lichaam van alle overgebleven viscerale weefsels en was het in PBS om alle bloedsporen te verwijderen die de dissectie moeilijker kunnen maken.
4. Breng de schone lichamen over in een nieuwe 90 mm petrischaal met RF10.
5. Los voorzichtig het peritoneum van de huid in de inguinale regio op. De inguinale lymfeklier bevindt zich op het kruispunt van drie bloedvaten in het vetkussen.
6. Verwijder voorzichtig de lymfeklier en gooi deze weg. Het is erg belangrijk om de lymfeklier volledig te verwijderen om ervoor te zorgen dat het vetkussen dat voor de chimera's wordt gebruikt niet wordt besmet met lymfoïde stromacellen.
7. Verwijder het inguinale vetkussen en breng het over in een 50 mm petrischaal met RF10-medium. Houd de weefsels op ijs terwijl u doorgaat met de procedure.

3. Generatie van de lymfeklier-vetkussenchimer

1. Bereid het in vitro orgaankweeksysteem¹⁵ voor.
   1. Bereiding van sponzen en filters: Dit kan van tevoren worden gedaan en sponzen en filters steriel worden opgeslagen in een petrischaal in de kweekkap.
      1. Snij de Vulkan Underwrap in stukken van 1-1,5 cm²
      2. Kook de sponzen 2 uur in gedistilleerd water.
      3. Laat de sponzen een paar uur drogen in de celkweekkap.
      4. Kook de filters gedurende 20 minuten.
      5. Laat de filters een paar uur drogen in de celkweekkap.
   2. Bereid DMEM-medium aangevuld met 10% foetaal bovien serum, 10 mM HEPES, 1x MEM Nonessential Amino Acid Solution, 50 mM 2-Mercaptoethanol, 100 U/ml penicilline, 100 mg/ml streptomycine en 2 mM L-Glutamine.
   3. Voeg 2 ml medium toe aan een 50 mm petrischaal.
   4. Plaats een spons op de bodem van de petrischaal. Bevochtig beide zijden van de spons door ze onder te dompelen in het medium.
   5. Plaats een filter bovenop de spons. Het filter bevindt zich op de vloeistof-lucht-interface.
2. Los onder de dissectiemicroscoop voorzichtig een pasgeboren lymfeklier los van een embryonaal vetkussen.
3. Plaats de lymfeklier-vetkussenchimer bovenop het filter.
4. Breng de petrischaal over in een rechthoekige plastic doos met een paar gaatjes in het deksel en bevat water op de bodem om vocht te garanderen.
5. Verzegel het deksel op de doos met plakband. Laat de twee gaatjes in het deksel open.
6. Breng de doos over naar een celkweekincubator bij 37 °C met 5% CO₂. Laat de doos 2 uur gelijkwaardig worden voordat u de gaatjes in het deksel afsluit met plakband.
7. Incubeer de weefsels gedurende ten minste 2 dagen om de lymfeklier toe te laten om zich aan het vetkussen te hechten en overdraagbaar te zijn onder de niercapsule.

4

Results

Drie weken na transplantatie wordt de LN/vetkussen-chimaer uit de nier teruggevonden. De chimaer lijkt nu erg veel op een normale LN in zijn eigen vetkussen en de LN is zichtbaar in het centrum van het vetweefsel (Figuur 1). Als de LN niet kan worden geïdentificeerd, is het mogelijk dat deze verloren is gegaan tijdens de transplantatie op de nier. Bij het beoordelen van de rol van genen die mogelijk belangrijk zijn voor de ontwikkeling van LN, kunnen de teruggevonden LN's erg klein blijven en moeilijker ...

Discussion

In dit artikel presenteerden we een methode om de bijdrage van adipositeceln voorlopercellen aan de ontwikkeling van LK's te meten en te kwantificeren, en twee technieken die de analyse van hun nakomelingen mogelijk maken. Het dissekeren van embryonale vetkussens en pasgeboren LK's is delicaat en vereist handmatige vaardigheden die worden opgedaan door veel oefening voorafgaand aan het genereren van de daadwerkelijke LK-vetkussenchimeren. Om de kwaliteit van de dissecties te controleren, kan flow-cytometrische analyse wo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Sigma	M3148
50 mm Sterilin Petri Dish	Appleton Woods	SC265
90 mm Sterilin Petri Dish	Appleton Woods	SC260
Adhesive slides	Surgipath	00202
Anti-mouse CD31 eFluor 450	eBioscience	48-0311
Anti-mouse CD4 Alexa 647	eBioscience	51-0041
Anti-mouse CD45 PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-0451
Anti-mouse IgM Rhodamine Red	Stratech	715-296-020-JIR
Anti-mouse Podoplanin PE/Cy7	Biolegend	127411
Anti-mouse Podoplanin purified	eBioscience	14-5381
Collagenase D	Roche	11088858001
DMEM Medium	Sigma	D5671
DNase I	Sigma	DN25-1G
Dumont #5 Forceps Inox Biologie	FST	11252-20	Extra fijne pincetten voor embryonale en pasgeboren dissecties
EDTA solution 0.5 M	Sigma	E7889
ERTR-7	Biogenesis
Fetal bovine serum	Sigma	F9665
Hardened fine iris scissors straight 11 cm	FST	14090-11	Kleine schaar voor dissectie
HEPES solution	Sigma	H0887
Isopore Membrane Filters 0.8 μm ATTP	Millipore	ATTPO 1300
L-Glutamine solution	Sigma	G7513
MEM Nonessential Amino Acid Solution (100x)	Sigma	M7145
O.C.T. Compound	Tissue-Tek	4583
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4458
Plastic box with lid	Watkins and Doncaster	E6052	Sandwichbox voor in vitro orgaancultuur. Boor twee gaten in het deksel om gasuitwisseling in de CO2-incubator mogelijk te maken.
RPMI 1640 Medium	Sigma	R0883
Sponges Vulkan Underwrap	Patterson Medical	004383
Stereomicroscope	Leica	LEICA MZ95	Dissectiemicroscoop met zoom
Thermomixer	Eppendorf	5436
Vectashield Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200