Zoogdierlijke cellen die het bacteriële bioluminescentie gencassette ( Lux) Produceren licht autonoom. De resulterende bioluminescente dynamieken chemische belasting is aangetoond dat de behandeling effecten op celgroei en metabolisme weerspiegelen, waardoor deze cellen een goedkoop, continu real-time toxiciteit screening instrument dat gemakkelijk kan worden aangepast voor high-throughput automatisering.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Autonoom Bioluminescente zoogdiercellen voor continue en real-time monitoring van de cytotoxiciteit
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Zoogdiercel gebaseerde in vitro assays zijn alom toegepast als alternatieven voor dierproeven voor toxicologische studies, maar zijn beperkt door de hoge monetaire en tijd kosten parallelle monstervoorbereiding die noodzakelijk vanwege het destructieve karakter van vuurvlieg luciferase gebaseerde screeningswerkwijzen . Deze video beschrijft het gebruik van autonoom bioluminescent zoogdiercellen, die niet van de destructieve toevoeging van luciferine substraat als een goedkope en gemakkelijke werkwijze voor het bewaken van de cytotoxische effecten van een verbinding van interesse. Zoogdiercellen stabiel tot expressie volledige bacteriële bioluminescentie (luxCDABEfrp) gencassette autonoom produceren van een optisch signaal dat pieken bij 490 nm zonder toevoeging van een dure en mogelijk storende luciferine substraat excitatie door een externe energiebron, of vernietiging van het monster die traditioneel uitgevoerd bij optische beeldopnames. Deze onafhankelijkheid van externe stimulatie legt de last voor het handhaven van de bioluminescente reactie op de enkele cel, hetgeen betekent dat het resulterende signaal alleen wordt gedetecteerd tijdens actieve stofwisseling. Deze eigenschap maakt het lux-expressie cellijn een uitstekende kandidaat voor gebruik als biosentinel tegen cytotoxische effecten omdat veranderingen in bioluminescent productie wijzen op negatieve effecten op celgroei en metabolisme. Ook de autonome karakter en het ontbreken van de vereiste monster vernietiging toelaat herhaalde beeldvorming van hetzelfde monster in real-time gedurende de periode van blootstelling toxisch en kan over meerdere monsters met behulp van bestaande beeldvormende apparatuur op een geautomatiseerde manier worden uitgevoerd.
Inleiding
In de VS, geneesmiddelen en andere producten voor menselijke consumptie bestemde vereisen uitgebreide evaluatie voordat ze worden goedgekeurd voor gebruik door de consument door de Food and Drug Administration. De financiële last voor het uitvoeren van deze tests is bovenaan de ontwikkelaar 1, die de kosten van de nieuwe compound ontwikkeling en dus aanzienlijk meer vertaalt in een hogere kosten voor de consument. Terwijl traditioneel veel van deze screening heeft proefdieren gebruikt om te fungeren als proxy's voor de menselijke gastheren, heeft dit bewezen een grote financiële last te zijn, met een geschatte $ 2800000000 jaarlijks besteed aan ADME / Tox (adsorptie, distributie, metabolisme, excretie en toxiciteit ) screening alleen 2 en steeds meer bewijs suggereert dat diermodellen niet betrouwbaar kunnen voorspellen humaantoxicologische reacties 3. Daarom is in vitro humane celkweek-based testing heeft aan populariteit gewonnen in de afgelopen twee decennia vanwege de relatief lagerekosten, hogere doorvoer en betere vertegenwoordiging van menselijke biologische beschikbaarheid en toxicologie 4. Voor celcultuur-toxiciteitstests screeningmethoden verschillende eindpunten, zoals het meten van ATP, het screenen van de activiteit van endogeen beschikbaar cytoplasmatische enzymen, sonderen van de integriteit van het celmembraan, of het bijhouden van het niveau van mitochondriale activiteit, cellulaire viabiliteit 5 , 6. Ongeacht het gekozen eindpunt deze werkwijzen vereisen alle de vernietiging van het monster voor metingen kunnen worden verricht, zodat enige producerende data op een tijdstip. Als gevolg hiervan, grote aantallen monsters moeten worden voorbereid en behandeld in parallel voor basis toxicologische kinetiek studies, opnieuw toe te voegen aan de kosten en de arbeid die nodig is voor de nieuwe compound ontwikkeling. Als alternatief testen met behulp van luciferase uitgescheiden zoals Gaussia luciferase 7, Vargula luciferase 8, en Metridia luciferase 9ontwikkeld die de behoefte aan cellysis elimineren en vereisen een fractie van de media eindpunt meting, maar deze zijn nog steeds beperkt tot bemonstering op vooraf bepaalde punten en ook de toevoeging van exogene substraten activerende licht vereisen.
Ten nadele van vereiste monster vernietiging en de kosten van substraten elimineren vermijden is een humane cellijn gemanipuleerd dat drukt de volledige bacteriële bioluminescentie (lux) gen cassette (luxCDABEfrp) om voor continue bewaking van levende cellen die vergelijkbaar aan fluorescente kleurstof-gebaseerde live cell imaging, maar zonder de extra foton-activerende en microscopisch onderzoek procedures. Deze cellijn kan constitutief produceren van een optisch signaal voor continue, directe detectie zonder de noodzaak van externe stimulatie, waardoor vernietiging van het monster te voorkomen. Mechanistisch, de lichtgevende signaal gegenereerd uit deze cellen leidens wanneer de luxAB gevormde luciferase-enzym katalyseert de oxidatie van een langketenige aldehyde (gesynthetiseerd en geregenereerd door de luxCDE genproducten met endogene substraten) in de aanwezigheid van verlaagde riboflavine fosfaat (FMNH 2, die gerecycleerd uit FMN de frp gen product) en moleculaire zuurstof 10. Expressie van de lux-cassette in de gastheercel kan ook licht te produceren en gedetecteerd zonder cellulaire vernietiging of exogeen substraatadditie. Ook de interactie tussen de lux genen en endogeen beschikbare FMN en O2 cosubstrates, en het vereiste van behoud van een omgeving die de omzetting van FMN tot FMNH 2 kan ondersteunen, zodat de resulterende bioluminescente signaal alleen worden waargenomen levende , metabool actieve cellen.
Deze eisen zijn eerder misbruikt om aan te tonen dat de lux-based bioluminescerende uitgang sterk correleert met cellulaire bevolking maat 11 en dat toxische verbinding blootstelling schaadt autobioluminescent productie in een dosis-response mode 12. Hier gebruiken we een eerder gekarakteriseerde autobioluminescent menselijke embryonale niercellen (HEK293) cellijn 11 de automatische toxicologische screening van antibiotica van de bleomycine familie met bekende DNA beschadigende activiteit als een representatief voorbeeld van de toepassing van autobioluminescent zoogdiercellen toxiciteit valideren tonen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Cell Preparation
- Haal een flacon bioluminescent HEK293 cellen van vloeibare stikstof ingevroren voorraad en ze groeien in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum, 0,01 mM niet-essentiële aminozuren, 1x antibioticum-antimycoticum en 0,01 mM natrium pyruvaat in een T 75 weefselkweek kolf bij 37 ° C en 5% CO2.
Opmerking: De media en de aanvullende componenten zullen variëren op basis van cellijnen en moet daarom dienovereenkomstig worden gekozen. - Vernieuwen medium om de 2-3 dagen tot verstrekkende ~ 80% confluentie.
Opmerking: De hoeveelheid cellen vereist zijn op basis van het experimentele design. Indien nodig, kan meer cellen worden verkregen door een subcultuur. - Oogst cellen te testen.
- Verwijder het medium en was de cellen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) onder voorzichtig schudden de kolf en vervolgens ontdoen van de uitgegeven PBS.
- Voeg trypsine en incubeer bij 37 ° C gedurende 2 min,of totdat de cellen losgemaakt van de fles.
- Verzamel de vrijstaande cellen in PBS en breng ze in een schone centrifugebuis.
Opmerking: Als hechtende cellijnen worden gebruikt, afzonderlijke cellen door centrifugeren en eenmaal wassen met PBS.
- Bepaal het totale aantal cellen met behulp van een hemacytometer of andere mobiele telsysteem.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 300 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in verse, voorverwarmde medium.
- Zaad gelijke aantallen cellen in afzonderlijke putjes van een ondoorzichtige multi-well plaat. In dit voorbeeld plaat 5 x 10 5 cellen in een volume van 1 ml in elk putje van een zwarte 24-wells plaat. Plaat een gelijk volume medium in drievoudige putjes te treden als de negatieve controle.
Opmerking: Het aantal cellen uitgeplaat in elk putje is flexibel en kan worden geoptimaliseerd voor afzonderlijke experimenten. Voor elke bioluminescerende cellijn, experimenteel de verhouding tussen het aantal cellen en biolumi bepalennescent uitgang, alsmede de minimale detecteerbare celtelling vóór het toxiciteitstests. Om deze, maatregel bioluminescentie doen over een breed scala van maten bevolking (bijvoorbeeld 1 x 03-01 oktober x 10 6 cellen) onder gestandaardiseerde condities beeldvorming. - Behandel cellen met testen verbinding (en) zoals hieronder beschreven.
2. Chemische Voorbereiding
- Bereid de geteste chemische verbinding als een geconcentreerde stockoplossing. In dit voorbeeld gebruikt een 100 mg / ml voorraadoplossing van antibiotica van de bleomycine familie.
Opmerking: Om potentiële voertuig gebaseerde toxische effecten te minimaliseren, vooral wanneer een organisch oplosmiddel wordt gebruikt als middel voor chemische Bovendien wordt aanbevolen dat de voorraad concentratie ten minste 1000 maal de gewenste concentratie na toepassing. - Voeg de bereide chemische stock direct aan de cellen. In dit voorbeeld de dosis antibioticum plaats in eindconcentraties van 100, 200, 300 en 400 ug / ml in trigeplooid putten. Vertrekken drie putten van cellen onbehandeld als controles.
Opmerking: De uiteindelijke concentratie van de doelwit chemische moet worden afgestemd op specifieke experimentele doelen. Een breed scala aan concentraties getest normaliter een volledig spectrum van de toxische effecten te verkrijgen.
3. Imaging en data-analyse
- Onmiddellijk na chemische toevoeging, plaats de plaat in de beeldvorming kamer van geschikte instrument voor het verwerven en bioluminescentie meting.
- Maatregel bioluminescentie elke 15 min over een 24-uurs periode met behulp van een 10 min integratietijd voor elke meting.
Opmerking: De integratietijd in dit voorbeeld op een per-plaat basis en kan worden aangepast voor meting op een per-well basis met andere luminometers keuze. De integratietijd kan ook worden aangepast op basis van de gekozen bioluminescentie cellijn. Omdat bioluminescentie wordt autonoom geproduceerd zonder cel vernietiging of elke externe stimulatie, leesgen kan op elk gewenst tijdstip worden genomen om proefondervindelijke doelstellingen. - Kwantificeren van de lichtgevende intensiteit van elk putje door het identificeren van een regio van belang met compatibele software. Weer de lichtopbrengst hetzij als de totale flux (fotonen / seconde) of de gemiddelde straling (fotonen / seconde / cm 2 / steridian) van elk monster.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In deze studie werden de dynamiek van autobioluminescent HEK293 cellen continu gevolgd gedurende een 24 uurs periode in reactie op antibiotica blootstelling (Figuur 1). De toxische effecten van deze antibiotica, die een lid van de familie bleomycine bekend om levende cellen te doden door binding aan en splitsen van DNA 13 werden aangetoond door een daling van bioluminescent productie in vergelijking met onbehandelde cellen, die direct gevisualiseerd kunnen worden door de pseudocolor afbeeldin...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze werkwijze toont het gebruik van autonoom bioluminescent zoogdiercellen als in vitro cytotoxiciteit screeningstest waarmee levende cellen continu worden gevolgd gedurende hun leven. Dit protocol is flexibel en kunnen worden aangepast aan specifieke experimentele omstandigheden geschikt als vereist. Bijvoorbeeld, de hier gepresenteerde experiment is geschikt voor het volgen van acute toxische effecten, maar kan worden aangepast aan traag of lange termijn effecten te evalueren door herhaaldelijk beeldvorming ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
DM Close, SA Ripp, en GS Sayler zijn oprichters en eigenaren van 490 Biotech, Inc
Dankbetuigingen
Deze onderzoeksinspanningen werden gesteund door de National Science Foundation gebied Chemische, Biotechniek, Milieu en Vervoer (CBET) Systemen onder award nummers CBET-0853780 en CBET-1159344 en de National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) onder award nummer 1R43ES022567-01, en het National Cancer Institute, Cancer beeldvormingsprogramma onder award nummer CA127745-01. De IVIS Lumina instrument gebruikt in dit werk werd verkregen van het Amerikaanse leger Defense University Research Instrumentatie Program.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Andere IVIS modellen en PMT-gebaseerde plaatlezers kunnen ook worden gebruikt | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Nieuwere updates van deze software zijn beschikbaar | |
| 75 cm2 celkweek behandelde kolven | Corning | 430641 | |
| 6-wells weefselkweek behandelde platen | Costar | 07-200-83 | |
| Zwarte 24-wells plaat | Greiner Bio-One | 662174 | 96- of 384-wells platen kunnen worden gebruikt voor toepassingen met hogere doorvoer |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Gemodificeerd Eagle's Medium (DMEM), fenolrood-vrij | Hyclone | SH30284 | |
| Foetaal bovien serum | Hyclone | SH3091003 | |
| Niet-essentiële aminozuren, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antibioticum-antimycoticum, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| Natriumpyruvaat, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocijn, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Trypsine, 0,05% | Life Technologies | 25300062 |
Referenties
- U.S. Food and Drug Administration. Is it really FDA approved? FDA Consumer Health Information. 2, (2009).
- Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharmacol. 32, 56-67 (2000).
- Stacey, G. Current developments in cell culture technology. Adv. Exp. Med. Biol. 745, 1-13 (2012).
- Li, A. P. Screening for human ADME/Tox drug properties in drug discovery. Drug Discov. Today. 6, 357-366 (2001).
- Li, A. P. In vitro approaches to evaluate ADMET drug properties. Curr. Top. Med. Chem. 4, 701-706 (2004).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat. Protoc. 4, 582-591 (2009).
- Thompson, E. M., Nagata, S., Tsuji, F. I. Cloning and expression of cDNA for the luciferase from the marine ostracod Vargula hilgendorfii. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 6567-6571 (1989).
- Lupold, S. E., Johnson, T., Chowdhury, W. H., Rodriguez, R. A real time Metridia luciferase based non-invasive reporter assay of mammalian cell viability and cytotoxicity via the beta-actin promoter and enhancer. PLoS ONE. 7, (2012).
- Meighen, E. A. Molecular biology of bacterial bioluminescence. Microbiol. Rev. 55, 123-142 (1991).
- Close, D. M., et al. Autonomous bioluminescent expression of the bacterial luciferase gene cassette (lux) in a mammalian cell line. PLoS ONE. 5, e12441(2010).
- Determining toxicant bioavailability using a constitutively bioluminescent human cell line. Close, D. M., Hahn, R. E., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Biomedical Sciences and Engineering Conference (BSEC), Mar 15-17, Knoxville, TN, , 1-4 (2011).
- Oliva-Trastoy, M., Defais, M., Larminat, F. Resistance to the antibiotic Zeocin by stable expression of the Sh ble gene does not fully suppress Zeocin-induced DNA cleavage in human cells. Mutagenesis. 20, 111-114 (2005).
- Close, D. M., Webb, J. D., Ripp, S. A., Patterson, S. S., Sayler, G. S. Remote detection of human toxicants in real time using a human optimized bioluminescent bacterial luciferase gene cassette bioreporter. Proc. SPIE 8371, Sensing Technologies for Global Health, Military Medicine, Disaster Response, and Environmental Monitoring II; and Biometric Technology for Human Identification IX. 837117, (2012).
- Close, D. M., Hahn, R. E., Patterson, S. S., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Comparison of human optimized bacterial luciferase, firefly luciferase, and green fluorescent protein for continuous imaging of cell culture and animal models. J. Biomed. Opt. 16, e12441(2011).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
