Wilde dieren worden vaak geparasiteerd door een breed scala aan wormen. De vier belangrijkste soorten wormen zijn “rondwormen” (nematoden), “stekelhoofdige wormen” (acanthocephala), “suikers (trematoden), en “lintwormen” (cestoden). Hier beschrijven we hoe wormen worden verzameld van een gewerveld dier en hoe ze worden bewaard en taxonomisch geïdentificeerd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Helminth-verzameling en -identificatie uit wilde dieren
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Wilde dieren worden vaak geparasiteerd door een breed scala aan helminten. De vier belangrijkste soorten helminten zijn "rondwormen" (nematoden), "doornkopwormen" (acanthocephalanen), "leverzwammen" (trematoden) en "lintwormen" (cestoden). De optimale methode voor het verzamelen van helminten is om een gastheer te onderzoeken die minder dan 4-6 uur dood is, omdat de meeste helminten nog steeds levend zullen zijn. Er moet een grondige necropsie worden uitgevoerd en alle belangrijke organen worden onderzocht. Organen worden gewassen over een 106 μm zeef onder stromend water en de inhoud wordt onder een stereomicroscoop bekeken. Alle helminten worden geteld en een representatief aantal wordt gefixeerd (ofwel in 70% ethanol, 10% gebufferde formaline of alcohol-formaline-azijnzuur). Voor soortidentificatie worden helminten ofwel geklaard in lactofenoel (nematoden en kleine acanthocephalanen) of gekleurd (trematoden, cestoden en grote acanthocephalanen) met behulp van Harris' hematoxylinen of Semichon's karmijn. Helminten worden geïdentificeerd door verschillende structuren te onderzoeken (bijv. mannelijke spicules in nematoden of het rostellum in cestoden). De hier beschreven protocollen kunnen op elk gewerveld dier worden toegepast. Ze vereisen enige expertise in het herkennen van de verschillende organen en het vermogen om helminten te onderscheiden van ander weefseldebris of darminhoud. Verzameling, conservering en kleuring zijn eenvoudige technieken die minimale apparatuur en reagentia vereisen. Taxonomische identificatie, vooral tot op soortniveau, kan erg tijdrovend zijn en kan de indiening van exemplaren bij een expert of DNA-analyse vereisen.
Inleiding
Werveldieren worden geparasiteerd door vier grote groepen van helminten (wormen). Twee van de groepen, trematoden, of trematoden, en cestoden, of lintwormen, vallen binnen het Phylum Platyhelminthes. De andere twee groepen zijn de nematoden, of rondwormen, (Nematoda) en de acanthocephalen, of doornkopwormen (Acanthocephala). Veel van deze parasieten zijn gedocumenteerd als oorzaken van morbiditeit en mortaliteit bij wilde vogels en zoogdieren1,2.
De meeste helminten hebben complexe levenscycli die meer dan één gastheer omvatten1,2. Trematoden hebben bijvoorbeeld een of twee tussengastheren (meestal ongewervelden) en een uiteindelijke gastheer. Alle gastheren moeten aanwezig zijn om de cyclus te voltooien en dus om volwassen helminten in de uiteindelijke gastheren aanwezig te zijn (wat het onderwerp is van dit manuscript). Het is dus belangrijk om in gedachten te houden dat seizoensschommelingen kunnen optreden in de prevalentie en intensiteit van sommige helmintensoorten en dat langdurig monitoring wenselijk is om de volledige helmintenfauna van een bepaalde gastheer vast te leggen.
De optimale methode voor het verzamelen van helminten is om een gastheer te onderzoeken die is geëuthanaseerd. Dit maakt het mogelijk om helminten te verzamelen terwijl ze nog in leven zijn en voor hun juiste ontspanning en fixatie. Materiaal van gastheren die al meer dan 24 uur dood zijn, of die zijn bevroren en ontdooid om onderzocht te worden, is vaak inferieur en moeilijk te identificeren. Trematoden en cestoden uit bevroren of geformaliseerde gastheren zijn vaak erg samengedrukt en hebben structuren verloren die cruciaal zijn voor identificatie, zoals orale stekels op trematoden of de haken op de scolex van lintwormen. De realiteit is echter dat het meeste materiaal dat tegenwoordig beschikbaar is van gewervelde gastheren, bevroren of geconserveerd is.
Databases met DNA-sequentie-informatie voor helminten groeien snel en dus is taxonomische identificatie al mogelijk voor veel soorten. Daarom moeten helminten zoveel mogelijk worden bewaard voor potentiële DNA-analyses. DNA van goede kwaliteit is echter niet mogelijk als exemplaren in formaline zijn gefixeerd. De hier beschreven methoden voor het verzamelen en doden van helminten zullen materiaal opleveren dat geschikt is voor DNA-extractie en genetische analyses.
Hieronder beschrijven we gedetailleerde methoden voor het necropsieën van gewervelde dieren (amfibieën, reptielen, vogels en zoogdieren; monogene trematoden uit vissen zijn niet inbegrepen) voor het verzamelen van helminten, gevolgd door procedures voor het bewaren en verwerken ervan voor taxonomische identificatie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dieren die in de volgende experimenten werden gebruikt, werden dood aangetroffen als wegwerpen.
1. Necropsie van dieren en screening van belangrijke organen voor helminth-collectie
- Plaats het dier op een vlakke ondergrond en onderzoek alle externe openingen, inclusief oren, mondholte en ogen, met een vergrootglas op het voorkomen van nematoden (rond) en trematoden (plat en niet-segmenteerd) (zie Figuur 1).
- Als u met vogels werkt, was ze met kraanwater om de veren te bevochtigen voordat u ze uit elkaar haalt.
- Gebruik een scherp mes of mes en met behulp van een paar dissectiepincetten, maak een incisie over de buikholte, zorg ervoor dat u geen organen breekt. Voor schildpadden met een harde carapax, gebruik een handzaag om door het bot bij de brug te snijden tussen de borst- en buikschilden.
- Open de borstholte zoals hierboven; voor grote dieren, kunnen botkniptangen of een kleine handzaag nodig zijn om door de ribben te snijden.
- Als u met vogels werkt, onderzoek de luchtzakken in situ voordat u organen verwijdert. Gebruik indien nodig een vergrootglas.
- Onderzoek beide holten op filariale rondwormen en grote trematoden.
- Voordat u het maagdarmkanaal uit de buikholte verwijdert, bind een draad dicht bij het begin van de slokdarm en een andere aan het einde van de dikke darm (rectum).
- Separeren van de volgende borstholte organen in petrischalen (of glazen bakjes als organen te groot zijn) voor onderzoek onder een stereomicroscoop (10-30X): hart en belangrijke bloedvaten, luchtpijp en longen.
- Verwijder lever, galblaas en -kanaal, alvleesklier, milt, nieren en urineblaas en onderzoek zoals beschreven in stap 1.8.
- Verwijder het volledige spijsverteringsstelsel en plaats elke sectie in glazen schalen/bakken.
- Nadat de organen zijn verwijderd, spoel de lichaamsholte met een slang of spuitfles gevuld met 0,9% zoutoplossing in een 106 μm zeef en onderzoek de zeefinhouden onder een stereomicroscoop op het voorkomen van filariale wormen of bloedtrematoden.
- Open elke sectie van het spijsverteringskanaal met een schaar, schraap de mucosa en onderzoek zorgvuldig op het voorkomen van grote parasieten (>1 cm). Gebruik indien nodig een vergrootglas. De proboscis van acanthocephalans zijn vaak diep ingebed in de wand van de darm en moeten voorzichtig worden losgemaakt van het weefsel met pincetten en/of kleine schaar.
- Plaats elke geopende sectie onder stromend water en spoel alle inhoud in een 106 μm zeef zoals beschreven in stap 1.11.
- Open het hart en belangrijke bloedvaten (pulmonair en aorta), luchtpijp en urine- en galblaas en onderzoek de inhoud op dezelfde manier.
- Snijd vaste organen zoals longen, lever, nieren, milt en pancreas met een scherp mes en pincetten in stukken en spoel ze onder stromend water in een 106 μm zeef zoals beschreven in stap 1.11.
- Noteer de soorten parasieten die zijn gevonden, het aantal van elke soort en de orgaan(s) waarin ze zijn gevonden. Fixatie- en kleurmethoden staan hieronder vermeld.
- Label flessen/potten door een klein stukje van een platte indexkaart te plaatsen geschreven met potlood (inkt en gestreepte indexkaarten zullen "lopen" in alcohol en kleur monsters).
2. Conservering van Helminthen
- Voor helminten die bewaard moeten worden voor later genetisch onderzoek, plaats ze direct in 80-90% ethanol (zonder glycerine). De ethanol moet worden gemaakt door 95% ethanol te verdunnen, bij voorkeur reagent grade (Tabel 1). Laat deze exemplaren nooit worden blootgesteld aan formaline, omdat formaline DNA tot een onbruikbare toestand degradeert.
- Plaats levende trematoden op een glazen microscoopplaatje in een druppeltje zoutoplossing, plaats een glazen deksel en haal de plaat door een vlam zonder de zoutoplossing te laten koken.
- Laat de plaat vallen in een petrischaal met AFA (alcohol-formalin-azijnzuur, zie Tabel 1) en laat het deksel drijvend afvallen.
- Fixeer in AFA gedurende één tot meerdere dagen, spoel af met kraanwater en breng over naar glazen flesjes van 5 ml (of groter glazen flesje/pot, afhankelijk van grootte en hoeveelheid parasieten) gevuld met 70% ethanol voor langdurige opslag.
- Fixeer dode trematoden in AFA of 10% gebufferde formaline gedurende 48 uur en breng vervolgens over naar een flesje/pot gevuld met 70% ethanol voor langdurige opslag.
- Ontspan levende cestodes in een petrischaal door bijna kokend water over ze te gieten en breng vervolgens over naar een flesje/pot gevuld met 70% ethanol voor langdurige opslag.
- Ontspan levende acanthocephalans door ze één tot meerdere uren in een petrischaal in kraanwater in een koelkast (~4 °C) te plaatsen tot de proboscis volledig is omgedraaid (dit kan tot 24 uur duren). Breng over naar een flesje/pot gevuld met 70% ethanol of AFA voor langdurige opslag.
- Behandel dode cestodes en acanthocephalans hetzelfde als dode trematoden (zie hierboven).
- Dood levende kleine (<5 mm, of fragiele nematoden (bijv. trichostrongyliden, capillariden) in heet (bijna kokend) 70% ethanol en bewaar in een flesje/pot gevuld met 70% ethanol met 5% glycerine (Tabel 1) toegevoegd om de wormen te bewaren in geval van verdamping.
- Dood (en ma
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met de hierboven beschreven methoden is er tussen 2007-2011 in Missoula County, Montana, een onderzoek uitgevoerd naar de helminthen van de grijze dwergspitsmuis, Sorex cinereus. In totaal werden 56 spitsmuizen gevangen in valstrikken en binnen 2 uur na de dood onderzocht. De algehele prevalentie van infectie was 96%; slechts 2 spitsmuizen waren vrij van parasieten. Er werden vijftien soorten helminthen geïdentificeerd, waaronder 9 soorten cestoden en 6 soorten nematoden. Eén soort van het cestodegeslacht St...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het is uiterst moeilijk om helminth-parasieten te identificeren, zelfs tot op geslachtsniveau, op basis van slecht materiaal. Vooral cestoden en trematoden hebben de neiging om vrij snel na de dood van de gastheer te sterven en te verslechteren. De taxonomie van cestoden is sterk afhankelijk van het aantal, de grootte en de vorm van de rostellarhaken, die vaak verloren gaan in bevroren materiaal. Hetzelfde geldt voor bepaalde trematoden met stekels rond de orale zuignap zoals echinostomen en heterofyiden, die ook vaak ve...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
We hebben niets te onthullen
Dankbetuigingen
De auteurs willen Dr. Joe N. Caudell, Disease Biologist voor het Indiana USDA APHIS Wildlife Services Program aan Purdue University, bedanken voor het verstrekken van specimens die werden gebruikt voor het verzamelen van helminten voor de productie van deze video. Jennifer Serafin bereidde alle chemische oplossingen voor.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Fixeren | |||
| Alcohol-Formaline-Azijnzuur (AFA) | Fisher Scientific | A407-1 (ethanol) F75F-1GAL (formaldehyde) BP2401500 (ijsazijn) | Ethanol 85% (85 ml) + formaldehyde 37% (10 ml) + ijsazijn (5 ml) |
| Ethanol voor doden en langdurige conservering | Fisher Scientific | A407-1 | Ethanol 100% (70 ml) + gedestilleerd water (30 ml) |
| Ethanol voor fixeren en DNA-studies | Fisher Scientific | AC61511-0010 | Ethanol 80-90% (80-90 ml) + gedestilleerd water (20-10 ml), respectievelijk |
| Gebufferd Formaline | Fisher Scientific | SF100-4 | Formaline 10% (10 ml) + gedestilleerd water (90 ml) |
| Glycerine-alcohol | Fisher Scientific | A407-1 (ethanol) AC15365-1000 (glycerine) | Ethanol 70% (95 ml) + glycerine (5 ml) |
| Ophelderen, kleuren en inbedden | |||
| Ethanol voor dehydratie tijdens kleuring | Fisher Scientific | A407-1 | Ethanol 80%, 95%, 100% (80 ml, 95 ml, 100 ml) + gedestilleerd water (20 ml, 5 ml, 0 ml) |
| Lactofenol | Fisher Scientific | R400-27 | - |
| Fenol | Fisher Scientific | A931I-1 (fenol) A407-1 (ethanol) | Fenol 100% (80 ml) + ethanol 100% (20 ml) |
| Harris’ Hematoxylinen | Fisher Scientific | S25347 (hematoxylinen) A407-1 (ethanol) A567-500 (ammonium aluminiumsulfaat) S25553 (natriumjodaat) | Hematoxylinen (5 g) + ethanol 100% (50 ml) + ammonium aluminiumsulfaat (100 g) + natriumjodaat (0,37 g) + gedestilleerd water (1.000 ml) |
| Semichon’s azijnkarmijn | Fisher Scientific | BP2401500 (ijsazijn) S25236 (karmijn) A407-1 (ethanol) | Ijsazijn (100 ml) + karmijn (1,5 g) + gedestilleerd water (100 ml). Verwarm in een kokend waterbad gedurende 15 min en laat afkoelen. Filter om een basisoplossing te maken. Meng 1:2 met 70% alcohol voor kleuring. |
| Xyleen | Fisher Scientific | X4-4 | Gebruik alleen onder een chemische afzuigkap. |
| Methylsalicylaat | Fisher Scientific | S25437 | - |
| Basisethanol | Fisher Scientific | A407-1 (ethanol) S25159A (geconcentreerde ammoniumhydroxide) | Ethanol 70% (100 ml) + ammoniumhydroxide (0,1 ml) |
| Zure ethanol | Fisher Scientific | A407-1 (ethanol) SA9233-100 (zoutezuur) | Ethanol 70% (99,5 ml) + zoutzuur (0,5 ml) |
| Canadese balsem | Fisher Scientific | B10-100 | - |
Referenties
- Atkinson, C. T., Thomas, N. J. Parasitic Diseases of Wild Birds. Hunter, D. B. , John Wiley & Sons, Blackwell Press. Hoboken, New Jersey, USA. (2009).
- Parasitic Diseases of Wild Mammals. Samuel, W. M., Pybus, M. J., Kocan, A. A. , Second Edition, Iowa State University Press. Ames, Iowa, USA. (2001).
- Yamaguti, S. Parts 1 and 2. The Digenetic Trematodes of Vertebrates. Systema Helminthum. I, Interscience Publishers Inc. New York, New York, USA. (1958).
- Yamaguti, S. Synopsis of Digenetic Trematodes of Vertebrates. I and II, Keigaku Publishing Company. Tokyo, Japan. (1971).
- Gibson, D. I., Jones, A., Bray, R. A. Keys to the Trematoda. 1, CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (2002).
- Jones, A., Bray, R. A., Gibson, D. I. Keys to the Trematoda. 2, CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (2005).
- Bray, R. A., Gibson, D. I., Jones, A. Keys to the Trematoda. 3, CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (2008).
- Yamaguti, S. Acanthocephala of Vertebrates. Systema Helminthum. V, Interscience Publishers Inc. New York, New York, USA. (1963).
- Yamaguti, S. The Cestodes of Vertebrates. Systema Helminthum. II, Interscience Publishers Inc. New York, New York, USA. (1959).
- D, G. Keys to the Cestode Parasites of Vertebrates. CRC Handbook of Tapeworm Identification. , CRC Press Inc. Boca Raton, Florida, USA. (1986).
- Khalil, L. F., Jones, A., Bray, R. A. Keys to the Cestode Parasites of Vertebrates. , CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (1994).
- Yamaguti, S. The Nematodes of Vertebrates. Parts 1 and 2. Systema Helminthum. III, Interscience Publishers Inc. New York, New York, USA. (1961).
- Anderson, R. C., Chabaud, A. G., Willmott, S. Keys to the Nematode Parasites of Vertebrates: Archival Volume (Nos). 1-10. , CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (2009).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
