Autonoom Bioluminescente zoogdiercellen voor continue en real-time monitoring van de cytotoxiciteit

Samenvatting

Zoogdierlijke cellen die het bacteriële bioluminescentie gencassette ( Lux) Produceren licht autonoom. De resulterende bioluminescente dynamieken chemische belasting is aangetoond dat de behandeling effecten op celgroei en metabolisme weerspiegelen, waardoor deze cellen een goedkoop, continu real-time toxiciteit screening instrument dat gemakkelijk kan worden aangepast voor high-throughput automatisering.

Samenvatting

Zoogdiercel gebaseerde in vitro assays zijn alom toegepast als alternatieven voor dierproeven voor toxicologische studies, maar zijn beperkt door de hoge monetaire en tijd kosten parallelle monstervoorbereiding die noodzakelijk vanwege het destructieve karakter van vuurvlieg luciferase gebaseerde screeningswerkwijzen . Deze video beschrijft het gebruik van autonoom bioluminescent zoogdiercellen, die niet van de destructieve toevoeging van luciferine substraat als een goedkope en gemakkelijke werkwijze voor het bewaken van de cytotoxische effecten van een verbinding van interesse. Zoogdiercellen stabiel tot expressie volledige bacteriële bioluminescentie (luxCDABEfrp) gencassette autonoom produceren van een optisch signaal dat pieken bij 490 nm zonder toevoeging van een dure en mogelijk storende luciferine substraat excitatie door een externe energiebron, of vernietiging van het monster die traditioneel uitgevoerd bij optische beeldopnames. Deze onafhankelijkheid van externe stimulatie legt de last voor het handhaven van de bioluminescente reactie op de enkele cel, hetgeen betekent dat het resulterende signaal alleen wordt gedetecteerd tijdens actieve stofwisseling. Deze eigenschap maakt het lux-expressie cellijn een uitstekende kandidaat voor gebruik als biosentinel tegen cytotoxische effecten omdat veranderingen in bioluminescent productie wijzen op negatieve effecten op celgroei en metabolisme. Ook de autonome karakter en het ontbreken van de vereiste monster vernietiging toelaat herhaalde beeldvorming van hetzelfde monster in real-time gedurende de periode van blootstelling toxisch en kan over meerdere monsters met behulp van bestaande beeldvormende apparatuur op een geautomatiseerde manier worden uitgevoerd.

Inleiding

In de VS, geneesmiddelen en andere producten voor menselijke consumptie bestemde vereisen uitgebreide evaluatie voordat ze worden goedgekeurd voor gebruik door de consument door de Food and Drug Administration. De financiële last voor het uitvoeren van deze tests is bovenaan de ontwikkelaar ^1, die de kosten van de nieuwe compound ontwikkeling en dus aanzienlijk meer vertaalt in een hogere kosten voor de consument. Terwijl traditioneel veel van deze screening heeft proefdieren gebruikt om te fungeren als proxy's voor de menselijke gastheren, heeft dit bewezen een grote financiële last te zijn, met een geschatte $ 2800000000 jaarlijks besteed aan ADME / ....

Protocol

1. Cell Preparation

1. Haal een flacon bioluminescent HEK293 cellen van vloeibare stikstof ingevroren voorraad en ze groeien in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum, 0,01 mM niet-essentiële aminozuren, 1x antibioticum-antimycoticum en 0,01 mM natrium pyruvaat in een T ₇₅ weefselkweek kolf bij 37 ° C en 5% _CO2.
   Opmerking: De media en de aanvullende componenten zullen variëren op basis van cellijnen en moet daarom dienovereenkomstig worden gekozen.
2. Vernieuwen medium om de 2-3 dagen tot verstrekkende ~ 80% confluentie.
   Opmerking: De hoeveelheid cellen vereist zi....

Resultaten

In deze studie werden de dynamiek van autobioluminescent HEK293 cellen continu gevolgd gedurende een 24 uurs periode in reactie op antibiotica blootstelling (Figuur 1). De toxische effecten van deze antibiotica, die een lid van de familie bleomycine bekend om levende cellen te doden door binding aan en splitsen van DNA ¹³ werden aangetoond door een daling van bioluminescent productie in vergelijking met onbehandelde cellen, die direct gevisualiseerd kunnen worden door de pseudocolor afbeeldin.......

Discussie

Deze werkwijze toont het gebruik van autonoom bioluminescent zoogdiercellen als in vitro cytotoxiciteit screeningstest waarmee levende cellen continu worden gevolgd gedurende hun leven. Dit protocol is flexibel en kunnen worden aangepast aan specifieke experimentele omstandigheden geschikt als vereist. Bijvoorbeeld, de hier gepresenteerde experiment is geschikt voor het volgen van acute toxische effecten, maar kan worden aangepast aan traag of lange termijn effecten te evalueren door herhaaldelijk beeldvorming .......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
IVIS Lumina	PerkinElmer		Andere IVIS modellen en PMT-gebaseerde plaatlezers kunnen ook worden gebruikt
Living Imaging 2.0	PerkinElmer		Nieuwere updates van deze software zijn beschikbaar
75 cm2 celkweek behandelde kolven	Corning	430641
6-wells weefselkweek behandelde platen	Costar	07-200-83
Zwarte 24-wells plaat	Greiner Bio-One	662174	96- of 384-wells platen kunnen worden gebruikt voor toepassingen met hogere doorvoer
Fosfaat gebufferde zoutoplossing	Hyclone	SH30910
Dulbecco's Gemodificeerd Eagle's Medium (DMEM), fenolrood-vrij	Hyclone	SH30284
Foetaal bovien serum	Hyclone	SH3091003
Niet-essentiële aminozuren, 100x	Life Technologies	11140050
Antibioticum-antimycoticum, 100x	Life Technologies	15240062
Natriumpyruvaat, 100mM	Life Technologies	11360070
Zeocijn, 100 mg/ml	Life Technologies	R25001
Trypsine, 0,05%	Life Technologies	25300062