Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Langdurige Behavioral Tracking van Vrij Zwemmen Zwak Electric Fish

12.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50962

⸱

6 maart 2014

 ,  , 
1Department of Physics, University of Ottawa, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa, 3Centre for Neural Dynamics, University of Ottawa

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een set van technieken voor het bestuderen van spontaan gedrag van vrij zwemmen zwak elektrische vissen over een langere periode van tijd, door synchroon meten van elektrische orgel ontlading timing van het dier, lichaamshouding en houding zowel nauwkeurig en betrouwbaar in een speciaal ontworpen aquarium tank in een zintuiglijke isolatiekamer.

Samenvatting

Langdurige gedragsproblemen tracking kan vastleggen en kwantificeren natuurlijke dierlijke gedrag, ook die welke zich zelden. Gedrag, zoals exploratie en sociale interacties kunnen het beste worden bestudeerd door het observeren van ongeremde, vrij gedragen dieren. Zwak elektrische vissen (WEF) scherm gemakkelijk waarneembare verkennend en sociaal gedrag door het uitzenden van elektrische orgel ontlading (EOD). We beschrijven hier drie effectieve technieken synchroon meten EOD, lichaamshouding en houding van een vrijzwemmende WEF gedurende langere tijd. Eerst beschrijven we de bouw van een experimentele tank binnenkant van een isolatiekamer ontworpen om externe zintuiglijke prikkels zoals licht, geluid en trillingen te blokkeren. Het aquarium werd verdeeld tot vier proefstukken tegemoet te komen, en automatische poorten op afstand toegang van de dieren aan de centrale arena beheersen. Ten tweede, beschrijven we een nauwkeurige en betrouwbare real-time EOD timing meetmethode van vrij rond te zwemmen WEF. Signaalvervormingen veroorzaakt door bewegingen van het lichaam van het dier worden gecorrigeerd door ruimtelijke middeling en temporele verwerking fasen. Ten derde, beschrijven we een onderwater nabij-infrarood imaging setup om onverstoord nachtdier gedrag te observeren. Infrarode lichtpulsen werden gebruikt om de timing tussen de video en de fysiologische signaal synchroniseren over een lange opnameduur. Onze geautomatiseerde tracking software meet lichaamshouding en houding van het dier betrouwbaar in een aquatisch scene. In combinatie, deze technieken in staat langdurige observatie van spontaan gedrag van vrij zwemmen zwak elektrische vissen in een betrouwbare en nauwkeurige wijze. Wij geloven dat onze werkwijze kan eveneens betrekking op de fysiologische signalen verkennende of sociaal gedrag worden toegepast op de studie van andere waterdieren.

Inleiding

Achtergrond. Kwantitatieve experimenten op het gedrag van dieren (bijvoorbeeld gedwongen keuze, schokken vermijden, T-doolhof, enz.) Worden meestal gebruikt om specifieke hypotheses te onderzoeken met betrekking tot sensorische-motorische vaardigheden, leren en geheugen vorming. Echter, deze beperkende experimenten missen een groot deel van de rijkdom van het natuurlijke gedrag van dieren en zullen waarschijnlijk leiden tot ongenuanceerde modellen van de onderliggende neurale basis van gedrag. Experimenten onder meer naturalistische omstandigheden zijn daarom een ​​belangrijke aanvulling waarmee we meer volledig een soort gedragsrepertoire verkennen. Experimenten met vrij bewegende dieren moeten echter aanpakken unieke technische uitdagingen zoals-beweging geïnduceerde opname artefacten. Unlike-stimulus opgewekte responsen kunnen spontaan optredende verkennende gedrag te voorspellen, dus proefpersonen moeten voortdurend worden gecontroleerd en gevolgd gedurende een langere tijdsperiode. Specifieke onderzoeksvragen can best worden aangepakt door zorgvuldig geselecteerde organismen en beschikbare technische hulpmiddelen. Bijvoorbeeld zijn optische registratie-en stimulatie technieken zoals genetisch gecodeerde calcium sensoren 1 en 2 optogenetics succes toegepast op vrijdraaiende genetisch modelorganismen 3-5. Als alternatief kan geminiaturiseerde neurale telemetrie systemen op te nemen en vrij te stimuleren bewegende kleine dieren 6,7.

Elektrische vissen. WEF soorten genereren elektrisch orgel ontladingen (EODs), die hen in staat stellen om hun directe omgeving te voelen of om te communiceren over grotere afstanden. Temporele patronen van EODs afwijken onder andere omstandigheden zoals zelf-bewegingen 8,9, zintuiglijke prikkels 10,11, en ​​sociale interacties 12,13. Pulsvormig WEF soorten produceren een trein van discrete pulsen, in tegenstelling tot golf-achtige soorten die voortdurend quasi-sinusoïdale golfvormen genereren. In het algemeen, pulse soorten ingevoerd tentoonstelling more variabele EOD in vergelijking met de golf-achtige soorten, en de dieren 'EOD tarieven nauw weerspiegelen nieuwigheid inhoud van hun zintuiglijke omgeving 10,14. Puls-achtige soorten kunnen direct verkorten van de interval tussen pulsen (BIV) binnen een enkele puls cyclus reageren op een nieuwe zintuiglijke verstoring (novelty reactie 10,11,14). De lopende elektrische gedrag van deze vis kan worden verstoord door ongecontroleerde sensorische prikkels uit externe bronnen, en verschillende soorten stimuli zoals trilling, geluid, elektriciteit en licht zijn bekend trekker nieuwheid reacties. Daarom moeten speciale voorzorgsmaatregelen worden genomen om tijdens een langdurige observatie van vrij zwemmende WEF externe zintuiglijke prikkels blokkeren of verzwakken. Zo kunnen veranderingen in EOD snelheid en beweging trajecten specifiek toegeschreven aan stimuli door de experimentator.

Aquariumtank en isolatiekamer. We meerdere lagen van vibratie absorberende materialen geplaatst dus under een groot aquarium tank (2,1 mx 2,1 mx 0,3 m), en omringden de tank met een geïsoleerde behuizing voor externe lichtbronnen, elektrische ruis, geluids-en warmte flux blokkeren. EOD is afhankelijk van de omgevingstemperatuur 15,16, waardoor de temperatuur van het water is strak gereguleerd op een tropisch bereik (25 ± 1 ° C) voor Zuid-Amerikaanse WEF soorten. We bouwden een groot en ondiep (10 cm waterdiepte) tank naar ruimtelijke verkennende gedrag van WEF hoofdzakelijk beperkt in twee dimensies (figuur 1A) te observeren. De tank werd verdeeld in een centrale arena om ruimtelijke gedrag te observeren, en vier hoeken compartimenten afzonderlijk te huisvesten afzonderlijke vissen (Figuur 1B). Elk compartiment is gebouwd waterdichte elektrische communicatie tussen individuen te voorkomen. Toegang dieren aan de centrale arena werd gecontroleerd van buitenaf door vier gemotoriseerde poorten. De hekken werden geplaatst tussen de compartimenten, en zij werden waterdicht indien geslotendoor nylon vleugel-moeren. Geen metalen onderdelen werden onderwater gebruikt sinds WEF reageren gevoelig voor metalen.

EOD opnemen. EODs worden gegenereerd in een stereotiepe wijze door activering van enkele (in Mormyrids) of meerdere ruimtelijk verdeeld elektrische orgels (in Gymnotiforms) 17,18. Temporal modulaties in de EOD tarief kan onthullen hogere neurale activiteiten, omdat het medullaire pacemaker ontvangt directe neurale input van hogere hersengebieden zoals de diencephalic prepacemaker kern, die omgekeerd is axonale projecties van de voorhersenen 19. Wel moet de EOD timing zorgvuldig worden geëxtraheerd uit een ruwe golfvormregistratie en niet beïnvloed door beweging geïnduceerde verstoringen van het dier. Het elektrische veld dat door een WEF kan worden benaderd als een dipool, dus EOD pulsamplitude bij registrerende elektroden afhankelijk van de relatieve afstanden en oriëntaties tussen het dier en de elektroden 8,20. Self-movem dierouders veranderen de relatieve geometrie tussen het dier en de elektroden, waardoor bewegingen veroorzaken de EOD amplitudes op verschillende elektroden te variëren in de tijd in een vluchtige wijze (zie figuur 2B in juni et al.. 8). Bovendien, self-bewegingen ook veranderen de vorm van opgenomen EOD golfvormen, omdat de relatieve bijdragen van de verschillende set van de elektrische organen afhankelijk van hun locaties langs de lichaamslengte en hun lokale krommingen geïntroduceerd door staart buigen. De beweging veroorzaakt verstoringen in de EOD amplitudes en vormen kunnen leiden tot onnauwkeurige en onbetrouwbare EOD timing metingen. We losten deze problemen door het ruimtelijk gemiddelde van meerdere EOD golfvormen opgenomen op verschillende locaties, en door het toevoegen van een envelop extractie filter om precies te bepalen de EOD timing van een vrij zwemmende WEF. Bovendien, onze techniek meet ook de EOD amplitudes, die aangeeft wanneer een dier rust of actief bewegen gebaseerd op de verandering van de EODamplitudes in de tijd (zie de figuren 2E en 2F). We namen differentieel versterkte signalen van de registratie-elektrode paren common-mode ruis. Omdat de EOD pulsen worden gegenereerd op onregelmatige tijdsintervallen, de EOD event time-serie hebben een variabele sampling rate. De EOD tijdreeksen kan een constante sampling rate worden geconverteerd door interpolatie indien vereist door een analytisch instrument van keuze.

Video-opname. Hoewel EOD opname een grove beweging activiteit van een dier kan monitoren, video-opname maakt directe metingen van het lichaam van positie en houding van een dier. Nabij-infrarood (NIR) verlichting (λ = 800 ~ 900 nm) maakt onverstoorbaar visuele waarneming van vrij zwemmende vissen 21,22, omdat WEFs zijn het meest actief in de duisternis en hun ogen zijn niet gevoelig voor NIR spectrum 23,24. De meeste digitale beeldsensoren (bijv. CMOS of CCD) kan NIR spectrum vastleggen met de wavelength range tussen 800-900 nm, na het verwijderen van een infrarood (IR) sperfilter 25. Sommige high-end consumenten-grade webcams bieden high-definition, grote kijkhoek en goede gevoeligheid bij weinig licht, die kan produceren een beeldkwaliteit die vergelijkbaar is met of beter dan professionele IR-camera's beschikbaar tegen veel hogere kosten. Daarnaast worden bepaalde consumenten-grade webcams gebundeld met opname-software die een langere opnameduur mogelijk maakt door video comprimeren zonder kwaliteitsverlies. De meeste professionele camera's bieden tijdsynchronisatie TTL impulsuitgangen of trigger TTL pulsingangen 26 voor het uitlijnen van de timing tussen de video met de gedigitaliseerde signalen, maar deze functie is veelal afwezig in consumenten-grade webcams. Echter, de timing tussen een video-opname en een signaal digitizer nauwkeurig worden geëvenaard door gelijktijdig vastleggen van een periodiek knipperende IR LED met de camera en het signaal digitizer. De eerste en de laatste puls IR timing kan worden gebruikt eens twee tijdkalibratiesig markering voor de framenummers omzetten om het signaal digitizer tijdseenheid en vice versa.

Verlichting & achtergrond. Vastleggen van het beeld door het water kan zijn technisch uitdagend door lichtreflecties in het water oppervlak. Het wateroppervlak kan fungeren als een spiegel om een ​​visuele scène boven water, en obscure visuele kenmerken onderwater weerspiegelen, dus de scène boven water moet karakterloze worden gemaakt om visuele interferentie te voorkomen. Om het imago van de hele aquarium, een camera moet direct boven het water te worden geplaatst, en het moet worden verborgen achter het plafond over een kleine doorkijk naar de reflectie op het water oppervlak te voorkomen. Bovendien kan het water oppervlak glans en ongelijkmatige verlichting opleveren als lichtbronnen verkeerd worden geprojecteerd. Indirecte verlichting kan een uniforme helderheid te bereiken over het gehele aquarium door te streven de lichtbronnen in de richting van het plafond, zodat het plafond en de omringende walls kunnen reflecteren en verspreiden de lichtstralen vóór het bereiken van het wateroppervlak. Kies een IR schijnwerper die overeenkomt met een spectrale respons van de camera (bijv. 850 nm piek golflengte). Elektrische ruis van de lichtbronnen kan worden geminimaliseerd door het gebruik van LED-verlichting en het plaatsen van hun DC-voedingen buiten de kooi van Faraday. Plaats een witte achtergrond onder de tank, omdat vis contrasteert heel mooi in een witte achtergrond bij NIR golflengten. Ook het gebruik van matte kleur op de binnenoppervlakken van de isolatiekamer levert uniforme en heldere achtergrondverlichting.

Video tracking. Na een video-opname, kan een geautomatiseerde beeldtracking algoritme van het dier lichaamshoudingen en houdingen in de tijd te meten. De video-tracking kan automatisch worden uitgevoerd door een van beide kant-en-klare software (Viewpoint of Ethovision), of door de gebruiker programmeerbare software (OpenCV of MATLAB Beeldverwerking toolbox). Als eerste stap van beeldtracking,een geldig tracking gebied moet worden gedefinieerd door het tekenen van een geometrische vorm om buiten het gebied uit te sluiten (maskeren werking). Vervolgens afbeelding van een dier nodig heeft van de achtergrond te worden geïsoleerd door een achtergrondafbeelding af te trekken van een afbeelding met het dier. De afgetrokken beeld wordt omgezet in een binair formaat door toepassing van een intensiteit drempel, zodat het zwaartepunt en de oriëntatie as kan worden berekend uit binaire morfologische bewerkingen. In Gymnotiforms 27-29 en Mormyrids 30-32, de Elektroreceptor dichtheid is de hoogste in de buurt van het hoofd regio, dus de positie van het hoofd op ieder moment duidt op een locatie van de hoogste zintuiglijke scherpte. De kop en de staart locaties kan automatisch worden bepaald door toepassing van de beeldrotatie en begrenzingsvak operaties. De kop en de staart uiteinden kunnen worden van elkaar onderscheiden door ze handmatig te definiëren in het eerste frame, en door het bijhouden van hun locaties uit de vergelijking van twee opeenvolgende frames.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Deze procedure voldoet aan de eisen van de Universiteit van Ottawa Animal Care Comite. Geen belangenconflict wordt verklaard. Raadpleeg de tabel van materialen en reagentia voor de merken en modellen van de apparatuur en de hieronder genoemde materialen. Op maat geschreven Spike2 en MATLAB scripts, en sample gegevens worden verstrekt in de aanvullende File.

1. Aquarium Tank en isolatiekamer Setup

  1. Anti-v ibration vloer. Construeren van een anti-vibratie oppervlak (2,1 mx 2,1 m) door het stapelen van rubberen pads, akoestische piepschuim, multiplex paneel, en polyurethaanschuim pads van de bodem naar de top (Figuur 1A). Leg vier houten tapeinden (5 cm x 10 cm) op de multiplex plaat aan de randen van de aquariumtank ondersteunen.
  2. Vloerverwarming. Leg een elektrisch afgeschermde verwarmingselement dan thermisch graded schuimvulling (zie figuur 1D onderaan). Bedek het verwarmingselement met een metalenlic. mesh voor elektrische afscherming.
  3. Ruimtelijke tank. Construct een breed en ondiep aquarium tank (1,8 mx 1,8 mx 30 cm) met behulp van 1,3 cm dik gehard glas panelen, L-vormig aluminium frame en aquarium-grade siliconen (zie figuur 1A). Bedek de onderkant van de tank met een groot vel witte achtergrond hoge beeldvorming contrast bieden (zie Protocol nr. 3).
  4. Verdeel het aquarium tank in een centrale arena (1,5 m diameter) en vier hoeken compartimenten (zie figuur 1B) door het installeren van muren (22,5 cm hoog) gemaakt van acryl platen (mat wit, 0,64 cm dik).
    1. Bend vier acrylplaten (22,5 cm x 102,7 cm) door het toepassen van warmte aan vier gebogen wanddelen creëren, en voeg ze toe aan de bodem van de tank met behulp van siliconenkit om de centrale arena te scheiden van de vier hoeken compartimenten. Verlaat 20 cm ruimte tussen de gebogen secties voor de installatie gate.
    2. Aparte naburige hoek compartimenten door het installeren van vier dubbele wanden wie 15 cm gaten, die extra elektrische isolatie en plaatsen voor onderwater sensoren zoals een hydrofoon bieden.
  5. Monteer vier gemotoriseerde poorten, en installeer ze tussen de hoek compartimenten en de centrale arena.
    1. Monteer vier deurkozijnen zoals weergegeven in figuur 1C. Maak zes putten (0,64 cm diep) op elke deurpost, insluiten nylon eikelnoten (draad diameter 0,64 cm) en zet ze vast met epoxy.
    2. Snijd vier deurpanelen uit acryl en rubber platen, en het creëren van zes gaten (0,64 cm diameter) op de acryl en rubberen panelen voor de vergrendeling. Word lid van de acryl en rubberen panelen met behulp van siliconen afdichting.
    3. Installeer acryl scharnieren aan de deurpanelen samen met de deurkozijnen.
    4. Mount swingende armen op servomotoren, en installeer ze op de top van de deurkozijnen (zie figuur 1C). Maak lussen met kabelbinders aan de zwenkarmen koppelen aan de deurpanelen.
    5. Plaats de poort assemblages op de gaps gemaakt tussen de gebogen wanddelen, en zet ze met behulp van siliconen afdichting.
    6. Verbind alle servomotoren een servo-controller, en sluit deze aan op een voedingsbron en een computer via een actieve USB-verlengkabel. Test de poorten met behulp van controle met de servo-controller meegeleverde software.
    7. Na de siliconen verhardt, controleren op waterdichtheid door het blokkeren van alle poorten met nylon schroeven en vullen van een compartiment op een moment.
  6. Isolatiekamer. Construct een isolatiekamer naar het aquarium omsingelen en te blokkeren externe bronnen van licht, geluid en elektrische ruis (zie figuur 1D).
    1. Maak drie wandpanelen (2 mx 2 mx 5 cm) en vier deurpanelen (1,9 mx 0,95 mx 5 cm). Voor elk paneel, join aluminium sierlijsten (5 cm x 2,5 cm) om een ​​rechthoekig frame te maken, en klinknagel een witte gegolfde kunststof paneel op het aluminium frame. Vul akoestische glasvezel batts in de panelen, en sluit af met een zwarte gegolfde kunststof paneel.
    2. Plaats drie wandpanelen op de anti-vibratie vloer, en installeer piano scharnieren aan de vier deurpanelen mee op de wandpanelen.
    3. Omringen de isolatiekamer met aluminium mazen, en gemalen mazen aan alle kanten om een ​​kooi van Faraday te maken.
  7. Luchtvochtigheid. Installeer een geluidsarme ventilator (Figuur 1F boven) om het overtollige vocht ophoping van verhitting. Plaats de ventilator ten minste 2 m afstand van de opname plaats, en installeer een luchtkanaal tussen de isolatiekamer en de afzuigventilator.
  8. Routinematig monitoren en de voorwaarden van de tank water en dieren te behouden.
    1. Zorg voor een constante water omstandigheden op 10 cm diepte, 100 mS / cm geleidbaarheid en pH 7,0 door toevoeging van water of zout stock oplossing (zie Knudsen 33 voor het recept). Voeg een zak met gemalen koraal indien de pH beneden 6,5.
    2. Installeer verticale aquarium filters die kunnen opereren vanuit ondiep water voor het reinigen enbeluchten doeleinden (Figuur 1F onderaan). Koppel de filters en neem ze uit de centrale arena tijdens de opname sessies.
    3. Lever levende meelwormen op de bodem van de tank door ze op zuignappen met elastiek. Vermijd vrij zwevende prooien zoals blackworms ongecontroleerde toevoer van verdwaalde prooien tijdens de opname te voorkomen.

2. EOD Tracking

  1. Elektroden installatie. Monteer acht grafiet elektroden, en ruimte ze even op de gebogen wand van de centrale arena.
    1. Verkrijgen tekening leads (15 cm lang; Mars Carbon 2 mm HB) en afscheren de buitenste schil van de leads.
    2. Snijd acht 10 cm segmenten van coaxkabel (RG-174), wikkel de kabel kern waaromheen het ene uiteinde van het grafiet staven, en toe te passen krimpkous over hen voor een sterke en stabiele elektrische aansluiting. Bevestig BNC jack-aansluitingen aan de tegenovergestelde uiteinden (Figuur 2A links).
    3. Plaats de elektroden op de muur met tape, en dunne reepjes van afplakband toepassing op de elektrode oppervlakken te beschermen tegen siliconen. Solliciteer siliconen afdichting niet permanent de elektroden, en verwijder alle tape voordat de siliconen verhardt (Figuur 2A rechts).
  2. Bouw acht bekabeling door de afstand van elke elektrode tot de versterkereenheid, en snijden coaxkabels (RG-54) in lengte. Bevestig BNC-connectors aan beide uiteinden van de kabels.
  3. Gebruik de kabel assemblies om alle elektroden aan te sluiten op de versterker. Differentieel versterken door het koppelen van twee 90 °-georiënteerde elektroden (zie figuur 2B), en op de grond alle coaxiale afscherming zijn door ze aan te sluiten op de kooi van Faraday.
  4. Stel de gain onder de verzadiging van het signaal te beperken, en pas een band-pass filter (200 Hz-5 kHz) om ruis te verwijderen. Digitaliseren van de vier registratie-elektrode paren bij 40 kS / sec.
  5. Onlinesignaalverwerking. De handleiding is geschreven voor de Spike2 software, en de parameter instellingen zijn geoptimaliseerd voor Gymnotus sp. (Zie figuur 2C voor samenvatting).
    1. Voeg een DC verwijderen proces (τ = 0,1 sec) om alle opnamen kanalen.
    2. Voeg een rectificeert proces om alle opnamen kanalen.
    3. Maak een virtueel kanaal door het optellen van alle vier de opname kanalen.
    4. Extract een unimodaal envelop per EOD puls door toevoeging van een RMS (root-mean-squared, figure-protocol-1 ) Proces (τ = 0,25 msec) aan de virtuele kanaal, voor het genereren van een enkele piek per EOD cyclus eenduidig ​​bepalen van de timing van pulsen.
    5. Maak een realmark kanaal uit de virtuele kanaal en noteer de tijd en de waarde van de piek amplitudes, na het instellen van een passende drempel om alle EOD pulsen wi vastleggenthout missen van een puls, terwijl valse positieven.
    6. Monitor de momentane EOD tarief in real-time door het kanaal weergave-optie van de realmark kanaal naar een momentane frequentie modus.
    7. Bewaken van de vis beweging in real-time door het dupliceren van de realmark kanaal, en de optie display om een golfvorm modus.
    8. Kwantificeren een activiteit niveau van de RMS van de EOD amplitude helling door het creëren van een virtueel kanaal van de realmark kanaal (0.01 sec bemonsteringsperiode), en voeg de helling (τ = 0,25 msec) en RMS (τ = 0,5 msec) processen.
    9. De realmark kanaal exporteren in de Spike2 software om de MATLAB-formaat.

3. Gesynchroniseerd Video Tracking

  1. Maak een achtergrond scene.
    1. Verberg een object dat een reflectie op het wateroppervlak door ze met een matte witte aanrecht film werpt.
    2. Installeer een matte wittegegolfde kunststof paneel 15 cm onder het plafond naar de camera en de ontluchter te verbergen.
    3. Print rasterpatronen op een groot vel wit papier voor het kalibreren van een camera, en leg het onder de tank een hoog contrast achtergrond bieden.
  2. Installeer lichtbronnen.
    1. Verkrijgen IR LED-verlichting en, verwijder ingebouwde ventilatoren om ruis te verminderen. Rijd de LED met een stroom-geregelde DC voeding buiten de kooi van Faraday geplaatst.
    2. Installeer IR LED-verlichting voor de beeldvorming in de duisternis, en witte LED-verlichting voor het besturen van een dagelijkse licht-cyclus in de test vis. Direct alle lichtbronnen naar het plafond te indirect en gelijkmatige verlichting (figuur 3A) te bereiken.
    3. Regelen de dagelijkse licht-cyclus door het rijden van de witte LED-lampen met een timer-gestuurde schakelaar (bijv. 12 uur on/12 uur uit).
  3. Installeer een camera recht boven het aquarium.
    1. Verkrijgen van een NIR-gevoelige camera, of verwijder een IR blocking filter van het breken van een dun vel van getint glas achter in het lenzensamenstel. Zorg ervoor dat de kijkhoek is breed genoeg om het imago van de hele centrale arena.
    2. Maak een kleine doorkijk in het midden van het plafondpaneel en plaats de camera recht boven het gat.
    3. Installeer een witte ring bewaker rond de lens als de lichtbronnen genereren blikken.
  4. Maak een time-gesynchroniseerde video-opname.
    1. Plaats een IR LED op een van de vier hoeken tank tijdsynchronisatiepulsen (1 msec duur, 10 sec periode) te genereren. Voeg een lastbegrenzers weerstand (1 kOhm) in serie, en rijden de IR LED's van een digitale output poort van de digitizer hardware.
    2. Gebruik video-opname-software meegeleverd met de camera, indien beschikbaar. Selecteer de hoogste opnamekwaliteit (bijv. lossless compressie) en de hoogste resoluties ondersteund.
    3. Start de video-opname onmiddellijk voor aanvang van de EOD opname, en stop de video-opname onmiddellijkdellijk na de EOD opname.
    4. Na de opname, zet het beeld framenummers aan de digitizer tijdseenheid door lineair interpoleren tussen de eerste en de laatste lichtpulsen gevangen genomen door het signaal digitizer en de video-opname.
  5. Geautomatiseerde beeldtracking
    De handleiding is geschreven voor de MATLAB Beeldverwerking toolbox, en gebruik maken van haar taken. Een aangepaste MATLAB script is voorzien van dit middel voor automatische image tracking.
    1. Importeer video. Importeer een video-opname-bestand rechtstreeks naar de MATLAB werkruimte met "Videoreader. Lezen" functie.
    2. Maak afbeelding een composiet achtergrond door het combineren van twee beeld frames. Vervang het beeldgebied bezet door een dier met een leegstaand beeld van dezelfde regio in een ander frame (zie figuur 3B).
    3. Geef een beeldgebied te volgen door het tekenen van een cirkelvormig masker rond de centrale arena om de een te sluitenrea buiten (Figuur 3B bodem), en vermenigvuldigen met een constante (r int) een minimumdrempel voor de intensiteit verschil ingesteld. Bijvoorbeeld, waarin rint = 0.85 zal de intensiteit fluctuaties onderdrukken 15% = - onder de achtergrond (1 r int).
    4. Beeldsubstractie. Trek een beeld frame (= IM k) van de achtergrondafbeelding (= IM 0) om verschil beeld (= ΔIM k) te verkrijgen. Gebruik unsigned integer numerieke precisie om het beeld intensiteit waarden als niet-negatieve gehele getallen op te slaan.
    5. Segment verschil afbeelding door toepassing van een intensiteit drempel bepaald uit de graythresh functie het. Reinig het binair beeld met behulp van de bwmorph functie en selecteer de grootste blob overeenkomt met een dier na het berekenen van alle blob gebieden met behulp van de regionprops functie.
    6. Bepaal het zwaartepunt en de grote oriëntatie eenXIS van de grootste blob door toepassing van de regionprops functie, en draai de afbeelding om de hoofdas met de x-as uitlijnen. Verdeel de afbeelding om de kop en staart delen op het zwaartepunt (Figuur 3D-top).
    7. Bepaal de hoofdas van het hoofd gedeelte, en draai de gehele afbeelding aan te sluiten bij de x-as (Figuur 3D linksonder). Fit begrenzingsvak vakken rond de kop en staart delen parallel aan hun grote assen met de regionprops functie.
    8. Bepaal de mediaan y-coördinaten van de blob links, midden en rechts verticale randen van de omsluitende kaders (groene stippen in figuur 3D bodem), en deze toewijzen aan vijf kenmerkende punten (hoofd-tip, mid-head, mid-body , mid-staart, staart-tip).
    9. Verwerken opeenvolgende frames na een beeld knippen frame gecentreerd in zwaartepunt van het dier bepaald uit haar vorige frame.
    10. Het hoofd oriëntatie handmatig toe te wijzen voor het eerste frame, en gebruik een dot-product between de oriëntatie vectoren van twee opeenvolgende frames om het hoofd oriëntatie automatisch te bepalen. Inspecteer het resultaat, en handmatig flip het hoofd oriëntatie als verkeerd wordt toegewezen.
  6. Plot een dier traject door toetreding tot de hoofd-tips, en glad met behulp van mediaan en gemiddelde filters (n = 3) als het een nerveuze uitstraling. Superimpose het traject met een achtergrondafbeelding en interpoleren vis middellijnen met behulp van de vijf kenmerkende punten (zie figuur 2E).
  7. Bereken de gemiddelde EOD snelheid elk beeld vastleggen keer door herbemonsteren de momentane EOD tarief (100 Hz sampling rate) en gemiddeld (0,0625 sec tijdvenster). Plot het traject in pseudo-kleuren bepaald uit de tijd afgestemd EOD tarief, en superponeren een achtergrondafbeelding (zie figuur 2F) met.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

EOD traceerresultaten

De opgenomen EOD golfvormen uit verschillende elektrodeparen gevarieerd in amplitudes en vormen zoals verwacht van hun unieke posities en oriëntaties (figuur 2C boven). Het gebruik van meerdere elektrodeparen gewaarborgd sterk signaal op alle mogelijke posities en oriëntaties van WEF in de tank. De envelop golfvorm (figuur 2C bodem, groen trace) altijd bevatte een enkele piek per EOD cyclus, die diende als een betrouwbare tijd marker voor ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Betekenis van onze technieken. Kortom, we voor het eerst beschreven de bouw van een groot aquarium tank en een isolatiekamer spontane verkennende gedrag geproduceerd door WEF observeren. Vervolgens hebben we aangetoond dat de techniek van het opnemen en het bijhouden van de EOD snelheid en beweging toestanden van ongebreidelde vis realtime met meerdere elektrodeparen. Tenslotte beschrijven we de infrarood video-opnametechniek door water in een tijd gesynchroniseerde wijze en beeldtracking algoritme om de lichaa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd mede mogelijk gemaakt door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) en de Canadese Institutes of Health Research (CIHR).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Aquarium Constructie
Elektrisch afgeschermde vloerverwarmingThermoSoft Corp., IL, USAThermoTilewww.thermosoft.com
Gehard glazen paneelgeneriek0,5 inch dik, gebruikt voor de aquariumconstructie
Siliconen van aquariumkwaliteitgeneriek 
Acryplaatgeneriek0,25 inch dik, mat wit
Natuurlijk rubberbladgeneriek0,25 inch dik
ServomotorHTECHRCD Inc., KoreaHS-325HB, 180 graden rotatiewww.servocity.com
ServomotorbevestigingHITECHRCD Inc., Korea56362 Large Splinewww.servocity.com
Servomotorcontroller (6 kanalen)SparkfunROB-09664Micro Maestro 6-kanaals USB Servo Controller
Actieve USB-verlengkabelC2G3899012 m USB 2.0 A-stekker naar A-aansluiting 4-poorts actieve verlengkabel
UitlaatventilatorNutoneILFK120www.homedepot.com
Verticale aquariumfilterTetra, DuitslandWhisper Internal Power Filter - 40i 
Gekneusd koraalGebruikt om de pH van het tankwater te verhogen
EOD Opname Setup
Grafiet elektrodenStaedtler, DuitslandMars Carbon 2-mm type HBSchrab de buitenlaag af
Fysiologische Versterker/FilterIntronix, Canada2015F 
Coaxiale kabelgeneriekRG174Voor de montage van elektroden
Coaxiale kabelgeneriekRG54Voor bedradingsgebruik
BNC-aansluiting voor RG-174Amphenol Connex112160Voor de montage van elektroden
BNC-stekker voor RG-54Amphenol Connex112116Voor bedradingsgebruik
SignaaldigitiseringshardwareCambridge Electronic Design, UKPower MKII 1401 
SignaaldigitiseringssoftwareCambridge Electronic Design, UKSpike 2. ver 7 
Visuele Tracking Setup
Witte LED-lichtIKEA, ZwedenDIODER 201.194.18www.ikea.com
Infrarood LED-licht (850 nm)Scene Electronics, ChinaS8100-60-B/C-IRVerwijder de ingebouwde ventilator
USB-webcamLogitech Inc., CA, USAC910Verwijder de infraroodblokkeringsfilter
Gemotoriseerde cameraLogitech Inc., CA, USAQuickcam OrbitVerwijder de infraroodblokkeringsfilter
Video-opnamesoftwareLogitech Inc., CA, USALogitech Quickcam SoftwareDownload van www.logitech.com
MATLABMathworks, MA, USA2012aImage Processing Toolbox

Referenties

  1. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  3. Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., De Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).
  4. Naumann, E. A., Kampff, A. R., Prober, D. A., Schier, A. F., Engert, F. Monitoring neural activity with bioluminescence during natural behavior. Nat. Neurosci. 13 (4), 513-520 (2010).
  5. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 147-152 (2011).
  6. Mavoori, J., Millard, B., Longnion, J., Daniel, T., Diorio, C. A miniature implantable computer for functional electrical stimulation and recording of neuromuscular activity. In IEEE international workshop on biomedical circuits and systems (BioCAS) 2004; Session: Functional Electrical Stimulators and Related Sensing Techniques. , (2004).
  7. Harrison, R. R., Fotowat, H., Chan, R., Kier, R. J., Olberg, R., Leonardo, A., Gabbiani, F. Wireless neural/EMG telemetry systems for small freely moving animals. IEEE TBioCAS. 5 (2), 103-111 (2011).
  8. Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Precision measurement of electric organ discharge timing from freely moving weakly electric fish. J. Neurophys. 107 (7), 1996-2007 (2012).
  9. Forlim, C. G., Pinto, R. D. Noninvasive Realistic Stimulation/Recording of Freely Swimming Weakly Electric Fish: Movement Detection and Discharge Entropy to Infer Fish Behavior. , (2012).
  10. Caputi, A. A., Aguilera, P. A., Castelló, M. E. Probability and amplitude of novelty responses as a function of the change in contrast of the reafferent image in G. carapo. J. Exp. Biol. 206 (6), 999-1010 (2003).
  11. Pluta, S. R., Kawasaki, M. Multisensory enhancement of electromotor responses to a single moving object. J. Exp. Biol. 211 (18), 2919-2930 (2008).
  12. Heiligenberg, W. Electrolocation and jamming avoidance in a Hypopygus (Rhamphichthyidae, Gymnotoidei), an electric fish with pulse-type discharges. J. Comp. Phys. A. 91 (3), 223-240 (1974).
  13. Capurro, A., Malta, C. P. Noise autocorrelation and jamming avoidance performance in pulse type electric fish. Bull. Math. Biol. 66 (4), 885-905 (2004).
  14. Post, N., von der Emde, G. The "novelty response" in an electric fish: response properties and habituation. Phys. Behav. 68 (1), 115-128 (1999).
  15. Toerring, M. J., Serrier, J. Influence of water temperature on the electric organ discharge (EOD) of the weakly electric fish Marcusenius cyprinoides (Mormyridae). J. Exp. Biol. 74 (1), 133-150 (1978).
  16. Ardanaz, J. L., Silva, A., Macadar, O. Temperature sensitivity of the electric organ discharge waveform in Gymnotus carapo. J. Comp. Phys. A. 187 (11), 853-864 (2001).
  17. Rodríguez-Cattaneo, A., Pereira, A. C., Aguilera, P. A., Crampton, W. G., Caputi, A. A. Species-specific diversity of a fixed motor pattern: the electric organ discharge of Gymnotus. PLoS One. 3 (5), (2008).
  18. Bennett, M. V. L. Fish physiology. Hoar, W. S., Randall, D. J. , Academic Press. NY. 493-574 (1971).
  19. Wong, C. J. Afferent and efferent connections of the diencephalic prepacemaker nucleus in the weakly electric fish, Eigenmannia virescens: interactions between the electromotor system and the neuroendocrine axis. J. Comp. Neurol. 383 (1), 18-41 (1997).
  20. Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Real-time localization of moving dipole sources for tracking multiple free-swimming weakly electric fish. PLoS One. 8 (6), (2013).
  21. Rasnow, B., Assad, C., Hartmann, M. J., Bower, J. M. Applications of multimedia computers and video mixing to neuroethology. J. Neuro. Methods. 76 (1), 83-91 (1997).
  22. MacIver, M. A., Nelson, M. E. Body modeling and model-based tracking for neuroethology. J. Neuro. Methods. 95 (2), 133-143 (2000).
  23. Douglas, R. H., Hawryshyn, C. W. Behavioral studies of fish vision: an analysis of visual capabilities. In The Visual System of Fish. Douglas, R., Djamgoz, M. , Chapman & Hall. London. 373-418 (1990).
  24. Ciali, S., Gordon, J., Moller, P. Spectral sensitivity of the weakly discharging electric fish Gnathonemus petersi using its electric organ discharges as the response measure. J. Fish Biol. 50 (5), 1074-1087 (1997).
  25. Ratledge, D. An Introduction to Webcam Imaging. Digital Astrophotography: The State of the Art. , 31-44 (2005).
  26. Hofmann, V., Sanguinetti-Scheck, J. I., Gómez-Sena, L., Engelmann, J. From static electric images to electric flow: Towards dynamic perceptual cues in active electroreception. J. Phys. Paris. 107, 95-106 (2013).
  27. Castelló, M. E., Aguilera, P. A., Trujillo-Cenóz, O., Caputi, A. A. Electroreception in Gymnotus carapo: pre-receptor processing and the distribution of electroreceptor types. J. Exp. Biol. 203 (21), 3279-3287 (2000).
  28. Caputi, A. A., Castelló, M. E., Aguilera, P., Trujillo-Cenóz, O. Electrolocation and electrocommunication in pulse gymnotids: signal carriers, pre-receptor mechanisms and the electrosensory mosaic. J. Phys. 96 (5), 493-505 (2002).
  29. Pusch, R., et al. Active sensing in a mormyrid fish: electric images and peripheral modifications of the signal carrier. J. Exp. Biol. 211 (6), 921-934 (2008).
  30. Harder, W. Die beziehungen zwischen elektrorezeptoren, elektrischem organ, seitenlinienorganen und nervensystem bei den Mormyridae (Teleostei, Pisces). Z. Vgl. Physiol. 59 (3), 272-318 (1968).
  31. Bacelo, J., Engelmann, J., Hollmann, M., Gvonder Emde,, Grant, K. Functional foveae in an electrosensory system. J. Comp. Neurol. 511 (3), 342-359 (2008).
  32. Hollmann, M., Engelmann, J., Von Der Emde, G. Distribution, density and morphology of electroreceptor organs in mormyrid weakly electric fish: anatomical investigations of a receptor mosaic. J. Zool. 276 (2), 1469-7998 (2008).
  33. Knudsen, E. I. Spatial aspects of electric fields generated by weakly electric fish. J. Comp. Phys. 99 (2), 103-118 (1975).
  34. Kramer, B. Spontaneous discharge rhythms and social signalling in the weakly electric fish Pollimyrus isidori (Cuvier et Valenciennes) (Mormyridae, Teleostei). Behav. Ecol. Sociobiol. 4 (1), 66-74 (1978).
  35. Stoddard, P. K., Markham, M. R., Salazar, V. L., Allee, S. Circadian rhythms in electric waveform structure and rate in the electric fish Brachyhypopomus pinnicaudatus. Physiol. Behav. 90 (1), 11-20 (2007).
  36. Canfield, J. G. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. J. Neurosci. Methods. 133 (1-2), 127-134 (2004).
  37. Chen, L., House, J. L., Krahe, R., Nelson, M. E. Modeling signal and background components of electrosensory scenes. J. Comp. Physiol. A. 191 (4), 331-345 (2005).
  38. Emran, F., Rihel, J., Dowling, J. E. A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities. J. Vis. Exp. (20), (2008).
  39. Windsor, S. P., Tan, D., Montgomery, J. C. Swimming kinematics and hydrodynamic imaging in the blind Mexican cave fish (Astyanax fasciatus). J. Exp. Biol. 211 (18), 2950-2959 (2008).
  40. Shapiro, L. G., Stockman, G. C. Computer vision. , Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. 367-368 (2001).
  41. Hedrick, T. L. Software techniques for two- and three-dimensional kinematic measurements of biological and biomimetic systems. Bioinsp. Biomim. 3 (3), 034001 (2001).
  42. Babineau, D., Lewis, J. E., Longtin, A. Spatial acuity and prey detection in weakly electric fish. PLoS Comp. Biol. 3 (3), (2007).
  43. Sanguinetti-Scheck, J. I., Pedraja, E. F., Cilleruelo, E., Migliaro, A., Aguilera, P., Caputi, A. A., Budelli, R. Fish geometry and electric organ discharge determine functional organization of the electrosensory epithelium. PLoS One. 6 (11), (2011).
  44. Castello, M. E., Caputi, A., Trujillo‐Cenóz, O. Structural and functional aspects of the fast electrosensory pathway in the electrosensory lateral line lobe of the pulse fish Gymnotus carapo. J. Comp. Neurol. 401 (4), 549-563 (1998).
  45. Canfield, J. G., Mizumori, S. J. Y. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. J. Neurosci. Methods. 133 (1), 127-134 (2004).
  46. Pereira, A. C., Centurión, V., Caputi, A. A. Contextual effects of small environments on the electric images of objects and their brain evoked responses in weakly electric fish. J. Exp. Biol. 208 (5), 961-972 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Elektrische orga Fontsontladingsensorische isolatiekamerinfraroodbeeldvormingsignaalverwerkinggeautomatiseerde trackingspontaan gedragaquatische arenamultikanaalsregistratie
Langdurige Behavioral Tracking van Vrij Zwemmen Zwak Electric Fish
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.