Plantklieren zijn gespecialiseerde structuren die verantwoordelijk zijn voor de biosynthese en secretie van veel verbindingen die betrokken zijn bij interacties met de biotische omgeving. Om studies naar hun moleculaire en biochemische kenmerken mogelijk te maken, werd een mechanische micropreparatietechniek ontwikkeld om enkele metabolisch actieve klieren te isoleren, hier van de vleesetende plant Nepenthes.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie van levensvatbare meercellige klieren uit weefsel van de vleesetende plant, Nepenthes
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Veel planten bezitten gespecialiseerde structuren die betrokken zijn bij de productie en secretie van specifieke verbindingen en eiwitten met een laag moleculair gewicht. Deze structuren zijn bijna altijd gelokaliseerd op plantoppervlakken. Hieronder vallen nectaries of klierharen. De uitgescheiden verbindingen worden vaak gebruikt in interacties met de biotische omgeving, bijvoorbeeld als aantrekkingsmiddelen voor bestuivers of als afschrikmiddelen tegen herbivoren.
Klieren die in verschillende opzichten uniek zijn, zijn te vinden in vleesetende planten. In de zogenaamde bekerplanten van het geslacht Nepenthe scheiden bifunctionele klieren in de valkuil aan de ene kant het spijsverteringsvocht af, inclusief alle enzymen die nodig zijn voor de vertering van prooien, en nemen aan de andere kant de vrijgekomen voedingsstoffen op. Dergelijke klieren vormen dus een ideaal, gespecialiseerd weefsel dat zich leent voor het bestuderen van de onderliggende moleculaire, biochemische en fysiologische mechanismen van eiwitsecretie en voedingsopname bij planten. Bovendien zou de biosynthese van secundaire verbindingen geproduceerd door veel planten uitgerust met klierstructuren direct in klieren kunnen worden onderzocht.
Om aan dergelijke gespecialiseerde structuren te kunnen werken, moeten ze efficiënt, snel, metabolisch actief en zonder besmetting met andere weefsels worden geïsoleerd. Daarom werd een mechanische micropreparatietechniek ontwikkeld en toegepast voor studies naar Nepenthes spijsverteringsvloeistof. Hier wordt een protocol gepresenteerd dat werd gebruikt om met succes enkele bifunctionele klieren uit Nepenthes-vallen te bereiden, op basis van een gemechaniseerd microsamplingplatform. De klieren konden worden geïsoleerd en direct worden gebruikt voor genexpressieanalyse door PCR-technieken na bereiding van RNA.
Inleiding
Planten produceren een enorme verscheidenheid aan verbindingen met verschillende industriële en farmaceutische toepassingen, variërend van moleculen met een laag molecuulgewicht tot polymeren. Dergelijke verbindingen worden vaak geproduceerd en uitgescheiden door zeer gespecialiseerde structuren, waarvan er veel aan het oppervlak van de planten gelokaliseerd zijn, zoals kliertrichomen of nectariën, of intern, zoals respectievelijk idioblasten of latex- en harskanalen. Er is echter relatief weinig bekend over de biologie van deze gespecialiseerde secretorische structuren, hoewel alle typen van deze klieren kenmerken vertonen die wijzen op een actief metabolisme. In het bijzonder kunnen klieren van vleesetende planten zoals Nepenthes worden beschouwd als modelsystemen in de plantencelbiologie1.
Vleesetende planten zijn het onderwerp van verschillende studies sinds 1875, toen het werk 'Insectivorous Plants' van Charles Darwin werd gepubliceerd2. Echter is onderzoek op moleculair niveau pas in de afgelopen jaren uitgevoerd en onze kennis is nog steeds beperkt. Zo is bijvoorbeeld de eiwitsamenstelling van het spijsverteringssap in de kannenplanten van het geslacht Nepenthes nog steeds niet volledig bekend. Pas onlangs zijn verschillende hydrolytische eiwitten en een aantal van de bijbehorende genen geïdentificeerd3. In de valkuilen van Nepenthes (Figuur 1), bevinden zich meercellige klieren aan de binnenzijde van de bodem van de kannen. Deze klieren verzorgen zowel de productie en secretie van de spijsverteringsenzymen in het kannenvloeistof als de absorptie van opgeloste voedingsstoffen uit deze vloeistof4. Bijgevolg vormen deze bifunctionele klieren een uniek microweefsel met een centrale positie en functie in de carnivorie van Nepenthes dat nadere bestudering verdient.
Figuur 1. Nepenthes alata beker. Het onderste deel van de beker bevat de verteringsvloeistof en klieren aan de binnenzijde.
Klik hier om de afbeelding in een groter formaat te bekijken.
In de plantwetenschappen zijn veel experimentele benaderingen afhankelijk van 'bulkmateriaal' omdat er geen specifiek weefsel wordt onderzocht, maar volledige organen. Bijgevolg kunnen hun homogenisatie en analyse alleen resultaten opleveren die verdund zijn en proportioneel staan tot individuele weefsels en cellen5. Om dit probleem op te lossen, zijn micropreparatietechnieken ontwikkeld, zoals de zogenaamde laser capture microdissectie (LCM), die succesvol worden gebruikt om specifieke plantenweefsels te oogsten en hun individuele inhoud te analyseren6. LCM is echter vaak beperkt wanneer onstabiele en/of snel degraderende celcomponenten, zoals RNA, het doel zijn. In dergelijke gevallen is de noodzaak van voorafgaande weefselfixatie, wat tijdrovend is en vaak gepaard gaat met degradatie van biomoleculen, een nadeel. Bovendien faalde LCM vaak bij preparatie direct vanuit vers weefsel vanwege het hoge watergehalte van veel plantenweefsels en de stevigheid van de celwanden7. Elke benadering om cellulaire componenten te onderzoeken die aanwezig zijn in secretorische klieren — van genen, mRNA en eiwitten tot secundaire verbindingen en hun biosynthese — vereist alternatieve technieken voor de specifieke preparatie. Daarom zijn specifieke technieken noodzakelijk om individuele cellen of zelfs meercellige klieren te isoleren die na preparatie intact blijven.
Hier wordt een methode gepresenteerd die gebruikmaakt van een gemechaniseerd microsampling-platform met directe microscopische visualisatie. Deze techniek is zowel snel als efficiënt bij de preparatie van individuele klieren uit de kannen van Nepenthes-soorten. Deze meercellige klieren zijn bifunctioneel, i.e. ze zijn betrokken bij zowel secretie- als opnameprocessen, ze zijn sessiel, en niet-blootgestelde cellagen zijn geïmpregneerd om een endodermis te vormen. Volledige klieren kunnen worden geïsoleerd zonder omliggend weefsel en op een gedefinieerde manier in een PCR-buis worden geplaatst. Deze techniek wordt toegepast om specifieke genen en genexpressie in de weefsels van de klieren te bestuderen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Plant Material Preparation
- Alle Nepenthes-soorten werden gekweekt in de kassen van het MPI voor Chemical Ecology of in de Botanische Tuin in Jena, Duitsland.
- Voor de voorbereiding van het secreterende weefsel oogst u een kelk en verwijdert u het bovenste derde gedeelte inclusief deksel, peristomium en gladde zone. De kelk kan vers worden gebruikt of ingeslagen in vloeibaar stikstof en bewaard op -80 °C.
2. Microdissectie van Kelkweefsel
- Het microsampling platform bestaat uit een stereomicroscoop en een micromanipulator, die rechtstreeks is bevestigd aan de microscoop en wordt bediend door een 3D joystick. Hier werd een vroege prototype van aureka gebruikt zoals gedocumenteerd (Figuur 2A).
- Gebruik voor het dissekeren van secretoire klieren uit Nepenthes kelken een microtang en bevestig deze aan de manipulator (Figuur 2A en 2B).
- Voor RNA-extractie behandelen alle instrumenten (scheermessen, pincetten, micromanipulator, microtang, objectslide) met RNaseZAP.
- Bereid de opvangbuisjes voor door 9 μl nuclease-vrij water en 1 μl RNase-remmer toe te voegen in een PCR-buisje voor RNA-extractie. Voor directe PCR van weefselmonsters gebruikt u alleen nuclease-vrij water (10 μl).
- Neem de verse of ingevroren kelk en verwijder een stukje weefsel van 1-2 cm2 dat de secretoire klieren bevat, door een scheermes en pincetten te gebruiken. Was het weefsel met water; voeg 0,1% diethylpyrocarbonaat (DEPC) toe als RNA zal worden geëxtraheerd.
- Fixeer het plantmateriaal met dubbelzijdig plakband op een objectslide (de klierbedekte oppervlakte moet naar boven gericht zijn, Figuur 2C en 2D) en zet de slide vast met plakband op een universele tafel, die moet worden toegepast met een beweegbare tafel.
- Voor het extracteren van nucleïnezuren moet de voorbereiding op ijs worden gedaan. Neem daarom een vlakke schuimrubberen doos, plaats de universele tafel met het monster erin en vul de doos met ijs. Plaats daarna de doos onder de microscoop.
- Voor de voorbereiding is de positionering van de klieren erg belangrijk. De secretoire klieren zijn gedeeltelijk bedekt door een beschermende kap (Figuur 3) en alleen toegankelijk voor de pincetten vanaf één kant. Verder moet de hoek van het monster ten opzichte van de pincetten worden aangepast door de tafel van de universele tafel ongeveer 135° te kantelen, afhankelijk van de Nepenthes-soort.
- De microdissectie gebeurt onder visuele controle. Gebruik voor het isoleren van de klieren een niet-UV-filter om de degradatie van DNA en RNA te beperken.
- Verplaats de micromanipulator en de pincetten via het bedieningspaneel naar de geselecteerde klier. Wanneer de klier is bereikt, plaatst u elke arm van de pincetten aan weerszijden van de klier. Verwijder de klier van het overgebleven weefsel door de pincetten te sluiten (Figuur 4A).
- Leidt de klier die aan de pincetten is bevestigd, weg van het object en naar de opvangbuis. Breng de uiteinden van de pincetten in contact met de oplossing in de buis (Figuur 4B). Het loslaten van de klier door de pincetten te openen moet goed worden waargenomen, omdat de klieren de neiging hebben om op de punt van het gereedschap te plakken. Het weefsel kan worden bewaard bij -80 ° C tot PCR of RNA-extractie.
3. Directe PCR-amplificatie van Nepenthes-weefsel
- Om de efficiëntie van de voorbereidingsmethode te bewijzen, kan een PCR-aanpak rechtstreeks vanuit het klierweefsel zonder een DNA-extractiestap worden uitgevoerd.
- Gebruik voor de PCR-amplificatie genspecifieke primers; hier coderend voor de sequentie van een thaumatine-achtig eiwit (TLP) (forward: 5'-CAATGAGCCAATTCATAAAATTCATTG-3', reverse: 5'-CAGTTATACTTTAAGGGCAAAACACAAC-3').
- Verzamel 1-5 klieren in een PCR-buisje dat 10 μl nuclease-vrij water bevat. Voeg voor een 50 μl reactie 5 μl van 10x Taq buffer, 1 μl 10 mM deoxynucleosidetrifosfaten (dNTPs), 3 μl 25 mM MgCl2, 0,4 μl (1,25 U) Taq DNA-polymerase, 1 μl (100 pmol) van elke primer en 28,6 μl nuclease-vrij water toe.
- Voer PCR-reacties uit in een thermocycler met het volgende programma: initiële denaturatie 94 ° C gedurende 3 min; 35 cycli van denaturatie (94 ° C gedurende 30 sec), annealing (59 ° C gedurende 30 sec) en extensie (72 ° C gedurende 1 min); en een laatste extensie van 10 min bij 72 ° C.
- Bewijs de amplificatie van het PCR-product door middel van agarosegelelektroforese. Gebruik daarvoor 1,5% (w/v) agarose en los het op in 1x TAE (40 mM Tris-base, 20 mM glazuur azijnzuur, 1 mM EDTA, pH 8) buffer. Verwarm de oplossing in een magnetron totdat de agarose is opgelost. Voeg 100 ml agarose-oplossing toe aan 1 μl etidiumbromide (10 μg/μl) voor downstream-visualisatie. Laat de gel draaien in 1x TAE-buffer bij 300 V, 115 mA gedurende ongeveer 20 min in een elektroforesekamer. De juiste
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Voor de preparatie van individuele klieren uit Nepenthes pitcher-weefsel is een gemechaniseerde microdissectietechniek ontwikkeld en toegepast. Het micropreparatieplatform moet worden uitgerust met microforceps, bevestigd aan de micromanipulator, die op hun beurt worden bediend via een bedieningspaneel. Individuele klieren, zichtbaar onder de microscoop, konden worden getarget met de forceps, waarmee het klierweefsel werd gegrepen en mechanisch verwijderd (Figuur 4A).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Lange tijd zijn studies van secretoire structuren van planten, met name trichomen, in wezen anatomisch uitgevoerd en puur beschrijvend geweest. Er is een grote hoeveelheid publicaties van dit type, zoals samengevat in reviews door9-11. Onze biochemische en moleculaire kennis van secretoire structuren van planten is nog steeds beperkt ondanks enkele vroege opmerkelijke werken bijv. over klierenharen van munt die aantonen dat klierharen de plaats zijn van biosynthese van monoterpenoïden die in de subcut...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Wij hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij danken het kasteam van het MPI-CE in de Botanische Tuin van de Friedrich Schiller Universiteit, Jena, voor het kweken van planten en Wilhelm Boland en de Max Planck Society voor hun steun.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| RNAqueous-Micro Kit | Life Technologies GmbH, Germany | AM1931 | Isolation van totaal RNA, 50 samples |
| Dynabeads mRNA DIRECT Micro Kit | Life Technologies GmbH, Germany | 61011 | 5 ml Dynabeads Oligo (dT)25 |
| DynaMag-2 magnet | Life Technologies GmbH, Germany | 12321D | |
| SuperScript CellsDirect cDNA Synthesis System | Life Technologies GmbH, Germany | 18080-200 | 25 reacties |
| RNaseOUT | Life Technologies GmbH, Germany | 10777-019 | Rnase remmer, 5.000 eenheden |
| Random Hexamers (0,4 μg/µl) | QIAGEN GmbH, Germany | 79236 | 100 µl |
| 10 mM dNTP Mix, moleculaire biologie kwaliteit | Fermentas GmbH, Germany | R0192 | 1 ml |
| Taq DNA polymerase, (recombinant) | Fermentas GmbH, Germany | EP0402 | Wordt geleverd met 10x Taq buffer (met KCl of (NH4)2SO4) en 25 mM MgCl2 |
| TURBO DNase | Life Technologies GmbH, Germany | AM2238 | 1.000 eenheden |
| Agarose | Carl Roth GmbH Co. Germany | T846.3 | |
| GeneRuler Low Range DNA ladder, gebruiksklaar | Fermentas GmbH, Germany | SM1193 | 50 µg |
| Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix | Agilent Technologies, Inc., USA | 600828 | Enkel kit |
| RNaseZAP | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | R2020 | |
| Razorblad | Carl Roth GmbH Co., Germany | CK08.1 | |
| Pincet | Carl Roth GmbH Co., Germany | 2801.1 / 2855.1 | |
| GE NanoVue spectrofotometer | GE Healthcare Europe GmbH, Germany | 28-9569-62 | |
| Mastercycler gradient | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5331 000.010 | |
| Mx3000P Real-Time PCR System | Stratagene, USA | 401403 | |
| Agagel Standard Horizontal Gel Electroforese Chamber | Biometra | Uit productie | |
| Micromanipulator | aura optik gmbh | aureka | Uitgerust met een microforceps |
| Stereomicroscoop | Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | SteREO Lumar.V12 | Uitgerust met een AxioCam |
| Lumar Filter set 01 | Carl Zeiss, Microscopy, Jena, Germany | 485001-0000-000 | UV filter |
| Lumar Filter set 09 | Carl Zeiss, Microscopy, Jena, Germany | 485009-0000-000 | non-UV filter |
Referenties
- Adlassnig, W., Peroutka, M., Land, I., Lichtscheidl, I. K. Glands of carnivorous plants as a model system in cell biological research. Acta Bot. Gall. 152, 111-124 (2005).
- Darwin, C. Insectivorous plants. , John Murray. London. (1875).
- Mithöfer, A. Carnivorous pitcher plants: Insights in an old topic. Phytochemistry. 72, 1678-1682 (2011).
- Owen Jr., T. P., Lennon, K. A., Santo, M. J., Anderson, A. N. Pathways for nutrient transport in the pitchers of the carnivorous plant. Nepenthes alata Ann. Bot. 84, 459-466 (1999).
- Brandt, S. P. Microgenomics: gene expression analysis at the tissue-specific and single-cell levels. J. Exp. Bot. 56, 495-505 (2005).
- Hölscher, D., Schneider, B. Application of laser-assisted microdissection for tissue and cell-specific analysis of RNA, proteins, and metabolites. Prog. Bot. 69, 141-167 (2008).
- Rottloff, S., Müller, U., Kilper, R., Mithöfer, A. Micropreparation of single secretory glands from the carnivorous plant Nepenthes. Anal. Biochem. 394, 135-137 (2009).
- Liu, W. H., Saint, D. H. A new quantitative method of real time reverse transcription polymerase chain reaction assay based on simulation of polymerase chain reaction kinetics. Anal. Biochem. 302, 52-59 (2002).
- Werker, E. Trichome diversity and development. Adv. Bot. Res. Inc. Adv. Plant Pathol. 31, 1-35 (2000).
- Fahn, A. Structure and function of secretory cells. Adv. Bot. Res. Inc. Adv. Plant Pathol. 31, 37-75 (2000).
- Juniper, B. E., Robins, R. J., Joel, D. M. The carnivorous plants. , Academic Press. London. (1989).
- Gershenzon, J., McCaskill, D., Rajaonarivony, J., Mihaliak, C., Karp, F., Croteau, R. Isolation of secretory-cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic-studies of monoterpenes and other gland products. Anal. Biochem. 200, 130-138 (1992).
- Rontein, D., Onillon, S., et al. CYP725A4 from yew catalyzes complex structural rearrangement of taxa-4(5),11(12)-diene into the cyclic ether 5(12)-oxa-3(11)-cyclotaxane. J. of Biol. Chem. 283 (5), 6067-6075 (2008).
- Aharoni, A., Jongsma, M. A., Bouwmeester, H. J. Volatile science? Engineering of terpenoid biosynthesis in plants. Trends Plant Sci. 10, 594-602 (2005).
- Mithöfer, A., Boland, W., Maffei, M. E. Chemical ecology of plant-insect interactions. Ann. Plant Rev. 34, 261-291 (2009).
- Kennedy, G. G. Tomato pests, parasitoids, and predators: Tritrophic interactions involving the genus Lycopersicon. Ann. Rev. Entomol. 48, 51-72 (2003).
- Mithöfer, A., Boland, W. Plant defense against herbivores: Chemical aspects. Ann. Rev. Plant Biol. 63, 431-450 (2012).
- Rottloff, S., Stieber, R., Maischak, H., Turini, F. G., Heubl, G., Mithöfer, A. Functional characterization of a class III acid endochitinase from the traps of the carnivorous pitcher plant genus, Nepenthes. J. Exp. Bot. 62, 4649-4647 (2011).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
