A Novel Driedimensionale Flow Kamer Device aan chemokine-gerichte extravasatie van Cellen doorgeven Studie onder Fysiologische stroomtoestanden

Samenvatting

De driedimensionale stroom kamer inrichting een nieuw In vitro Technologie voor de kwantitatieve en stapsgewijze evaluatie van de extravasatie cascade van circulerende cellen onder omstandigheden van fysiologische schuifspanning. Het apparaat vult dan ook een kritieke behoefte aan eenvoudige, preklinische en klinische studies van de cel migratie.

Samenvatting

Extravasatie van circulerende cellen uit de bloedbaan speelt een centrale rol in vele fysiologische en pathofysiologische processen, waaronder stamcellen homing en tumormetastase. De driedimensionale stroom kamer apparaat (hierna 3D-inrichting) is een nieuwe technologie die in vitro fysiologische schuifspanning nagebootst en kan elke stap van de cel extravasatie cascade te kwantificeren. De 3D-inrichting bestaat uit een bovenste compartiment, waarin de cellen van belang circuleren onder schuifspanning, en een onderste compartiment van statische putten die de chemoattractanten plaats bevatten. De twee compartimenten worden gescheiden door poreuze inzetstukken bedekt met een monolaag van endotheelcellen (EC). Een optionele tweede inzet met microenvironmental cellen van belang kan direct onder het EG-laag worden geplaatst. Een gasuitwisseling unit maakt de optimale CO _2-spanning worden onderhouden en biedt een toegangspunt om cellen of verbindingen tijdens het voegen of in te trekkenexperiment. De testcellen circuleren in het bovenste compartiment op de gewenste schuifspanning (debiet) gecontroleerd door een peristaltische pomp. Aan het einde van het experiment worden de circulerende en gemigreerde cellen verzameld voor verdere analyse. De 3D-apparaat kan worden gebruikt om mobiele rollen op en hechting aan EG onder schuifspanning transmigratie in reactie op chemokine gradiënten, shear stress, clustervorming en celoverleving onderzoeken. Bovendien, de optionele tweede inzetstuk het effect van overspraak tussen EG microenvironmental cellen worden onderzocht. De translationele toepassingen van de 3D-apparaat omvatten het testen van kandidaat-geneesmiddelen die zich richten cel migratie en het voorspellen van de in vivo gedrag van cellen na intraveneuze injectie. Zo kunnen de nieuwe 3D-inrichting een veelzijdig en goedkoop hulpmiddel om de moleculaire mechanismen die cellulaire extravasatie bemiddelen bestuderen.

Inleiding

Cel extravasatie is het proces waarbij circulerende cellen sluiten de bloedsomloop en is een essentieel onderdeel van veel fysiologische reacties in het lichaam. De werkwijze is ook belangrijk voor weefselregeneratie, bijvoorbeeld bij therapeutische cellen gemobiliseerd uit weefsels in het bloedvat (of intraveneus geïnjecteerd) migreren door het vaatstelsel en verlaat de circulatie plaatsen van schade of degeneratie. Extravasatie is een essentieel onderdeel van de pathogenese van vele ziekten, waaronder ontsteking, afstoting, autoimmuniteit en tumormetastase.

Extravasatie is een complex meerstapsproces dat de interactie van cellen met circulerende endotheelcellen (EC) onder omstandigheden van fysiologische stroming omvat. De werkwijze omvat (a) cel rollende, (b) stevige adhesie aan het luminale oppervlak van EC, en (c) transmigratie in de hele EG. Belangrijk is dat elke stap van de extravasatie cascade geregeld door een subset van cell type-specifieke en species-specifieke moleculen. Echter, de gedetailleerde moleculaire mechanismen die extravasatie van specifieke cel subsets regulering niet goed begrepen, vooral door de technische problemen bij recapituleert de in de bloedbaan. De nieuwe 3D hier beschreven inrichting is bedoeld om deze technische problemen overwinnen en proeven die uitgevoerd worden dat ons begrip van de biologie van celmigratie zal verbeteren.

De moleculen die cel migratie bemiddelen zijn belangrijke therapeutische doelwitten. Een gedetailleerd inzicht in de moleculaire gebeurtenissen die de migratie van specifieke celtypen te controleren zal helpen bij het identificeren van nieuwe targets voor de therapeutische bevordering of remming van extravasatie. Bijvoorbeeld, interventies die de migratie van therapeutische cellen (of afgeleid van volwassen, neonatale of uit foetaal weefsel) naar gebieden van schade of degeneratie versterken van groot nut in weefselregeneratie.Er is een groeiende belangstelling voor de in vitro productie van therapeutische cellen, waaronder cellen afkomstig van pluripotent bronnen, en ex vivo gemanipuleerde volwassen stamcellen (geëxpandeerd, genetisch gemanipuleerde en voorbehandeld met verschillende enzymen) ^1. Er is dus een behoefte aan nieuwe technologieën om de kwaliteit van de stamcellen te evalueren voordat ze worden gebruikt voor therapeutische doeleinden. Onder andere parameters, moeten de cellen in staat zijn het verkeer efficiënt te verlaten, omdat behandelingen multifocale aandoeningen kan intraveneuze toediening van de stamcellen ² nodig. Inderdaad, een van de huidige uitdagingen in de biologie van de stamcel is de extreem lage efficiëntie te overwinnen waarmee stamcellen huis naar sites van weefselschade ^3-6, met de nadruk op de noodzaak om dit hiaat in ons begrip van stamcellen migratie aan te pakken. Daarentegen strategieën blok celmigratie door gericht op specifieke homing molecules zou nuttig zijn voor de behandeling van in zijninflammatoire en auto-immuunziekten en metastatische kanker. Aldus begrip van de moleculaire mechanismen die de interactie tussen circulerende cellen en EC bemiddelen bij celmigratie en extravasatie translationeel geneeskunde en drug discovery alsmede fundamentele wetenschap relevant.

Er zijn momenteel een aantal methoden beschikbaar zijn voor verschillende aspecten van de cel migratie te bestuderen. Deze werkwijzen hebben tekortkomingen kunnen worden overwonnen met de nieuwe 3D-apparaat.

Dierlijke modellen:

Diermodellen, zoals immuungecompromitteerde muizen en genetisch gemanipuleerde muizen zijn nuttige hulpmiddelen zijn om de migratie van menselijke cellen in vivo. Echter, een belangrijk nadeel aan deze modellen is dat de menselijke cellen interageren slecht met adhesie moleculen aanwezig op de muis EG, voor een deel te wijten aan een soort-specifieke sequentie verschillen in veel celoppervlaktemoleculen. Zo is het gebruik van knaagdieren te bestuderenmenselijke cel migratie waarschijnlijk authentieke afspiegeling van de gebeurtenissen in het menselijk orgaan-specifieke vasculaire bedden. Bovendien, in vivo modellen zijn niet geschikt voor high-throughput screening van kandidaat-geneesmiddelen. De conventionele in vivo modellen gebruikt om cel homing studie geen onderscheid tussen de verschillende stappen van de extravasatie cascade, waardoor het moeilijk om nieuwe moleculen te identificeren homing en target. De opklaren aanpak ontwikkeld om deze behoefte en is informatief, maar deze techniek is zeer tijds-en arbeidsintensief ^7,8.

Statische transmigratie assays:

Transwell of Boyden-kamer assays maatregel cel migratie via een poreus membraan en worden veel gebruikt in de migratie studies. De assay heeft het voordeel dat het kan worden gebruikt om niet alleen celmotiliteit en cel-extracellulaire matrix (ECM) interacties te bestuderen, maar ook chemokine gemedieerde migratie van cellenover een EC monolaag gekweekt op het poreuze membranen. Helaas, het fenotype van de EG onder statische omstandigheden aanzienlijk verschillen van die onder fysiologische stroom ^9,10. Zo weet de chemotactische gebeurtenissen die zich voordoen in Transwell assays niet getrouw na te bootsen de interacties tussen migrerende cellen en EC onder shear stress. Bovendien is de "rollen" stap van de homing cascade, die een extra dimensie van selectiviteit verhoogt het algehele proces niet voorkomen in statische Transwell assays. Dus, terwijl deze technologie wel mogelijk kwantitatieve evaluatie van chemokine-gemedieerde celmigratie in de EC monolaag wordt beperkt door zijn onvermogen om de schuifspanning die de bloedstroom in vivo nabootst.

Assays onder schuifspanning:

Wandschuifspanning is bekend dat een belangrijke rol spelen in het reguleren van EG-functie ^9,10. Schuifkrachten induceren een snelle activering van signaal cascades, transcription factoren, en differentiële genexpressie in EC ^11,12. Deze informatie heeft geleid tot de ontwikkeling van de volgende generatie van adhesiebepalingen - parallelle laminaire stroming kamers en capillairen - bestuderen rollen en adhesie van cellen aan EG onder omstandigheden van schuifspanning ^7,13. De beperkende factor voor deze testen is dat ze kunnen meten alleen rollen en adhesie, maar maken geen onderscheid tussen een aanhanger cel die zou gaan om transmigreren en een hechtende cel die wordt 'opgepakt' op de EG-monolaag en zou niet transmigreren. Bovendien kunnen deze assays meten niet migratie van cellen naar een chemokine gradiënt.

Verschillende rapporten hebben beschreven het vermogen van hechtende cellen te kruipen onder een EG monolaag gegroeid op glasplaatjes onder omstandigheden van stroom ^14. De beperkingen van deze techniek kruipen zijn: het analyseert slechts een beperkt aantal cellen, het is niet kwantitatief, analyseert cel kruipen op de matrix en de cell oppervlak, maar niet de migratie naar een chemotactische gradiënt, en het staat niet toe dat de transmigrated cellen worden geïsoleerd. Ofschoon deze test heeft het voordeel van het toepassen afschuifspanning de EC monolaag, kan niet kwantificeren migratie van cellen naar een chemokine gradiënt.

De nieuwe 3D-technologie beschreven overwint veel van de tekortkomingen door het combineren afschuifkracht (bovenste compartiment) met een statische chemokine gradiënt (onderste vak) en maakt kwantitatieve evaluatie van elke stap van de cascade extravasatie (figuur 1). Het apparaat kan ook worden gebruikt om te onderzoeken hoe de overspraak tussen EC en de micro-omgeving van invloed op het vermogen van de EG tot extravasatie van circulerende cellen te ondersteunen. Het volgende protocol beschrijft de stap voor stap methode voor de 3D stromingskamer apparaat.

Protocol

1. Bereid de Upper en Lower insteekkaarten voor celgroei door collageen Coating

1. Bereken het aantal inserts nodig voor het experiment. Plaats elke insert in een aparte steriele petrischaal (35 x 10 mm) en steriliseren door bestraling (11 Gy).
2. Bereid de collageen oplossing voor het coaten van membranen: 50 ug / ml, 154 gl per insert (invoegen oppervlakte 1,54 ^cm2).
3. Plaats enkele druppels (~ 20 ul per druppel) van collageen-oplossing in een cirkel op het oppervlak van het inzetstuk membraan (laat niet de pipettip raak het oppervlak) en voeg vervolgens de rest van het monster zorgvuldig tot een grote druppel op de vormen membraanoppervlak. Zorg ervoor dat de collageen-oplossing blijft halfronde en niet weglopen van het membraanoppervlak.
4. Dek de petrischaal met een deksel en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een vlakke ondergrond.
5. Zuig het collageen-oplossing en een keer wassen het membraan door afdekken met 160 pi PBS.
6. Aspirate de PBS en plaats het deksel. Bij gebruik van dezelfde dag, plaatst u de petrischaal op een droge plaats bij kamertemperatuur. Anders, zet de schaal bij 4 ° C en gebruik het inzetstuk binnen 7 dagen.

2. Cultuur endotheelcellen aan de Boven-Inserts

1. Bereid EG suspensie in de gewenste kweekmedium. Zorg ervoor dat de levensvatbaarheid van de cellen is> 98% en meteen gebruiken.

Opmerking: Voor humane navelstreng EG (HUVEC), 4 x 10 ⁵ cellen in 160 pi per insert wordt gebruikt.

2. Neem de petrischalen met collageen gecoate inserts bereid in hoofdstuk 1, niet de inzetstukken van de gerechten niet te verwijderen. Plaats een aantal kleine druppels van de celsuspensie (ongeveer 20 ul per druppel) in een cirkel op het oppervlak van de collageen-gecoate membraan (laat niet de pipetpunt aanraken van het oppervlak) en voeg vervolgens voorzichtig de rest van de cel suspensie te vormen een grote druppel. Zorg ervoor dat de celsuspensie blijft hemis pherical en niet weglopen van het membraanoppervlak.
3. Plaats de deksels voorzichtig de schaaltjes in een 5% CO ₂ celkweek incubator en incubeer (zonder schudden) bij 37 ° C gedurende 30 minuten om de cellen te hechten aan het membraan.
4. Voorzichtig voeg 5 ml kweekmedium aan elke petrischaal te zorgen dat het inzetstuk blijft op de bodem van de schaal en wordt volledig door het medium. Plaats de deksels en zorgvuldig zet de gerechten terug in de incubator. De cellen te kweken bij 37 ° C geïncubeerd.
5. Gebruik dezelfde benadering van de tweede (optioneel) lager insert bereiden met cellen die de lokale micro-omgeving, die onder het inzetstuk met de EG-laag wordt geplaatst.

Opmerking: het onderste inzetstukken in de experimenten, worden de bovenste en onderste inzetstukken eerst met elkaar verbonden voordat de inserts in de 3D-(figuur 4B).

e "> 3. Zet de 3D-Flow Kamer Device

1. Vastschroeven de bovenste en onderste platen, de platen aansluiten op de gasuitwisseling apparaat middels slangen, plaatst de samengestelde inrichting in een schone plastic zak en steriliseer de zak en de inhoud van bestraling (11 Gy).
2. Verwijder een lade-plank uit de celkweek incubator, plaats in een steriele weefselkweek kap, spray met 70% ethanol, veeg, en dek de schaal met een grote steriele servet.
3. Plaats de bestraalde plastic zak in de kap, verwijdert u het apparaat uit de tas en leg ze op de steriele incubator lade. Sluit het apparaat aan op de peristaltische pomp met de slang voorzien. Programmeer de pomp voor een optimale snelheid van 0,2 ml / min.

Opmerking: Om de pomp te verbinden met het stopcontact, extrusie van de elektrische kabel door het gat in de achterkant van de incubator. Gebruik overvaller stekker rond het snoer en zorg ervoor dat het gat is luchtdicht.

4. Place 5-7 ml gewenste kweekmedium in een steriele 15 ml buis (de "inlaat").

4. Prime de 3D Flow Kamer Device

1. Ontkoppel de inlaat slang uit het stopcontact door aan het metalen naald uit de buis (gebruik maken van kleine steriele servetten om de steriliteit van de buis te houden). Gebruik de metalen naald verbonden met de buis als "inlaat" en de losgemaakte einde van de buis als een "outlet". Plaats de metalen naald inlaat in de 15 ml buis met de media; plaats de uitlaat in de lege 15 ml buis.
2. Zet de pomp, zodat de doorstroming wordt tegen de klok in en stel het debiet bij 0,2 ml / min. Laat de negatieve druk op het medium te trekken uit de 15 ml inlaatbuis in de slang en de pomp stoppen wanneer het medium het einde van de buis bereikt onmiddellijk voordat het aansluit op de inrichting (fig. 2 Stop nr. 1).
3. Bovenste en onderste platen van de inrichting. Verwijder voorzichtig de bovenste plaat en plaats 1500 - 1550 ul medium (ofwel alleen medium of plus de experimentele chemokines) in de onderste putten. Zorg ervoor dat het goed bevat voldoende medium tot een halve bol die ongeveer 1 bereikt vormen - 2 mm boven de onderste plaat.
4. Breng het zo voorbehandelde inzetstuk uit de petrischaal op de putjes van de onderste plaat met steriele pincet en zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden gevangen onder de inserts. Zuig elk medium dat op het oppervlak van de onderplaat te zorgen dat de plaat droog blijft weergegeven. Plaats de bovenplaat terug op de onderste plaat en sluit de platen met behulp van de schroeven.
5. Meteen zet de peristaltische pomp en laat medium te stromen door het 3D-apparaat. Verhoog het uitlaateinde van de inrichting en onderhouden van de kamer in deze positie tot belvorming in de ruimte tussen de platen te voorkomen.
6. Laat het medium naar de kamer en de slang aansluiten van de kamer naar de gasuitwisseling unit vullen. Stop de pomp onmiddellijk vóór het medium het gas e bereiktxchange unit (figuur 2; Stop # 2). Plaats 3 ml medium in de gasuitwisseling apparaat, zet de pomp, en laat de luchtbellen te ontsnappen via de gasuitwisseling eenheid. Verheffen de gasuitwisseling toestel om het medium om de slang de gasuitwisseling unit verlaat vullen en stopt de pomp wanneer het medium bereikt 2-3 cm voor het einde van de uitlaat buis (figuur 2, Stop # 3).
7. Sluit de inlaat metalen naald naar de uitgang met behulp van kleine steriele servetten. Herprogrammeren van de pomp zodat het medium stroomt in de tegenovergestelde richting (met de klok mee) in de richting van de gasuitwisseling eenheid en zorgen voor eventuele luchtbellen worden verwijderd zodra ze de gasuitwisseling eenheid te bereiken. Controleer dat er geen luchtbellen in het systeem.
8. Herprogrammeren van de pomp zodat het medium stroomt tegen de klok. Voeg 100 ul van de test celsuspensie aan de gasuitwisseling eenheid. Sluit het deksel van de gasuitwisseling apparaat, plaats de lade met het werkend systeem terug in de incubator, en laat de test cellen te circulate in de 3D-inrichting bij 37 ° C gedurende de gewenste tijd.

Opmerking: Reinig de elektrische snoer van de pomp met 70% ethanol en plaats deze in de incubator.

5. Beëindigen van de test en verzamelen Monsters voor Assay

1. Verwijder de lade met het werkende systeem van de incubator en plaats in de kap. Stop de pomp, maak de inlaat en uitlaat, en plaats de uiteinden in lege steriele 15 ml buizen.
2. Zet de pomp aan en verzamel de celsuspensie uit het systeem; plaats de celsuspensie op ijs, in voorkomend geval, tot gebruik.
3. Demonteer de kamer door de schroeven te verwijderen en op te tillen van de bovenplaat. Verwijder de inzetstukken uit de onderste plaat en overbrengen naar petrischalen.

Opmerking: De inzetstukken kunnen worden gekleurd om te visualiseren en te tellen cellen in situ (kristalviolet 0,05% in dH ₂ O) of trypsine aan de EC te verzamelen voor verderetesting.

4. Verwijder het medium en cellen uit de onderste putjes in en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 210 x g. Verwijder de bovenstaande vloeistof, wassen en resuspendeer de cellen naar wens en verwerken de cellen volgens de specifieke experimentele doelen (hieronder verder besproken).

Resultaten

De muizen beenmerg-afgeleide EC lijn STR-12 werd gekweekt op inzetstukken met 5 um poriën. De snelheid van EG groei werd gevolgd onder een microscoop en als de EC 100% confluent waren, werden de inserts in de putjes overgebracht in het onderste compartiment van de 3D-apparaat. Onmiddellijk voordat de inserts werden de putjes van het onderste compartiment gevuld met kweekmedium alleen (negatieve controle) of medium aangevuld met stromale cellen afgeleide factor-1 (SDF-1, 5 ng / ml en 50 ng / ml). Daarna werd de 3D apparaat gemonteerd en de kamer werd gevuld met medium volgens het protocol. De test cellen in het bovenste compartiment van het toestel te worden verspreid werden vers geoogste muizen beenmergcellen (3,5 x 10 ⁶ cellen per kamer). Een bepaald afschuifspanning van 0,8 dyn / cm ² werd door de peristaltische pompsnelheid op 0,2 ml / min toegepast. Het gehele werkend systeem werd in de 5% _CO2 incubator bij 37 ° C en cells mochten circuleren en interageren met de EG monolaag gedurende 4 uur. Aan het einde van deze periode werden de circulerende cellen verzameld, de kamer werd gedemonteerd en de inserts werden verwijderd zoals beschreven in het protocol. De transmigrated cellen werden geoogst uit de lagere putten, gewassen, opnieuw gesuspendeerd in vers medium en overgebracht naar methylcellulose culturen gesupplementeerd met hematopoëtische groeifactoren van kolonievormende cellen (CFC) test (figuur 3). Zoals verwacht, vonden we een significant hoger aantal GBV in de EC monolaag gemigreerd naar de wells die 50 ng / ml SDF-1 dan aan putjes bevattende 5 ng / ml SDF-1 of alleen medium.

Zoals eerder beschreven, geen van de huidige in vitro technieken voor celmigratie studie kunnen testen van het effect van de lokale micro-omgeving van het vermogen van EG extravasatie van migrerende cellen ondersteunen. Om te illustreren hoe dit met de 3D inrichting kan worden bereikt, weonderzocht extravasatie van circulerende hematopoietische cellen in een laag van EG en een laag beenmergstromacellen. Hiervoor werd een tweede (lagere) insert met een laag stromacellen geplaatst naast de bovenste insert met de EC monolaag in de onderplaat (figuur 4). Het experiment werd uitgevoerd zoals hierboven beschreven en de transmigrated cellen werden geoogst uit de putjes en geteld. De resultaten toonden aan dat toevoeging van een extra laag van bindweefselcellen onder het EC monolaag de migratie van hematopoietische cellen naar SDF-1 (Figuur 4) aanzienlijk toegenomen. Deze bevinding is consistent met het idee dat de lokale micro bijdraagt ​​tot de rekrutering van circulerende cellen aan het weefsel.

Figuur 1. De 3D stromingskamer apparaat. A: De hermetisch gesloten 3D apparaat bestaat uit twee compartimenten gescheiden door een vervangbare poreus membraan (PM). EC groeien op het membraan, dat dan vormt een barrière tussen de bovenste en onderste compartimenten. Gedefinieerde schuifspanning aangebracht op het bovenste compartiment van de 3D media apparaat te doorstromen met een constante infusie peristaltische pomp. Circulerende cellen zijn ofwel niet-interagerende (NIC), interactie met de EC tijdelijk ('roll', RC), of zich houden aan de EC (AC). Een subpopulatie van hechtende cellen transmigreert over de EC-laag naar de onderste statische compartiment van de inrichting (TM) B:. Een bovenaanzicht tekening (bovenste paneel) van het 3D-apparaat. De horizontale doorsnede (onderste paneel) toont de positie van het bovenste membraan (rood), het onderste membraan (groen) en de bodem van de put (blauw) C:. Het isometric uitzicht illustreert de integrale onderdelen van het apparaat: vier schroeven, een acryl bovenste blok, een bovenkamer seal, bovenste en onderste membranen, bottom o-ring, en een 3-put acryl bodem blok D:. Een foto van de 3D-stroom kamer verbonden met een peristaltische pomp en een gasuitwisseling unit. Het systeem is gemonteerd in een steriele kap en vervolgens overgebracht naar een celkweek incubator.

Figuur 2. Een schematische weergave van het 3D apparaatsysteem. De tekening toont de drie stops nodig om het systeem monteren. Het kweekmedium wordt aangezogen vanuit de inlaat door de onderdruk die door de peristaltische pomp. De mediumstroom wordt afgesloten door Stop # 1 om de inserts worden geplaatst in het apparaat. Nadat de kamer wordt gesloten, de pomp switschakeld weer en de kamer wordt gevuld met medium direct drogen van de cellen gekweekt op de inzetstukken te voorkomen. Stop # 2 kan medium in de gasuitwisseling apparaat worden geplaatst. Stop # 3 kan de stroom worden gestopt voor de aansluiting van de inlaat en uitlaat. De stroom kan worden geleid in een rechtsom of linksom om luchtbellen te verwijderen door de gasuitwisseling vergroten met een schakelaar op de pomp.

Figuur 3. De 3D-apparaat ondersteunt SDF-1-gemedieerde transmigratie van hematopoietische voorlopers onder condities van fysiologische shear stress. A: Drie apparaten (elk 3 putten in het onderste compartiment) werden gemonteerd en parallel lopen. Alleen medium of medium dat SDF-1 op 5 of 50 ng / ml werd toegevoegd aan het onderste compartiment putjes toegevoegd. Muizen bone beenmerg cellen kunnen circuleren in de inrichtingen voor 4 uur. Daarna werd elk apparaat gedemonteerd en de cellen die naar SDF-1 (yellow) had transmigrated werden vanuit het lagere putten, geteld en gekweekt in methylcellulose aangevuld met hematopoietische groeifactoren (GF). Veertien dagen later werden de kolonies gescoord onder de microscoop B:. Het aantal voorlopercellen (kolonievormende cellen, CFC) teruggewonnen uit de onderste compartimenten weergegeven als gemiddelde ± SD van drie putjes per conditie. * P <0,05.

Figuur 4. Het effect van de micro over interacties tussen hematopoietische en endotheelcellen. A: De afbeelding toont de positie van een tweede poreus membraan met gekweekte stromal fibroblasten (SF) onder de bovenste membraan met EC. Andere afkortingen zijn als beschreven voor figuur 1A B:.. De extra membraan (onderste cassette) met gekweekte SF is onder het bovenste membraan ingevoegd C: Drie inrichtingen (elk 3 putjes) werden parallel. Alleen medium of medium dat SDF-1 in 50 ng / ml SDF-1 werd het onderste compartiment putjes toegevoegd. De negatieve controle kamers weggelaten SC, SDF-1, of beide. Beenmerg cellen liet circuleren 4 uur bij 37 ° C. Daarna werd elk apparaat gedemonteerd en transmigrated cellen werden verzameld uit het onderste compartiment putten en geteld. Het aantal transmigrated cellen teruggewonnen wordt weergegeven als het gemiddelde ± SD van drie putjes per conditie. * P <0,05.

Discussie

De 3D-inrichting kan een nuttige techniek voor onderzoek op diverse gebieden, waaronder stamcel biologie, vasculaire biologie, hematologie, oncologie, auto-immuniteit en ontsteking. De 3D-inrichting zullen bijzonder nuttig voor onderzoekers die hematopoïetische, mesenchymale, neuronale en andere stamcellen om de moleculaire mechanismen reguleren van elke stap van de stamcel extravasatie cascade onderzoeken. Onderzoekers bestuderen cel migratie kan dit apparaat ook gebruiken om de verschillende trekkende mechanismen van T-en B-lymfocyten, monocyten, neutrofielen, eosinofielen, NK-cellen, en andere migrerende cellen te onderzoeken. In vasculaire biologie, de inrichting nuttig is om het effect van de lokale micro-omgeving van het vermogen van EG celrekrutering steunen en de bloed-hersenbarrière in vitro na te bootsen. Voor onderzoekers gericht op ziektepathogenese, kan het apparaat worden gebruikt om de migratie van cytotoxische T-cellen in de alvleesklier bij diabetes type I, de mi bestuderenintegratie van eosinofielen in de longen van astmapatiënten, de migratie van neutrofielen, monocyten en lymfocyten naar plaatsen van ontsteking in een verscheidenheid van aandoeningen, de rekrutering van cellen om genezing plaatsen wond, de interactie van cytotoxische T-cellen met de neovasculatuur en rekrutering van cytotoxische T-cellen in tumoren.

De nieuwe 3D-toestel zal ook een nuttig hulpmiddel voor translationeel wetenschap en de preklinische ontwikkeling van geneesmiddelen en screening zijn. Bijvoorbeeld kan de inrichting worden gebruikt voor het optimaliseren van de bereiding van therapeutische celsuspensies voor intraveneuze toediening, de rekrutering van therapeutische cellen testen om gewond weefsel versus normale weefsels, en de rol van specifieke orgaan of weefsel endotheel micromilieu in deze studie proces. Voor de ontwikkeling van geneesmiddelen, kan het apparaat worden gebruikt om geneesmiddelkandidaten dat doeltumorcellen testen en blokkeert elke stap van de cascade extravasatie te migrerende cellen als een medicijn ontwikkelen testeny voertuig tumorplaatsen, drugs die de functie van menselijke orgaanspecifieke endotheel of de lokale weefsel-specifieke micro reguleren, en combinaties van geneesmiddelen die de verschillende stappen van de homing cascade regelen testen testen. Tenslotte, na omzetting in een high-throughput systeem, de inrichting kan worden gebruikt voor het screenen van kleine moleculen, peptiden en antilichamen die doelmoleculen bemiddelen celtransport.

Technische gegevens en tips

Rollen en adhesie onder stroom de kritische stappen in de extravasatie cascade en aanzienlijk bijdragen aan de efficiëntie van celmigratie in vivo. Name zijn deze stappen niet bij aan statische testen in vitro. Echter, transmigratie statische testen zijn bruikbaar als negatieve controles in experimenten testen van de effecten van schuifspanning op celoverleving en functie, waaronder het vermogen van EG lage affiniteit interacties (rollen) en stevige hechting te ondersteunen.

De keuze van het medium voor experimenten in de 3D inrichting belangrijk. Media bevat verschillende groeifactoren die de overleving van circulerende cellen te beïnvloeden, met name tijdens lange incubatietijd. Bovendien is de concentratie van ^{Ca2 +} en ^{Mg2 +,} die bindingsinteracties beïnvloeden onder omstandigheden van fysiologische stroming variëren aanzienlijk commercieel kweekmedia. Andere technische details waarmee rekening moet worden gehouden bij de planning van experimenten met het 3D-apparaat worden hieronder besproken.

Selectie van de EG monolaag

Het celoppervlak signatuur van EG wordt beïnvloed door verschillende parameters, waaronder de soort en het weefsel van herkomst en de celcultuur condities, waarbij rekening gehouden bij de proefopzet moet worden genomen. Enkele veel gebruikte EC omvatten long-afgeleide microvasculaire EC (LDMVEC), beenmerg-afgeleide EG (BMDEC), hersenen afgeleide EG (bdec), en HUVEC.De eigenschappen van de EC ook variëren met hun afkomst. Bijvoorbeeld, BMDEC constitutief uitdrukkelijke selectines en VCAM-1, die verantwoordelijk zijn voor het rollen en adhesie, terwijl bdec, LDMVEC, en HUVEC niet deze moleculen uitdrukken onder normale omstandigheden. Daarom kunnen inzetstukken bekleed met bdec, LDMVEC en HUVEC worden voorbehandeld met TNF α (10 ng / ml, 4 uur) of andere factoren te bootsen en ontsteking induceren expressie van homing moleculen.

Testen crosstalk met de lokale micro-omgeving

Er is een groeiende interesse in het begrijpen hoe de lokale micro-omgeving regelt de functies van de EG en participeert in cel extravasatie. Onze resultaten tonen aan dat insertie van een monolaag van bindweefselcellen onder het EC monolaag verhoogt extravasatie van circulerende cellen. Deze bevinding toont aan dat overspraak tussen de EG en stroma vergroot het vermogen van de EG tot extravasatie van circulerende cellen te ondersteunen. Moreover, het inbrengen van cellen van verschillende micro-omgevingen (zoals mesenchymale stamcellen, long fibroblasten, tumorcellen, astrocyten) kunnen helpen te bootsen specifieke vasculaire bedden. In het bijzonder zou een combinatie van hersenen afgeleide EC en astrocyten een nuttige benadering om de bloed-hersenbarrière na te bootsen. Ook cellen verkregen van patiënten, of normale cellen gemanipuleerd in vitro, zou kunnen helpen na te bootsen een specifieke zieke micro-omgeving.

In onze studies hebben we toegepast lager inzetstukken stromale cellen gekweekt tot 50% confluentie. Alhoewel de optimale dichtheid van micromilieu cellen op de inzetstukken zal afhangen van de doelstellingen van de studie, kan deze gemakkelijk worden gemanipuleerd en gecontroleerd.

Het selecteren van een schuifspanning tarief

De schuifspanning van 0,8 dyn / cm ² werd hier gebruikt omdat is aangetoond door Von Andrian et al.. de schuifspanning in het beenmerg microvasculature, waar hematopoietische stamcellen verlaat de bloedsomloop en voert weefsels onder normale fysiologische omstandigheden ^15. Daarentegen zijn hogere schuifspanning waargenomen in grotere vaten, waar mobiele extravasatie beperkt. Daarom, hoge afschuifspanning gehanteerd worden als bijkomende controles voor experimenten onderzoeken extravasatie van verschillende celtypen.

De overleving van cellen onder schuifspanning afhankelijk van verschillende factoren, zoals het type cel en ex vivo celbehandelingen (Goncharova et al.., Ongepubliceerde waarnemingen), en zou dus zorgvuldig worden geëvalueerd tijdens de proef. Cel gevoeligheid voor verschillende niveaus van shear stress (shear stress weerstand) kunnen worden geëvalueerd door het programmeren van de peristaltische pomp aan de schuifspanning tarief stapsgewijs te verhogen van 0,8 dyn / cm ² tot 6 dyn / cm ^2. Tijdens deze tests, kunnen cellen periodiek worden verzameld uit de gasuitwisseling kamer naar celdood gebruik als monitorenzegt zoals trypanblauwexclusie, annexine V en PI kleuring, en apoptose marker expressie.

Als experimenten zijn ontworpen om de schuifspanning weerstand van ex vivo gemodificeerde cellen of cellen afkomstig van parenchym testen wordt aanbevolen dat aanvullende positieve controles zoals bloed overgedragen cellen, zijn in de experimenten.

Selectie van het inzetstuk poriegrootte en ECM coating

Sloten zijn met verschillende poriegrootten (3, 5, en 8 urn). De keuze van de poriëngrootte is afhankelijk van de grootte en eigenschappen van de circulerende testcellen, hetgeen ook het geval is voor statische Transwell assays. Wisselplaten met een grote poriegrootte (8 micrometer) worden aanbevolen om extravasatie van grote cellen, zoals tumorcellen van epitheliale oorsprong te testen. Leukocyten of hematopoietische stamcellen zijn vaker getest met 5 urn poriën inserts en 3 urn poriën inserts best gereserveerd voor het testen van extravasatie sMaller cellen. De testcel grootte alleen is niet de enige belangrijke factor en we onderzoek aanbevelen inzetstukken met verschillende poriegrootte.

In onze eerste studie, testten we diverse ECM op hun vermogen om de groei van de EG-steun op de inserts en shear stress te weerstaan ​​voor> 4 uur. De geteste ECM inbegrepen Matrigel, poly-D-lysine, fibronectine, laminine, collageen type I, Hydrogel, Meta-keratine I, II, III, IV en Extracel. De beste resultaten voor EG groei werden verkregen met Extracel, fibronectine en collageen. Echter, in onze handen, Extracel bij 0,8 ug / cm ² verminderde de transmigratie van testcellen over het membraan. Daarom gebruiken we nu fibronectine (5 ug / cm ²⁾ en collageen (5 ug / cm ²⁾ voor het bekleden van inserts. Echter zal de optimale keuze van ECM waarschijnlijk zowel door het type EC en Transmigratory eigenschappen van de testcellen. Een eerste experiment moet worden uitgevoerd om de Integri testenty van de EG monolaag gegroeid op geselecteerde ECM. Plaats bijvoorbeeld pre-coated inzetstukken EC monolagen in petrischalen gevuld met kweekmedium, de schaaltjes op een schudder schuifspanning (lage stand) te creëren, en incubeer bij 37 ° C en 5% _CO2 gedurende 12 uur. De integriteit van de EC na blootstelling aan de schuifspanning kan worden geëvalueerd met kristalviolet kleuring.

Selectie van de optimale test-celconcentraties

Het vermogen van testcellen de circulatie verlaten afhankelijk van veel kenmerken van elke celtype. Om statistisch significante resultaten te genereren, moet de circulerende celdichtheid worden geoptimaliseerd om ervoor te zorgen dat een voldoende aantal cellen migreren naar de positieve controles. Daarom raden wij u aan eerste testen met verschillende celdichtheden (bijv. 10 ³ / ml tot 10 ⁷ / ml) de verhouding tussen het aantal cellen geladen in het systeem en begrijpenhet aantal cellen die transmigratie ondergaan.

Daarnaast kan de optimale circulerende concentratie verschillen hetzelfde celtype verkregen uit verschillende bronnen. Bijvoorbeeld, CD34 ^+-cellen zijn een heterogene celpopulatie die zowel hematopoietische stamcellen en toegewijde lijn-specifieke voorlopers. Ze kan worden verkregen uit het beenmerg, gemobiliseerd perifeer bloed en navelstrengbloed. De CD34 ⁺ cellen, afkomstig van deze drie bronnen bezitten verschillende homing en engrafting capaciteiten ^16-18, zodat de voorwaarden voor het testen van deze cellen in het 3D-toestel moet worden geoptimaliseerd voor een full-scale onderzoek.

Selectie van de optimale cel circulatie tijd

De optimale circulatietijd moet empirisch worden bepaald voor elk celtype. De minimale tijd die vereist circulation kan worden afgeleid uit de resultaten van statische migratie assays, maar dit kan worden extended wanneer de cellen worden blootgesteld aan schuifspanning. Pilot studies testen circulatietijden tussen 4 en 96 uur worden aanbevolen.

De gasuitwisseling eenheid

Het hoofddoel van de gasuitwisseling eenheid om de optimale concentratie van _CO2 in het handhaven medium circuleert door de 3D-inrichting vergelijkbaar met de instellingen in standaard weefselkweek incubator. De gasuitwisseling apparaat kan ook worden gebruikt voor het toevoegen testcellen en verbindingen en verzameling sondes en monsters tijdens de test.

Evaluatie van de test mobiele nummers

Circulerende cellen kunnen op verschillende tijdstippen bemonsterd worden tijdens het experiment via de gasuitwisseling eenheid. Eind van experiment zou de cellen in de bloedsomloop worden verzameld uit de uitlaat. Wanneer het 3D-apparaat gedemonteerd aan het einde van het experiment, kan de transmigrated cellen geoogst uit de onderste putjes verzameld en fof verdere analyse. Als de ingang cellen zijn zonder etiket, kan de transmigrated cellen worden gekleurd met trypaanblauw en levende / dode cellen microscopisch opgesomd. Alternatief kan de ingang cellen gelabeld met een van de vele "cel tracker" kleurstoffen voor live cell imaging voordat bij 3D apparaat, in dit geval, de geoogste transmigrated cellen worden gelyseerd voor kwantificering van fluorescentie.

Selectie van de optimale steekproefgrootte

Om statistische analyse mogelijk moet een steekproef worden geselecteerd die ongeveer 80% vermogen zal de hypothetische verschil in de gemiddelde procentuele veranderingen tussen twee groepen indien getest bij een significantieniveau van 0,05 met een tweezijdige t-test detecteert. Op basis van onze ervaring met beenmergcellen, gebruiken we drie putten per experimentele conditie voor de 3D-apparaat experimenten. Echter zal de optimale steekproefomvang variëren met als doel het experiment worden bepaald empirically. Meervoudige regressie statistische tests, tweezijdige t-tests en variantieanalyse kan worden gebruikt om de statistische betekenis van de resultaten te controleren.

Selectie van chemokinen

Zoals voor alle transmigratie assays, de keuze van chemoattractant worden bepaald door de eigenschappen van de testcellen en de doelstelling van de studie. SDF-1 is een gevestigde chemoattractant voor hematopoïetische cellen. In onze handen, een concentratie van 50 ng / ml SDF-1 is optimaal om extravasatie van beenmerg afgeleide hematopoïetische voorlopercellen stimuleert. We C3a en bFGF ook gebruik als chemoattractanten voor mesenchymale stamcellen ^19. Toch raden wij titreren elke chemokine en cross-titratie combinaties van chemokines om de optimale concentratie bereik te identificeren voordat een volledige studie. Voor bepaalde celtypen, kan een combinatie van chemotactische factoren gunstig. Als chemokines voor specifieke test-cellen zijn onbekend of niet beschikbaar is, congeconditioneerde media van gestimuleerde lymfocyten, fibroblasten, en andere cellen kunnen worden gebruikt als een bron van chemoattractants.

Selectie van de uitlezing parameters

De veelzijdigheid van het 3D-apparaat voor het type transmigratie experimenten die kunnen worden uitgevoerd vouwen en het succes van de experimenten zullen afhangen doordachte behandeling en vormgeving van de uitlezing parameters. In de regel cellen vanuit het bovenste (circulerende) compartiment en de onderste (vaste) compartiment moeten worden getest op levensvatbaarheid tegelijkertijd als celtelling. Sommige cellen bezitten lage tolerantie voor de fysiologische shear stress waargenomen in de microvasculatuur. In dit geval zal het aantal dode cellen worden verhoogd in het bovenste compartiment. Het aantal hechtende cellen aangehouden (of gevangen) de EC-laag kan worden geëvalueerd door middel van immunocytochemie van markers specifiek tot expressie van de testcellen. Antilichamen specifiek voor CD31 en vWF kan worden gebruiktEG sporen en tot discriminatie tussen de test cellen en EC toestaan. Bovendien blijft de integriteit van de EC monolaag worden gecontroleerd op het eind van elke test.

De types van analyses uitgevoerd met de verzamelde cellen zal afhangen van de onderzoekers experimentele doelen, maar kan daarbij bestudeerd veranderingen in genexpressie door microarrays en qPCR, oppervlaktemolecuul expressie door FACS-analyse, activatie van signaalwegen door FACS en western blotting en factor secretie door ELISA. Een enorme reeks van functionele testen mogelijk van de verzamelde cellen in vitro, zoals aangetoond door onze eigen werk waarin we de transmigrated gekweekte beenmergcellen de hematopoietische progenitorcellen (figuur 3) sommen. De verzamelde monsters kunnen ook worden getest in verschillende in vivo assays.

Een belangrijke parameter die kan helpen om het gedrag van de testcellen in vivo te voorspellen is de neigingparantie van sommige cellen aan aggregaten vormen onder verschillende tarieven van shear stress. Bijvoorbeeld therapeutische cellen die aggregaatvorming in de 3D ​​inrichting ondergaan een grotere neiging om samen te klonteren na intraveneuze toediening vormen en acute vasculaire obstructie in vivo (Goncharova et al.., Ongepubliceerde waarnemingen) hebben. Aggregaatvorming kan microscopisch worden gevolgd door bemonstering van de testcellen tijdens of na afloop van de 3D-inrichting experiment.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagens/Materiaal
PVC buis (doorlaat 1.42, wand 0.8)	Watson-Marlow Limitid	981.0142.000
3D Kamer	C.B.S.Scientific	FC-1000
Gaswisselingsunit	C.B.S.Scientific	FCR-1000
Inzetstukken	C.B.S.Scientific	FCI-1005U
Collageen Rund, Type I	BD Biosciences	354231
Zoutzuur 0.1M	VWR	BDH3200-1
PBS	Invitrogen	14190
HUVEC	Lonza	CC- 2517
EGM Bullet Kit (cc - 3121 & cc - 4133)	Lonza	CC - 3124
Trypsine Neutralisatieoplossing	Lonza	CC-5002
Trypsine	Lonza	CC-5012
HEPES	Lonza	CC-5024
SDF-1	R7D System	460-SD
Extracel Trial 2.5 Kit	Glycosam Byosystems	GS211
Fibronectine, menselijk, natuurlijk	BD Biosciences	356008
Poly-D-lysine	Millipore	A-003-E
BD Matrigel	BD Biosciences	354277
Menselijke hersenmicrovasculaire endotheliale cellen	ScienCell	1000
Endotheelcelmedium (ECM) voor hersencellen	ScienCell	1001
Trypan Blauw	StemCells Tecnologies	7050
TNF-alfa, 10 μg	Invitrogen	PHC3015
VCAM-1, muis anti-mens, CD106-FITC	Southern Bioteck	9519-02
Propidium Jodide Kleuringsoplossing	BD Pharmingen	# 556463
Ingevroren menselijke navelstrengbloed CD34+ cellen	StemCell	CB007F
Ingevroren menselijke navelstrengbloed CD34+ cellen	Zenbio	SER - CD34-F
MethoCult GF M3434	StemCells Tecnologies	GFM3434
Muis methylcellulose complete media	R&D	HSC007
Anti-Von Willibrand Factor antilichaam	abcam	C# ab11713
Petrischaal (35 x 10 mm)	VWR	CA25373-041
15 ml buisjes	VWR Fisher	21008 - 918
Weefselkweekkolven 75cm2	VWR	BD353136
Cristal violet	Sigma	C-3886-25G
Dissectiepincet, gebogen	VWR	82027-384
1.000 μl Pipettips	VWR	83007-380
1 - 200 μl Pipettips	VWR	37001-530
Apparatuur
Peristaltische pomp	Watson-Marlow Limitid	403U/VM3