Methodenartikel

Isolatie van corticale Microglia met Conserven immunofenotype en functionaliteit van Muriene Pasgeborenen

DOI:

10.3791/51005

⸱

30 januari 2014

 ,  , 
1Department of Neuroscience, Georgetown University Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een sleutel tot succesvolle onderzoek van microglia biologie is het behoud van microglia immunofunction ex vivo tijdens isolatie van CZS-weefsel. Isoleren microglia via roterende schudden resulteert in zeer zuivere en immunofunctional celculturen zoals beoordeeld door fluorescerende beeldvorming, immunocytochemie, en ELISA na microglia-activatie met de pro-inflammatoire stimuli lipopolysaccharide (LPS) en Pam 3 CSK 4 (Pam).

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Isolatie van microglia van CZS-weefsel is een krachtig onderzoeksinstrument gebruikt om microglia biologie studeren ex vivo. De huidige methode Gegevens van een procedure voor de isolatie van microglia van neonatale muizen cortex door mechanisch roeren met een roterende schudder. Dit microglia isolatie methode levert zeer zuiver corticale microglia dat morfologische en functionele kenmerken wijzen op latente microglia in normale, nonpathological condities in vivo vertonen. Deze procedure bewaart ook de microgliale immunofenotype en biochemische functies zoals blijkt uit de inductie van morfologische veranderingen, nucleaire translocatie van de p65 subeenheid van NF-kB (p65), en secretie van de pro-inflammatoire cytokine kenmerk, tumornecrosefactor-α (TNF-α ), na lipopolysaccharide (LPS) en Pam 3 CSK 4 (Pam) uitdagingen. Daarom is de huidige isolatie procedure behoudt de immunofenotype van zowel latente en actikeld microglia, die een experimentele methode van onderzoek microglia biologie in ex vivo omstandigheden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microgliacellen, het toezicht macrofagen van het CZS parenchym, omvatten ongeveer 12% van de totale celpopulatie van de volwassen hersenen van zoogdieren. Microglia zijn afgeleid uit dooierzak myeloïde voorlopercellen en variëren in celdichtheid en morfologie in verschillende cytoarchitectural gebieden binnen de volwassen CZS 1-5. In een gezonde volwassen brein, microglia zijn kleine, vertakte of polaire cellen met fijne, dynamische processen. In tegenstelling tot perifere macrofagen morfologie, microglia tonen een rustige, low-profile fenotype in gezonde hersenen die kunnen worden weergegeven als cellulaire inactiviteit, maar in vivo imaging studies tonen aan dat microglia processen dynamisch en uitschuiven om hun micro-omgeving te controleren op een manier die doet denken aan " bemonstering en landmeetkundige "6,7.

Microglia en zijn zeer verschillend reageren op milieu en pathofysiologische veranderingen in de hersenen, switchingeen toezichthouder van een effector-staat algemeen beschouwd als de rustende en geactiveerde toestanden, respectievelijk. Deze schakelaar activering kan worden gemedieerd door aangrijping van membraangebonden patroonherkenning receptoren (PRRS), zoals toll-like receptoren (TLR's), die beantwoorden aan pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs), namelijk bacteriële-en virale afgeleide lipoproteïnen , nucleïnezuren en koolhydraten 8-11. Naast PAMPs zijn PRRS ook aangetoond dat microglia activatie induceren tegen steriel, niet-pathogene moleculen, bekend als gevaar / beschadiging geassocieerde moleculaire patronen (gedempt), die een verstoring in CZS homeostase vertegenwoordigen, zoals cellulaire schade 12-16. Eenmaal geactiveerd, PRRS initiëren een intracellulaire signalerende cascade die leidt tot veranderingen in microgliale cel morfologie en genexpressie, specifiek geactiveerde microglia aan een amoeboid fenotype, verplaatsen de P65 subeenheid NF-kB (p65) naar de celkern, en de upregulate productie en secretie van pro-inflammatoire cytokinen zoals tumornecrosefactor-α (TNF-α), interleukine-1 β (IL-1β), samen met reactieve zuurstof species (ROS) 16-24. Hoewel integraal in de aangeboren immuunrespons van het CZS, zijn deze afgescheiden moleculen ook gevonden neuronale oxidatieve stress te vergroten, waardoor het induceren en verergeren neurodegeneratie in zieke toestanden zoals Parkinson en Alzheimer 25-29.

Echter, de mechanismen van microgliale activering in pathologische toestanden niet volledig begrepen. Daarom isolatie van microglia is een krachtig onderzoeksinstrument in deze biologische processen, zoals velen in vivo functies van microglia activatie kan worden samengevat in de cultuur. Verschillende methoden beschikbaar voor het isoleren van microglia, waaronder isolatie via een Percoll gradiënt na enzymatische afbraak van CZS weefsel 30,31. Echter, enzymatische digestie veranderenhet immunofenotype van de cellen door het verminderen celoppervlak antigeen-expressie 32 en resulteert in lagere cel opbrengst per dier dan de hierin beschreven werkwijze. Specifiek, melden wij een gemiddelde microglia opbrengst per pup cortex van 7,5 x 10 5 cellen, terwijl eerder gemeld isolatie methoden uit geheel CNS via een Percoll gradiënt opbrengst 3-5 x 10 5 cellen 30,33,34. De huidige procedure omzeilt het gebruik van de spijsvertering enzymen door het isoleren van microglia op basis van hun lage-aanhankelijkheid eigenschappen, waardoor de microglia immunofenotype en functionaliteit behoud.

In deze studie beschrijven we de isolatie van microgliale cellen uit gemengde gliale kweken afgeleid van neonatale heterozygote CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -) en C57BL / 6 muizen cortex door mechanische agitatie op een roterende schudder, een uitbreiding van eerder gepubliceerd methode 24,35. We maken gebruik van de voormalige muizenstam voor eenvoudige visualisatie van microglia, zoalsDeze muizen brengen GFP onder de controle van de endogene locus CX3CR1 - een monocyt-specifieke promotor 36-38. Deze werkwijze levert zeer zuiver microgliale kweken met een behouden immunofe ex vivo zoals blijkt uit morfologische veranderingen, nucleaire translocatie van p65 en uitscheiding van TNF-α bij provocatie met bacteriële lipopolysaccharide (LPS) of Pam 3 CSK 4, TLR4 en TLR1 / 2 agonisten respectievelijk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voorafgaand aan de start van dit protocol, verzamelen neonatale muizen op postnatale dagen 1-3 (P1-3) in een steriele container genest met originele kooi beddengoed voor bescherming en warmte. Het is belangrijk om snel en efficiënt te werken door middel van dit protocol om microglia opbrengst te optimaliseren. Zie tabel 1 voor volledige reagenslijst.

1. Voorbereiding van de instrumenten, Cultuur Media en Gerechten

  1. Bereid 10 ml / pup Microglia compleet medium (MCM; 1x Minimal Essential Medium Earle's [MEM], aangevuld met 1 mM L-glutamine, 1 mM natriumpyruvaat, 0,6% v / v D-(+)-glucose, 100 ug / ml penicilline / streptomycine (P / S), 4% v / v foetaal runderserum (FBS), 6% v / v paardenserum) en aan elke T-75 kolf (kolf 1 / pup), cap en plaats horizontaal in een incubator (37 ° C, 5% CO2) om de temperatuur gedurende 1 uur. Essentieel is dit media equilibreren kolf (s) voordat de dissectie.
  2. Prepare, hoeveelheid, en warm in de 37 ° C waterbad MCM voor dissectie (6 ml / pup) en in een aparte conische buis MCM voor mobiele resuspensie (2 ml / pup). Bereiden, portie, en chillen op het ijs Mincing Media (MM; HBSS aangevuld met: 100 ug / ml P / S, 0,01 M HEPES, 3 ml / pup), en ontleden Media (DM; MEM aangevuld met 100 ug / ml P / S, 2 ml / pup).
  3. Steriliseer de volgende chirurgische instrumenten door onderdompeling in 70% ethanol gedurende 10 min: schaar # 1 (1, tot onthoofden), pincet # 1 (2, te beveiligen neus en verwijder cortices), schaar # 2 (1, nonangled, open hoofdhuid ), pincet # 2 (1, om de hoofdhuid te verwijderen), pincet # 3 (1, om de schedel te verwijderen), pincet # 4 (2; tot hersenvliezen te verwijderen), schaar # 3 (1; om hersenweefsel blad voor de mond). Laat aan de lucht drogen op een steriel gaasje.
  4. Veeg de horizontale luchtstroom werkstation en dissectie microscoop met 70% ethanol.
  5. Doseer DM in 2 steriele, 100 mm petrischalen voor het vastleggen van het hoofd (3 ml; 1 schotel / 3 pups) en dissectie (1 ml;1 schotel / pup; gekoeld op ijs voorafgaand aan dissectie). Doseer MM in 1 steriel, 100 mm petrischaal voor hakken hersenweefsel (1 ml; 1 schotel / pup).

2. Brain Tissue Dissection

  1. Voorafgaand aan euthanasie, zachtjes ontsmetten nek en hoofd van de pup met 70% ethanol met behulp van een lab weefsel. Met een schaar # 1, snel euthanaseren pup door het verwijderen van de kop; capture hoofd in vooraf bereide petrischaal. Euthanaseren en voltooiing van de dissectie van een pup voordat u verder gaat naar het volgende dier.
  2. Breng het hoofd naar de gekoelde dissectie schotel; onder dissectie microscoop veilig het hoofd door te knijpen de neus met behulp van pincet # 1 (als alternatief, kan het hoofd worden bevestigd door het doorboren van de tang door de oogkas), open hoofdhuid met behulp van schaar # 2 door het creëren van een Y-snede: begin van de basis van het hoofd en schuin naar de ogen. Gebruik pincet # 3 verwijdert op milde wijze de hoofdhuid met het schillen van lateraal, waardoor de schedel.
  3. Met behulp van pincet # 3, verwijder voorzichtig bindweefsel aan de basis vanhoofd. Als basis van de schedel wordt blootgesteld, zorgvuldig geopend schedel door te rijgen een arm van de tang tussen de hersenen en de schedel (na de interhemisferische spleet), grip, trek de schedel omhoog om openscheuren.
  4. Verstoren bindweefsel onder ventrale zijde van de hersenen met behulp van pincet # 1, en verwijder vervolgens de hersenen met behulp van dezelfde tool. Til de hersenen uit de schedel door een opwaartse kracht onder de ventrale zijde van de hersenen.
  5. Bewaar de hersenen in zijn anatomische positie: rugzijde naar boven naar de cortex visualiseren onder de dissectie microscoop, zet de hersenen plaats door het invoegen tips pincetten op de doorsnede van de middenhersenen en de cortex, corticale hersenvliezen volledig te verwijderen met pincet # 4, ga dan naar de ventrale hersenvliezen verwijderen. Zodra de hersenvliezen volledig zijn verwijderd, scheid de cortices van de rest van de hersenen met behulp pincet # 4. Essentieel volledig verwijderen meningeale weefsel microglia zuiverheid en yiel maximaliserend.

3. Brain Tissue Fijnhakken

  1. Transfer cortex om eerder bereid gehakt schotel; blijven hakken stap met behulp van steriele techniek in de klasse II biologische veiligheid kabinet.
  2. Hak hersenweefsel met schaar # 3; overdracht gehakt weefsel een 15 ml conische buis;. Spoel schaar en fijnhakken schotel met 1 ml MM elk verzamelen en afzien spoelen in de 15 ml conische buis met gehakt weefsel Deze spoelstap maximaliseert de opbrengst van microglia doordat alle overblijvende weefsel wordt overgebracht naar conische buis. Verlaat weefselsuspensie ongestoord voor 1-2 min, waardoor gehakt weefsel om zich te vestigen aan de onderkant van de buis. Neem niet meer dan 2 min als MM geen essentiële voedingsstoffen bevatten.
  3. Verwijderen en gooi 2 ml van de bovenstaande met generieke 1000 pi micropipettor met een standaard pipet tip, het maken van bepaalde vaste gehakt-weefsel niet te verstoren zorgvuldig.
  4. Voeg 3 ml van MCM de gehakt-weefsel; vermaal het weefsel met volle kracht met behulp van een generieke 1000 ul micropipettor met een standaard pipettip geen waarneembare vast weefsel moet blijven wanneer fijnwrijving is voltooid.. Voeg nog een 3 ml van MCM met dezelfde pipet tip, verzamelen resterende aangewreven monster uit de pipet tip.

4. Groeiende Corticale Cellen

  1. Centrifugeer het gehakt weefsel cellen (215 xg, 5 min; RT; klinische centrifuge met swingende emmer rotor) neer te slaan. Terug afgedraaid cellen naar de biologische veiligheid kabinet, te verwijderen en gooi het supernatant; voorzichtig resuspendeer de cel pellet (2 ml / buis; MCM), voeg de cel resuspensie aan de eerder bereide T-75 kolf; dop op de fles en plaats het horizontaal in een bevochtigde standaard weefselkweek incubator (37 ° C, 5% CO2). Laat de cellen geïncubeerd gedurende 24 uur.
  2. Na 24 uur, tik dan zachtjes kolf tegen de palm van de hand te verstorenweefselafval. Controleer cellen voor en na tikken om volledige verwijdering van afval te waarborgen. Set fles verticaal, te verwijderen en gooi media, voeg verse MCM aan de bodem van de kolf (12 ml, 37 ° C); dop en plaats terug in de incubator, horizontaal.
  3. Controleer cellen dagelijks op vervuiling en groei te volgen.
  4. Op ongeveer 17-21 dagen in vitro (DIV), zal microgliacellen klaar voor de oogst van de gemengde gliale cultuur. Om te bepalen of cellen zijn klaar, onderzoekt cellen onder een omgekeerde fase-contrast microscoop. Microglia zijn klaar voor de oogst als bij ~ 40% confluentie. Ze verschijnen als kleine, lichte, bolvormige cellen, groeit als een monolaag bovenop andere glia.

5. Isolatie van Microglia van Mixed Gliale Cultuur

  1. Om microglia isoleren, krachtig tik kolf tegen laboratorium bank. Deze agitatie helpt gescheiden microglia uit andere gliacellen te wijten aan de lage hechting eigenschappen van microglia.
  2. Seal T-75 kolf doppen met Parafilm en draai de gemengde gliale culturen (200 tpm; 37 ° C, 5 uur). Met behulp van een temperatuur-gecontroleerde, nonhumidified rotatieschudinrichting Sta niet toe dat cellen te schudden langer dan 5 uur een visuele inspectie. dat microglia hebben de kolf oppervlak getild na 5 uur, met behulp van een omgekeerde fase-contrast microscoop. Microglia zijn helder, bolvormig, vrij zwevende cellen. Er zal een resterende laag van astrocyten en oligodendrocyten hechten aan de bodem van de kolf zijn.
  3. Verzamel supernatant media die microglia in een steriele conische centrifugebuis; pellet microglia (215 xg, 5 min; swingende emmer rotor).
  4. Resuspendeer de pellet in microgliale warme Microglial groeimedium (MGM, MEM aangevuld met 1 mM natriumpyruvaat, 0,6% v / vglucose, 1 mM L-glutamine, 100 ug / ml P / S, 5% v / v FBS, 2 ~ ml / kolf) Bepaal de celconcentratie met een hemocytometer en plaat 1 x 10 5 cellen / putje in een 24-well plaat formaat opplastic of steriele glazen dekglaasjes (500 ul / putje; MGM). Met deze procedure wordt de gemiddelde microglia opbrengst is 7,5 x 10 5 cellen / pup cortex.
  5. 24-uur na plating, verwijder alle van de media en opnieuw ingevoerd cellen met verse MGM (37 ° C) tot drijvende cellen en vuil te verwijderen. Deze stap is cruciaal voor de overleving cel en latente microglia handhaven. Cellen kunnen worden gebruikt voor experimenten direct na bijvoeding.

6. Voorbeeld Behandelingen

  1. Expose cellen tot 10 ng / ml Pam 3 CSK 4 (Pam), 10 ng / ml lipopolysaccharide (LPS) of het voertuig, incubeer gedurende 2 tot 24 uur in bevochtigde incubator (37 ° C, 5% CO2).

7. Het analyseren Microglia voor Functionaliteit Ex vivo via Immunofluorescente Imaging en Immunocytochemie

  1. Na behandeling oogst celkweekmedium in microfuge buizen (1,5 ml) en centrifuge behulp van een tafelblad microcentrifuge (2 min; 900 xg) om media te wissen. Breng de bovenstaande om een ​​schone microfugebuis; onmiddellijk assay, of bewaar bij -20 ° C tot gebruik. Analyseer TNF-α-concentratie in celcultuur supernatant via handel verkrijgbare muis-TNF α ELISA kit.
  2. Was de cellen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), en bevestig cellen met 4% (w / v) paraformaldehyde / 4% (w / v) sucrose / PBS pH 7,4 (4% PFA, 15 min, RT). Na fixatie, wassen cellen met PBS gedurende 5 minuten onder zacht schudden op een rondschudapparaat.
    1. Immuunfluorescentie / Immunocytochemie. Na fixatie en PBS wassen, proces microglia voor immunocytochemie. Alle stappen met zacht schudden uitgevoerd. Permeabilize cellen in PBS/0.1% Triton X-100; blok cellen in PBS/10% normaal geit serum gedurende een uur. Incubeer cellen O / N bij 4 ° C met konijnen anti-NF-KB-antilichaam (p65 subeenheid, 1/1, 250) of konijn anti-Iba-1-antilichaam (1/750) in blockingbuffer. Zichtbaarize antigeen-antilichaam-complex na incubatie met fluorescent geconjugeerd geit anti-konijn IgG secundair antilichaam (1 hr, 1/1, 000). Verwijder ongebonden tweede antilichaam door wassen met PBS/0.1% triton X-100 (3x 5 min).
    2. Teller vlek cellen met 4 ',6-diamidino-2-fenylindool / PBS (DAPI, 0,1 ug / ml). De celkern te visualiseren Alle microglia afgeleid van CX3CR1-GFP + / - muizen brengen GFP. Maken gebruik van een 350 nm golflengte filter te visualiseren DAPI, een 488 nm golflengte filter om GFP te visualiseren, en een 594 nm golflengte filter om p65 en Iba-1 immunocomplexen visualiseren.
  3. Mount dekglaasjes met behulp van waterige montage oplossing en visualiseren microglia met fluorescerende microscopie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Behoud van immunofenotype en functionaliteit van microglia ex vivo tijdens isolatie kritisch kunnen deze cellen te gebruiken als onderzoeks model voor microgliale biologie. Om de succesvolle behoud van microglia immunofunctionality volgens de onderhavige werkwijze demonstreren, isoleerden wij corticale microglia van P3 pasgeborenen (CX3CR1-GFP + / - en C57BL / 6) en behandelde kweken met ofwel LPS of Pam.

Zoals getoond in figuur 1A, isolatie van microglia...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De huidige procedure biedt een effectieve methode voor het isoleren van de corticale microglia van pasgeboren muizen. Deze procedure heeft een dubbel voordeel 1) behoud microglia immunophenotype en functionaliteit, zoals bepaald door fluorescentie beeldvorming, immunocytochemie en ELISA, en 2) zodat microglia rijpen in aanwezigheid van andere gliacellen (astrocyten en oligodentrocytes) vóór isolatie, die belangrijke cel-cel interacties tijdens de gliale cultuur rijpingsduur kan vergemakkelijken. Belangrijk, geïsoleerde ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd in de afwezigheid van alle commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door NIEHS R01ES014470 (KMZ).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
GlucoseSigmaG8270Maak 20% Stockoplossing met MilliQ water; filter sterilise; bewaar bij 4 °C; houdbaarheid: 3-6 maanden. Gebruikt om MCM en MGM te maken.
Sodiumpyrovaat 100 mM (100x)HycloneSH30239.01Bewaar bij 4 °C. Gebruikt om MCM en MGM te maken.
Penicilline/Streptomycine 10.000 eenheden/ml (100x)Gibco15140-122Bewaar bij -20 °C. Gebruikt om MCM, MGM, MM en DM te maken.
L-Glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081Bewaar bij -20 °C. Gebruikt om MCM en MGM te maken.
Fetaal bovien serum (gedefinieerd)HycloneSH30070.03Filter sterilise; bewaar bij -20 °C. Gebruikt om MCM en MGM te maken.
Minimum Essential Medium Earle's (MEM)Cellgro15-010-CVZonder L-glutamine. Bevat Earle's zouten. Gebruikt om MCM, MGM en DM te maken.
Paarden serumGibco16050Filter sterilise; bewaar bij -20 °C. Gebruikt om MCM en MGM te maken.
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)Cellgro21-021-CVZonder calcium en magnesium. Bewaar bij 4 °C. Gebruikt om MM te maken.
HEPES 1 MGibco15630-031Bewaar bij 4 °C. Gebruikt om MM te maken.
T-75 FlaskCorning430641
4',6-Diamidino-2-fenylindole, dilactaat (DAPI)InvitrogenD3571Gebruikt om celkern te kleuren.
Konijn anti-Iba1Wako019-19741Gebruikt bij 1/750 verdunning voor ICC-kleuring van Iba1. 
Konijn anti-NFκB (p65)Abcam7970Gebruikt bij 1/1.250 verdunning voor ICC-kleuring voor p65.
Alexa Fluor 594 Geit anti-Konijn IgG (H+L)InvitrogenA11012Gebruikt bij 1/1.000 verdunning voor visualisatie van antigeen:antilichaamcomplex in ICC.
10 ml Wegwerp serologische PipetFisher Scientific13-678-11E
50 ml Wegwerp CentrifugeerbuisFisher Scientific05-539-8
15 ml Wegwerp CentrifugeerbuisFisher Scientific05-539-12
Steriele Polystyreen PetrischaalFisher Scientific875713100 mm x 15 mm
Schaar: Recht Metzembaum (schaar #1)Roboz SurgicalRS-60101; 5 inch; gebruikt voor het verwijderen van de kop
Schaar: Vannas
(schaar #2)		Fine Science Tools15000-081; niet-gebogen; 2,5 mm snijkant; gebruikt om de hoofdhuid te openen
Schaar: Student Vannas (schaar #3)Fine Science Tools91501-091; gebogen; gebruikt om hersenweefsel te hakken
Pincet: Dumont #7
(pincet #1)		Fine Science Tools91197-002; gebruikt om de neus vast te zetten en cortices te verwijderen 
Pincet: Dumont #2
(pincet #2)		Fine Science Tools11223-201; gebruikt om hoofdhuid te verwijderen
Pincet: Dumont #3
(pincet #3)		Fine Science Tools11231-301; gebruikt om de schedel te verwijderen
Pincet: Dumont #5a
(pincet #4)		Fine Science Tools11253-211; gebruikt om de hersenvliezen te verwijderen
Tabel van specifiek materieel
Zoom Stereo Dissectie Microscoop OlympusSZ4060Microscoop is geplaatst in Laminar-Horizontal Flow Cabinet
Laminar-Horizontal Flow CabinetNuaireNU-201-330
Biologische VeiligheidskastLabconco3440001Klasse II
Water-Jakket CO2 IncubatorVWR97025-836Ingesteld op 37 °C, 5% CO2
Swing-out emmersFisher Scientific75006441Te gebruiken met Swing-out rotor
Swing-out RotorFisher Scientific75006445Max Radius: 19,2 (cm)
Sorvall Legend RT+ Centrifuge
(klinische centrifuge)		Fisher Scientific75-004-377Met swing-out rotor
AccuSpin Micro 17 microcentrifuge
(tafeltop microcentrifuge)		Fisher ScientificS98645Met microliter rotor (24 x 1,5/2,0 ml; Cat #: 75003524)  

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ranshoff, R. M. P. V. H. Microglia Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
  2. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39, 151-170 (1990).
  3. Gomez Perdiguero, E., Schulz, C., Geissmann, F. Development and homeostasis of "resident" myeloid cells: The case of the microglia. Glia. 61, 112-120 (2013).
  4. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat. Neurosci. 16, 273-280 (2013).
  5. Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nature reviews. Immunology. , 11-775 (2011).
  6. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
  7. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
  8. Hu, S., et al. Cytokine and free radical production by porcine microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 78, 93-96 (1996).
  9. Muzio, M., Polentarutti, N., Bosisio, D., Prahladan, M. K., Mantovani, A. Toll-like receptors: a growing family of immune receptors that are differentially expressed and regulated by different leukocytes. J. Leukocyte Biol. 67, 450-456 (2000).
  10. Lee, S. J., Lee, S. Toll-like receptors and inflammation in the CNS. Curr. Drug Targets. Inflamm. Allergy. 1, 181-191 (2002).
  11. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8, 57-69 (2007).
  12. Halle, A., et al. The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-beta. Nat. Immunol. 9, 857-865 (2008).
  13. Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
  14. Duewell, P., et al. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals. Nature. 464, 1357-1361 (2010).
  15. Stewart, C. R., et al. CD36 ligands promote sterile inflammation through assembly of a Toll-like receptor 4. 11, 155-161 (2010).
  16. Beraud, D., et al. alpha-Synuclein Alters Toll-Like Receptor Expression. Front. Neurosci. 5, 80 (2011).
  17. Banati, R. B., Gehrmann, J., Schubert, P., Kreutzberg, G. W. Cytotoxicity of microglia. Glia. 7, 111-118 (1993).
  18. Combs, C. K., Karlo, J. C., Kao, S. C., Landreth, G. E. beta-Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNF alpha-dependent expression of induciblenitric oxide synthase and neuronal apoptosis. J. Neurosci. 21, 1179-1188 (2001).
  19. Kim, Y. S., Joh, T. H. Microglia, major player in the brain inflammation: their roles in the pathogenesis of Parkinson's disease. Exp. Mol. Med. 38, 333-347 (2006).
  20. Colton, C., Wilcock, D. M. Assessing activation states in microglia. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 174-191 (2010).
  21. Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Ceramide activates microglia to enhance the production/secretion of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) without induction of deleterious factors in vitro. J. Neurochem. 80, 697-705 (2002).
  22. Uesugi, M., Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Nonparticipation of nuclear factor kappa B (NFkappaB) in the signaling cascade of c-JunN-terminal kinase (JNK)- and p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)-dependent tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) induction in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated microglia. Brain Res. , 1073-1074 (2006).
  23. Beraud, D., et al. Microglial Activation and Antioxidant Responses Induced by the Parkinson's Disease Protein alpha-Synuclein. J. Neuroimmun. Pharmacol. 8, 94-117 (2013).
  24. Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease. Neurobiol. Aging. 29, 1690-1701 (2008).
  25. Minghetti, L., Levi, G. Microglia as effector cells in brain damage and repair: focus on prostanoids and nitric oxide. Prog. Neurobiol. 54, 99-125 (1998).
  26. Hirsch, E. C. Glial cells and Parkinson's disease. J. Neurol.. 247 (2), 58-62 (2000).
  27. Liu, B., et al. Role of nitric oxide in inflammation-mediated neurodegeneration. Ann. NY Acad. Sci. 962, 318-331 (2002).
  28. Shie, F. S., Nivison, M., Hsu, P. C., Montine, T. J. Modulation of microglialinnate immunity in Alzheimer's disease by activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Curr. Med. Chem. 16, 643-651 (2009).
  29. Rogers, J., Mastroeni, D., Leonard, B., Joyce, J., Grover, A. Neuroinflammation in Alzheimer's disease and Parkinson's disease: are microglia pathogenic in either disorder. Int. Rev. Neurobiol. 82, 235-246 (2007).
  30. Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murinemicroglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
  31. Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigenpresentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J. Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
  32. Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression. J. Immunol. Methods. 194, 71-75 (1996).
  33. Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J. Vis. Exp. , (2011).
  34. Veremeyko, T., Starossom, S. C., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. Detection of microRNAs in microglia by real-time PCR in normal CNS and during neuroinflammation. J. Vis. Exp. , (2012).
  35. Su, X., Federoff, H. J., Maguire-Zeiss, K. A. Mutant alpha-synuclein overexpression mediates early proinflammatory activity. Neurotox. Res. 16, 238-254 (2009).
  36. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptorCX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
  37. Imai, T., et al. Identification and molecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1, which mediates both leukocyte migration and adhesion. Cell. 91, 521-530 (1997).
  38. Cardona, A. E., et al. Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor. Nat. Neurosci. 9, 917-924 (2006).
  39. Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57, 563-581 (1999).
  40. Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus:immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Cortical Microglia IsolationMicroglia ImmunophenotypeMechanical AgitationMixed Glial CulturesImmunofluorescence MicroscopyELISAMeningeal Tissue RemovalRotary ShakerCell Culture Plates

Gerelateerde artikelen