Een innovatieve methode voor exosome kwantificering en Size Measurement

Samenvatting

In dit artikel wordt een methode gepresenteerd voor het isoleren van exosomen uit vol bloed en verdere analyse door middel van nanodeeltjestracking met behulp van een semi-automatisch instrument. De gepresenteerde technologie biedt een uiterst gevoelige methode voor het visualiseren en analyseren van deeltjes in vloeibare suspensie.

Samenvatting

Hoewel de biologische belangrijkheid van exosomen recentelijk steeds meer wetenschappelijke en klinische aandacht heeft gekregen, is er nog veel onbekend over hun complexe paden, hun biologische beschikbaarheid en hun diverse functies in gezondheid en ziekte. Huidig werk richt zich op de aanwezigheid en het gedrag van exosomen (in vitro evenals in vivo) in de context van verschillende menselijke aandoeningen, vooral op het gebied van oncologie, gynaecologie en cardiologie.

Helaas bestaat er noch een consensus over een gouden standaard voor exosome-isolatie, noch is er een overeenstemming over een dergelijke methode voor hun kwantitatieve analyse. Aangezien er veel methoden zijn voor de zuivering van exosomen en ook veel mogelijkheden zijn voor hun kwantitatieve en kwalitatieve analyse, is het moeilijk om een combinatie van methoden voor de ideale benadering te bepalen.

Hier demonstreren we nanoparticle tracking analyse (NTA), een semi-geautomatiseerde methode voor de karakterisering van exosomen na isolatie uit menselijk plasma door ultracentrifugering. De gepresenteerde resultaten laten zien dat deze benadering voor isolatie, evenals de bepaling van het gemiddelde aantal en de grootte van exosomen, reproduceerbare en geldige gegevens oplevert, zoals bevestigd door andere methoden, zoals scanning elektronenmicroscopie (SEM).

Inleiding

De exacte functie van circulerende exosomes bleef onbekend lange tijd. Zelfs nu het volledige pad mechanisme exosomes is niet volledig begrepen. Sinds exosomen dragen antigenen, eiwitten en RNA (mRNA en miRNA) die hen betrekking heeft op hun ouderlijke cel van herkomst, hun functie als cel-cel signalering zenders heeft vooral prioriteit gegeven.

Vele verschillende werkwijzen in de literatuur beschreven voor de isolatie en kwantitatieve detectie van exosomes ^1,2. Er is echter geen consensus over een 'gouden standaard' is bereikt. Inmiddels is de meerderheid van de wetenschappers die actief zijn op het gebied van exosome onderzoek het erover eens dat een consistente methode van isolatie zeer gerechtvaardigd is om een ​​hogere mate van vergelijkbaarheid van de verschillende rapporten en studies te bereiken.

Fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) is de meest voorkomende en voorkomende instrument exosome analyse ^3. FACS heeft de BenEFIT dat via fluorescentie labeling cellen van verschillende oorsprong kunnen worden vergeleken in een stap. De belangrijkste nadelen van FACS zijn dat deze methode niet gevoelig genoeg om deeltjes kleiner dan 0,5 pm ⁴ identificeren, terwijl exosomes algemeen tussen 30-120 nm in diameter ^5, nog minder om hun grootte te meten.

Scanning elektronenmicroscopie (SEM) en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) zijn andere instrumenten voor het analyseren van deeltjesgrootte en morfologie van exosomes. Zowel SEM en TEM hebben het nadeel dat monstervoorbereiding is tijdrovend, beide werkwijzen omvatten arbeidsintensieve stappen en elk enig risico artefact generatie. Noch methode is geschikt voor hoge sample throughput en karakterisering van verschillende duizenden enkele deeltjes van één monster. Bovendien is een kwantitatieve analyse van klinische dagelijkse routine waar monsters vaak gelijktijdig of tenminste geanalyseerd in een zeer korte periodemoeilijk uit te voeren. Nieuwe generatie technieken maken ons nu op exosomen analyseren zonder voorafgaande intensieve voorbereidende werkzaamheden (bijvoorbeeld milieu SEM). Deze moderne technieken zijn nog steeds vrij lastig voor het analyseren van grote hoeveelheden suspensies die exosomen om hun gemiddelde aantal en de grootte distributie ⁶ te bepalen.

Een andere zeer gevoelige werkwijze voor visualisatie en analyse van exosomes is nanodeeltjes bijhouden analyse (NTA). Deze methode maakt gebruik van twee verschillende principes van de fysica. Eerst worden deeltjes gedetecteerd door het verstrooide licht wanneer ze worden bestraald met een laserbundel. Het tweede fenomeen is bekend als Brownse beweging, volgens welke de diffusie van verschillende deeltjes in een vloeibare suspensie is omgekeerd evenredig met hun omvang. In het laatste geval de beweging ook afhankelijk van de temperatuur en de viscositeit van de vloeistof. Toch wordt dit percentage direct gerelateerd aan de deeltjesgrootte en wordt gebruikt NTA. Met behulp van zachteware-gebaseerde analyse, digitale beelden van verstrooid licht van enkele deeltjes worden opgenomen. Percelen van verstrooid licht vlekken en hun snelheid van de beweging te verstrekken van de gegevens die de bepaling van de totale telling deeltje en grootteverdeling vergemakkelijken. Deze techniek is bijzonder krachtig voor het analyseren van deeltjes met een gemiddelde diameter van minder dan 100 nm.

De omvang en concentratie metingen worden uitgevoerd met de ZetaView Brownse en Elektroforese Motion Video Analysis Microscoop. Dit is een halfautomatisch desk top nanodeeltjes analyseapparaat voor vloeistofmonsters (hierna het deeltje volgen instrument). Het bestaat uit het deeltje volgen analysator en een laptop met de software die voor de gegevensanalyse. Heterogene biologische monsters zijn geschikt voor deze werkwijze meer homogene suspensies van anorganische deeltjes. Een laser verstrooiing microscoop met een videocamera wordt gebruikt voor de detectie van partikels en de observation van hun beweging. Terwijl de microscoop as horizontaal en zich in de cel kanaal gevuld met een suspensie die exosomes, wordt de laserbundel verticaal georiënteerd. De deeltjes bestraald door de laser verstrooien het licht, dat is opgenomen onder 90 ° met een digitale camera via de microscoop (Figuur 1). De intensiteit van het verstrooide licht maakt waarneming van deeltjes groter 60 nm diameter. In een dergelijke omgeving de helderheid van een deeltje is niet het enige indicatie van deeltjesgrootte. Als er geen elektrisch veld wordt toegepast, deeltjesbeweging volgt alleen Brownse beweging en kan als een indicator voor het berekenen deeltjesgrootte dienen. Echter, het instrument kan ook het aanbrengen van een elektrisch veld over de cel kanaal. Bij blootstelling aan dit gebied, de mogelijke, polariteit en het niveau van de ionische lading van de zwevende exosomes worden verder determinanten van de richting van hun beweging. Snelheid en richting resulteren in een elektroforetische mobaarheid histogram.

Terwijl vinden van een optimale methode geïsoleerde exosomes analyseren is één probleem, een ander ligt in de effectieve isolatie van exosomen uit verschillende media, zoals bloed, ascites, urine, melk, vruchtwater of celmedium. Verschillende werkwijzen zijn tot nu toe beschreven, die gebaseerd zijn op ultracentrifugatie ^1, industrieel scheiding reagentia (zoals Exoquick) ^7, magnetische partikels voor antigeen gebruik afscheiding ⁸ of ultrafiltratie stap ^9.

In dit protocol tonen we het gehele proces van exosome isolatie via ultracentrifugatie en tonen hoe de verkregen exosoom suspensie via het deeltje volgen instrument te analyseren. Specifieke overwegingen voor de analyse van menselijk plasma of celkweekmedium afgeleide exosomes voorzien.

Protocol

OPMERKING: De informatie in dit werk experimenten zijn door de institutionele ethische bestuur van de Universiteit van Düsseldorf goedgekeurd.

1. exosome Voorbereiding

1. Verzamel volledig bloed in 3 citraat tubes via venapunctie (totaal 9 ml). Giet het bloed in een 15 ml Falcon buis.
2. Centrifugeer het monster bij 1500 xg gedurende 20 min bij 4 ° C om scheiding van cellen initiëren van plasma. Breng de bovenstaande om een ​​nieuwe 15 ml falcon buis.
3. Centrifugeer het monster bij 2800 xg gedurende 20 min bij 4 ° C om alle cellen uit het plasma verwijderd (celvrij plasma; CFP). Transfer van het GVB te ultracentrifugeren tubes, 1 ml per buis.
4. Centrifugeer bij 100.000 xg gedurende 90 min bij 4 ° C exosomes afbreken. Verwijder 900 pl supernatant. Resuspendeer de pellet in de resterende 100 pi in de ultracentrifuge buis. Voeg 900 ul PBS.
5. Centrifugeer opnieuw bij 100.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Verwijder 900 ul van supernatant. Resuspendeer de pellet met de resterende 100 pi.
6. Transfer 5 tot 20 gl resuspensie in 40 ml gedestilleerd water. Filter de suspensie door een 450 nm filter om exosomen scheiden van grotere deeltjes. Gebruik deze laatste suspensie voor deeltje meting.

2. Startup orde van de Particle Tracking Instrument

1. Start het programma door te dubbelklikken op de software-icoon. Klik op de verschillende tabs software ("Cell Check", "Meten", "analyse") om te schakelen tussen hen gedurende het protocol.
2. Volg de instructies op het scherm voor een geautomatiseerde uitvoering van de opstartprocedure. Selecteer de vakjes voor zowel mobiele kwaliteitscontrole en automatische uitlijning.
   OPMERKING: Elk van deze stappen kan afzonderlijk indien nodig worden herhaald door de knop (A) of (B) te drukken op het tabblad "cel check".
3. Open de inlaat- en uitlaatpoort van de NTA instrument en injecteer 10 ml gedestilleerd water met een injectiespuit in de cel-kanaal via de inlaat poort. Sluit de uitlaatpoort als laatste hoeveelheid water wordt geïnjecteerd. Plaats een beker onder de uitlaatpoort om afval oplossing te verzamelen. Zorg ervoor dat de meetcel is vrij van luchtbellen en geen luchtbellen niet spuit in het systeem. Sluit de inlaatpoort onmiddellijk.
4. Voer de cel kwaliteitscontrole door te klikken op "OK". De software zal de cel kwaliteit van de resultaten weer te geven na een paar seconden.
5. Eventuele deeltjes worden nog steeds zichtbaar in het scherm van de software voor live-view of als het resultaat van de kwaliteitscontrole is alleen goed of slecht is, herhaalt u stap 2.3, totdat de resterende deeltjes worden verwijderd uit de meetcel. Ook herhaal stap 2.3 na elke meting zich deeltjes voorkomen. Als het herhalen van het gedestilleerd water injectie en mobiele controle leidt niet tot een "goed" resultaat, gaat u verder met 2.9.
6. Bereid een controle suspensie die uniform 200 nm en kleinbedrijf polystyrene deeltjes worden gebruikt om de foci van de laser en microscoop lijn. Één druppel van de suspensie concentraat, door de fabrikant van het instrument 500 ml gedestilleerd water tot de gewenste concentratie zodanig dat 600 ± 100 deeltjes worden weergegeven per scherm in de live weergave te verkrijgen.
7. Injecteer de uitlijning schorsing in de NTA instrument zoals beschreven in stap 2.3. Druk op "OK" om de automatische uitlijning, een geautomatiseerde routine waarmee het systeem automatisch de optimale positie van de twee brandpunten vindt starten.
8. Wanneer u een waarschuwing waarin staat het systeem is nu klaar voor experimenten, klik op OK om de meting te starten.
9. Soms reinigen cel kanaal handmatig tussen experimenten door spoelen van de cel met een oplossing van ethanol 30%. Reinig het kanaal wanneer de software geeft een automatische foutmelding.

3. Meting van monster

1. Spoel het kanaal met gedestilleerd water voorafgaand aan each monster meting (zoals beschreven in stap 2.3).
2. Injecteer de exosome suspensie (opgesteld in hoofdstuk 1) in om het kanaal, zoals beschreven in stap 2.3.
3. Pas de volgende belangrijkste parameters in de software zo nodig:
   1. Gevoeligheid. Om het optimale bereik gevoeligheid vinden, klik op de knop "aantal deeltjes vs. Gevoeligheid" om een ​​curve voor de gemeten deeltjes per scherm voor verschillende gevoeligheid niveaus weer te geven. Koos een gevoeligheid niveau van voor de maximale helling van de curve. Een hoger niveau gevoeligheid maakt visualisatie van meer kleine deeltjes, maar verhoogt ook de kwesties in verband met achtergrondgeluid.
   2. Minimale helderheid. Koos voor een beginnend helderheid van 20 voor exosome meting om deze functie te gebruiken als een filter. Reguleren van deze parameter tot lege out sterk licht-verstrooiende deeltjes. Reguleren het neer te zwak versterken verstrooiing artefacten. Variëren helderheid indien nodig gedurende het experiment.
      OPMERKING: Deeltjes die licht-strooien te sterk overlappen en kan uit de analyse per ongeluk worden uitgesloten.
   3. Min en Max Size. Stel een digitaal filter pixel ruis en ongewenste verstrooiing van grote deeltjes te elimineren door het reguleren van de minimale en maximale maat. Gebruik een bereik van 10 tot 500 pixels voor meting van exosomes.
   4. Sluiter. Stel de tijd dat de camera is geopend tot 1/300 sec.
4. Leef uitgelezen parameters:
   1. Schakelen tussen een digitale en een analoge weergave modus op elk punt door te klikken op de "live-image" knop.
   2. Gedurende het experiment, het toezicht op de verstrooiing Intensity bar, die de verzadiging status van het monster als een kleurgecodeerde indicator geeft. Niet exosomen analyseren of de verstrooiing bar is rood. In een dergelijk geval het monster om dit fenomeen te voorkomen verder verdunnen. Indien de experimentele conditie verbiedt manipulatie van het monster suspensie, down-reguleren van de gevoeligheid of omhoog reguleren van de helderheid in de software-snstellingen de meetresultaten verbeteren.
      OPMERKING: Bij monsters met een zeer hoge concentratie van deeltjes worden geanalyseerd de scatter zal individuele deeltjes te smelten en ze worden geteld als één enkel deeltje.
   3. Noteer het aantal deeltjes meegeteld in het gezichtsveld van het scherm.
5. Klik op het tabblad "Meten".
6. Kies instellingen in de "run-opties" array.
   1. Vóór elke acquisitie, selecteer "check beweging 'voor een herhaalde controle deeltje drift test. De proef wordt ten minste eenmaal voordat de gehele analyse. Als de drift groter dan 20 um / sec wachten alvorens verder de meting zodat het monster stopt stroomt.
   2. Selecteer het aantal experimenten (5) en de tijdvertraging tussen hen (0).
   3. Voer een "sample check 'indien nodig. Deze test is onderdeel van de automatische aanpassing van de opstartprocedure en kan daarna worden herhaald worden.
7. Klik tot slot op de "run video acquisitie" knop. In het nieuwe venster definieert het aantal cycli (15) en het aantal meetposities (11).
   OPMERKING: De laserkop en de microscoop kan worden verplaatst om het deeltjesaantal te analyseren 11 verschillende posities. Afhankelijk van de experimentele demand besluiten of de proef worden uitgevoerd op een enkele plaats of op verschillende plaatsen.
   1. Bevestig de minimale tijdsduur een deeltje moet worden gevolgd om te worden geteld als een individueel deeltje door het instellen van de videoresolutie (laag). Een lagere resolutie heeft een kortere duur volgen.
   2. Selecteer een bestandsnaam en klik op "OK" om de meting te starten.

4. Interpretatie van de resultaten

1. Bekijk de volgende resultaten en parameters weergegeven na de meting op het tabblad "resultaten": (1) het totale aantal deeltjes getraceerd, (2) het gemiddelde aantal particles per positie, en (3) deeltjesconcentratie.
   1. Bekijk het resultaat gemiddelde tabel voor de numerieke verhouding van de deeltjesgrootte (diameter, oppervlak en volume) het percentage deeltjesaantallen, evenals waarden van gemiddelde en standaard differentiatie.
   2. Gebruik de piek analyse tafel als er meer dan één piek bestaat in de grafische analyse. Deze tabel toont de verdeling van deeltjes die kleiner zijn dan de eerste respectievelijk tweede piek.
2. Bekijk de grafiek berekend na de meting tot een verdeling van de deeltjes naar grootte te zien. Gebruik de pictogrammen in de weergavemodus en boven de grafiek om de instellingen te wijzigen.

Resultaten

Het monster voor deze demonstratie toont een optimale instelling van de meting met een gevoeligheid van 85% voordat de maximale helling van de gevoeligheidscurve (figuur 2). De helderheid, de min / max waarden werden gekozen, zoals aanbevolen in het protocol. Een concentratie van 5,3 deeltjes / ml x 10 ⁶ werd gemeten, terwijl de gemiddelde grootte van de deeltjes was 0,149 pm, de meeste van hen waren 0.137 urn.

De ontvangen na meetwaarden kunnen worden opgeslagen in een rapport met een bestandsindeling van .pdf of als een .txt voor het exporteren in een database. De grafiek kan worden aangepast voorkeur zoals beschreven in het protocol (punt 4). De videoreeks wordt ook opgeslagen en kan worden gebruikt om later off-line heranalyse. In dergelijke off-line analyse, de pre-acquisitie instellingen van de camera niet achteraf gewijzigd.

Om optimale parameterinstellingen vinden waar een meting hier beschreven the optimalisering van de instrumentinstellingen van het voorbeeld van een 100 nm polystyreen standaardmaat. De invloed van twee parameters, gevoeligheid en min / max grootte op videobeeld en deeltjesgrootteverdeling wordt besproken. Alle andere parameters zijn samengevat in tabel 1.

Een visuele indruk van de invloed van gevoeligheid (van 50 tot 94) op analoge en digitale beelden wordt gevisualiseerd in figuur 3. De kwantitatieve informatie uit de afbeeldingen is weergegeven in figuur 4, op basis van de instellingen in tabel 1, Min Size = 5 en Max Size = 200. Een typische verhouding van het aantal gedetecteerde deeltjes versus gevoeligheid is getoond in Figuur 4A. Tussen 50 en 90, het aantal gedetecteerde deeltjes verhoogd met gevoeligheid en steeg dramatisch voor gevoeligheden> 90. Een optimale gevoeligheidsbereik gevonden tussen 66 en 86 (A). Deeltjesgrootteverdelingen verkregen met diflende gevoeligheid instellingen worden weergegeven in figuur 4B. De deeltjesgrootteverdeling stellen het gemiddelde van drie afzonderlijke metingen. Voor een te lage gevoeligheid (ISO-waarde = 62, rode curve) slechts een paar deeltjes werden geanalyseerd wat resulteert in vrij slechte statistieken. Het aantal geanalyseerde deeltjes verhoogd met gevoeligheid en bereikte een optimum tussen 70 (gele lijn) en 86 (tan-curve). Een verdere verhoging van de gevoeligheid leiden tot een verslechtering van de deeltjesgrootteverdeling met het aantal deeltjes te laten vallen en grootteverdeling een verschuiving naar kleinere maten (gevoeligheid = 94, blauwe curve). Figuur 4C toont de trend van het aantal gebaseerde x50 diameter (50% van de partikels kleiner is dan deze diameter) als functie van de gevoeligheid. In de beige interval, de RSD deeltjesgrootte minder dan 8% en komt overeen met de optimale interval A. De rode gebieden duiden RSD> 8% als gevolg van slechte statistieken (gevoeligheid te laag) of breed distrimies met verschuiving naar kleinere maten (gevoeligheid te hoog).

De instellingen van Min Grootte en Max Size zijn filters toegepast op digitale beelden om deeltjes te verwijderen met spot maten kleiner dan de Min Size en groter dan Max Size. Vanwege het vermogen om licht te verstrooien, een deeltje een vlek van een bepaalde grootte op een digitaal beeld. De grootte van de vlek wordt gemeten als een aantal pixels (px). Als een deeltje verstrooit licht zeer goed (bv deeltjes> 200 nm of aggregaten), ter plaatse grootte is vrij groot, bijvoorbeeld> 500 px. De vlekgrootte is vrij klein (bijvoorbeeld <10 px) voor kleine deeltjes (bijvoorbeeld <20 nm) afhankelijk van het deeltjesmateriaal. Vlekgrootte (px) niet worden verwisseld met deeltjesgrootte (nm) als deze niet identiek zijn en er geen directe relatie tussen deze twee variabelen. Een optimalisatie van Min en Max Grootte kan de gebruiker om te filteren op ongewenste objecten zoals agglomeraten (Max Size) of kleinobjecten zoals achtergrondgeluid (Min Size). De invloed van de Min / Max Grootte op de deeltjesgrootteverdeling van 100 nm groottestandaard wordt getoond in figuur 4D (gevoeligheid = 82). Wanneer het interval is ingesteld op kleine vlek afmetingen (bijv min = 1, max = 52; oranje curve), het aantal geanalyseerde deeltjes wordt verminderd en het aantal gebaseerde x50 diameter enigszins verschoven naar kleinere afmetingen. Een instelling voor grotere spots (min = 40, max = 1000; red curve) in een brede deeltjesgrootteverdeling verschoven naar grotere afmetingen. Om een ​​gelijke totale aantal deeltjes te verkrijgen, werden de intervalgrenzen zowel oranje en rood distributies aangepast tot 80 deeltjes passen. De verdeling met optimale instellingen (min = 5, max = 200; tan curve) bestaat uit 360 deeltjes.

Een reeks succesvolle experimenten werden uitgevoerd met exosomes geïsoleerd door ultracentrifugatie en gemeten met gebruikmaking van de NTA systeem. De verkregen gegevens zijn uiterstconsistente en bevestigde een hoge mate van reproduceerbaarheid. Andere isolatie methoden moeten vergelijkbare resultaten te tonen. Echter, de verdunning stap werd geïdentificeerd als een bijzonder belangrijke stap en de impact ervan op de berekende totale aantal deeltjes moet opnieuw worden geëvalueerd.

Figuur 1. Schematische voorstelling van de opstelling van de NTA. De microscoop / video as en laserstraal zijn orthogonaal georiënteerd elkaar kruisen in het gedeelte cel kanaaldoorsnede. Licht dat door de deeltjes wordt weergegeven in het venster "live view" van de software. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2. Aantal deeltjes versus gevoeligheidscurve. Het aantal deeltjes versus gevoeligheidscurve geeft de deeltjes in een positie op een moment wanneer automatisch gevoeligheid scan. Deze grafische weergave wordt gebruikt om de beste voorkeuren voor de initiële metingen bepalen. Een gevoeligheid waarde wordt voorafgaand aan de maximale helling van de grafiek gekozen. Het is belangrijk te onthouden dat artefacten niet worden geëlimineerd in deze test experiment en kan de grafiek van invloed zijn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3. Effect van de gevoeligheid van de analoge en digitale afbeelding. Visualisatie van deeltjes op het live view scherm wordt weergegeven voor gevoeligheden tussen 50 en 94 voor zowel analoge (bovenste rij) eend digitale (onderste rij) uitzicht. Als de gevoeligheid te laag is, worden slechts enkele deeltjes gedetecteerd (links). Bij optimale gevoeligheid weergegeven deeltjes als enkele stippen en geïsoleerd van elkaar (midden). Tegen een relatief hoge gevoeligheid deeltjes samen te voegen samen leidt tot een slechte beeldkwaliteit (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4. Invloed van de gevoeligheid min en grootte instellingen max voor een controle van 100 nm polystyreen deeltje monster (A) Perceel van sensitiviteit versus waargenomen aantal deeltjes.; het optimale interval 66-86 vóór de maximale helling van de curve. (B) Deeltjesgrootteverdelingen verkregen met verschillende gevoeligheid instellingen (62-94); grafieken voor te laag (62) of te hoog (94) gevoeligheid niet de deeltjesgrootteverdeling voor de 100 nm polystyreen controlemonster vangen. (C) Aantal gebaseerde x50 diameter versus gevoeligheid; de fout van x50 in het beige interval is minder dan 8%, optimale interval van 66 tot 86. (D) Gevolgen van Min en Max Grootte op de deeltjesgrootteverdeling; optimale parameters (min = 5 en max = 200) vastleggen van de juiste verdeling van de te controleren steekproef. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Pre-acquisitie parameters
Gevoeligheid	veranderlijk
Sluiter	40
Frame rate	30 fps
Resolutie	High
Cycli	10
Meerdere Overnames	3
Positie	1
Post-acquisitie parameters
Min Helderheid	30
Max Size	veranderlijk
Min Size	veranderlijk

Tabel 1. Samenvatting van pre- en post-acquisitie parameters voor het instellen van de deeltjes volgen instrument.

Discussie

We tonen een gedetailleerd protocol voor exosome isolatie van bloed en het heden nanodeeltjes volgen als een nieuwe en innovatieve methode om exosome omvang en concentratie te meten in een biologische vloeistof. In de gepresenteerde experimenten werd humaan perifeer bloed als de oorsprong van de exosomes. Echter, andere oorsprong, zoals urine, sputum, celkweeksupernatant, etc., kunnen ook worden gebruikt als testmateriaal.

Op basis van de biologische variabiliteit van exosome concentratie bij mensen, kunnen analyses van verschillende individuen opvallend verschillende concentraties van exosomes kenmerken. Echter, de concentratie van deeltjes in de biologische test sonde invloed op de resultaten. Daarom is een betrouwbare en gestandaardiseerde procedure voor de verdunning van probes nodig. In de gepresenteerde methode exosome bevattende plasma gegenereerd uit 9 ml van perifeer volbloed. Met differentiële centrifugatie stappen een exosome pellet werd geïsoleerd uit1 ml plasma en opnieuw gesuspendeerd in 5 ml gedestilleerd water om te resulteren in de werking monster gesuspendeerd exosomes. Deze voorgedefinieerde instelling heeft ons voorzien van een goede concentratie van deeltjes, dat wil zeggen, de juiste scatter intensiteit tijdens de NTA. Naast het aspect volume en verdunning, de samenstelling van de oplossingen die worden gebruikt ook van belang. We hebben gedestilleerd water gebruikt voor de uiteindelijke re-opschorting van exosomen. Natuurlijk verschillende media voor de laatste verdunningsstap kunnen ook worden gebruikt, volgens de eisen van de experimentele opstelling. In het geval van zeta potentiaal metingen van ionische oplossingen, vooral bij het testen monsters met een buffercapaciteit, een voorzichtige verdunning in turbulentievrije omstandigheden nuttig. Voor de directe vergelijking van meerdere monsters aanbeveling het dezelfde verdunning niveau voor alle monsters. Alle instellingen behalve de gevoeligheid en de videoresolutie kan achteraf worden gewijzigd met behulp van de ZetaView Analysis software.

Hoewel de auteurs zijn van mening dat de hier geïntroduceerde systeem is op dit moment het meest geschikte instrument, het is niet de enige beschikbare NTA systeem. Een aantal eerdere rapporten hebben andere systemen die dezelfde NTA principes toe te passen, maar bieden een ander instrument ontwerp dat gaat samen met een aantal verschillende functies ¹⁰ in dienst. Wij zijn van mening dat de praktische aspecten met betrekking tot het behandelen van het monster en de reproduceerbaarheid van de resultaten zijn van cruciaal belang bij het kiezen van de methodologische volgorde voor exosome evaluatie. We geloven ook dat een ideaal detectiesysteem user-afhankelijk factoren die kunnen interfereren met de resultaten van de metingen te elimineren. De exosome analyse aanpak die hier gepresenteerd voldoet aan het criterium van gebruiksgemak hoge mate. Als een verder voordeel wordt de semi-automatische analyse van de monsters uitgevoerd in een snel proces, genereren resulteert in een korte tijd. Een online visualisatie van exosomen helpt de analysator te GAin een oogwenk idee van de exosome kenmerken, bijvoorbeeld, bruto concentratie.

Een zeer eenvoudige doch elegante aanvulling op de meettechniek hier gepresenteerde is het gebruik van gelabeld antilichaam exosomes en het vastleggen van de verstrooide laserbundel met een voorafgaand filter voor de detector. Zo kan exosome subpopulaties worden onderscheiden naar hun oppervlak antigenen en andere biologisch relevante kenmerken die technisch toegankelijke selectief fluorescerende kleuring zijn.

Een nadeel van de huidige versie van onze deeltje volgen instrument is dat bij zeer hoge gevoeligheid niveaus artefacten zoals ruis aanwezig kan zijn, die is gebaseerd op de cel kanaalwand. Een technische oplossing en de verbetering van het huidige systeem beschikbaar kan komen in de nabije toekomst. Met deze werkwijze reflecties van de laser strooilicht op de kanaalwand wordt verminderd, waardoor de de nauwkeurigheid van de gemeten signalen en verkregen gegevens en verlagen de detectiegrens.

Hoewel de momenteel gebruikte protocol voor exosome isolatie is goed ingeburgerd en de toegepaste deeltjes volgen instrument heeft een opmerkelijk nauwkeurige resolutie lager grootteverdeling van 30 nm, is er geen garantie dat de gedetecteerde deeltjes inderdaad helemaal waar exosomes. Andere deeltjes, zoals dode cellen fragmenten of groter eiwit complexen kunnen ook in de exosoom suspensie en leiden tot vals positieve signalen. Een betrouwbare methode waarmee dergelijke "vervuiling" kunnen worden uitgesloten elektronenmicroscopie (EM), ofwel transmissie EM of scannen EM zijn. Helaas, geen algemene en specifieke marker voor exosomen tot dusver geïdentificeerd, hoewel een aantal van de eerder voorgestelde oppervlakte markers hebben opgedaan een toenemende hoeveelheid aandacht, waaronder tetraspanine (tspan), CD81, C63, CD9, enz. ^11.

"> Ongeacht de toekomstige vooruitgang onderzoek naar exosome biologie, met name betreffende exosome specifieke markers, het protocol dat hier wordt voorgesteld een krachtige werkwijze voor de isolatie en detectie van exosomes verschaffen. Concentratie en grootte gemakkelijk bepaald worden in een software-ondersteunde ongecompliceerde mode. De toevoeging van selectieve fluorescerende markers of fluorfoor gekoppeld antilichamen zal waarschijnlijk verder verbeteren van de mogelijke toepassingen van de gepresenteerde aanpak van de NTA.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Citraatbuis	BD	364305	BD Vacutainer
Gedestilleerd water	Braun	3880087	Aqua ad iniectabilia
Falconbuis	Greiner Bio One	188271	PP Tube, Steril 15 ml
Ultracentrifugatiebuis	Beckman	357448	Microfuge Tube Polyallomer 1.5 ml
Polybead	Polysciences, Inc.	07304	2.6% Solids-Latex Uitlijningsoplossing
Spuit (Filter)	Braun	4617053V	5 ml
Spuit (ZetaView)	Braun	4606051V	5 ml
Naald	BD	305180	BD Blunt Fill Naald
Filter	Sartorius Stedim	16555	Spuitfilter, hydrofiel, 450 µm
Ultracentrifuge	Beckman	L8-M	Rotor: 70Ti Ser. No E21078
ZetaView	Particle Metrix	PMX 100, Type 101
Centrifuge	Eppendorf	5804R	Rotor: A-4-44