Methodenartikel

Melk Collection Methoden voor Mice and Reeves 'Muntjac Herten

20.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51007

⸱

19 juli 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Prion Research Center, Colorado State University

In dit artikel

Samenvatting

Melkverzameling van diermodellen vergemakkelijkt verschillende onderzoekswegen: het begrijpen van passieve immuniteit, het identificeren van pathogenen die verantwoordelijk zijn voor verticale overdracht en, door het gebruik van transgene muizen, zelfs de commerciële productie van eiwitten die in menselijke moedermelk worden aangetroffen. Hier illustreren we een eenvoudige methode voor melkverzameling bij muizen en Reeves’ muntjakherten.

Samenvatting

Diermodellen worden vaak gebruikt in onderzoekslaboratoria om te bereiken wat normaal gesproken als onpraktisch zou worden beschouwd in de natuurlijke gastheer van een pathogeen. Melkverzameling van dieren biedt wetenschappers de mogelijkheid om veel aspecten van reproductie te bestuderen, waaronder verticale transmissie, passieve immuniteit, biologie van de borstklier en lactatie. Het verkrijgen van voldoende hoeveelheden melk voor deze studies is een uitdagende taak, vooral bij kleine diermodellen. Hier illustreren we een goedkope en eenvoudige methode voor melkverzameling bij muizen en Reeves' muntjakherten die geen gespecialiseerde apparatuur of uitgebreide training vereist. Deze specifieke methode vereist twee onderzoekers: één om de melk uit te drukken en het dier te stabiliseren, en één om de melk te verzamelen in een geschikte container van een Muntjac of muismodel. Het muismodel vereist ook het gebruik van een P-200 pipetman en bijbehorende pipettentips. Hoewel deze methode kostenefficiënt en relatief eenvoudig uit te voeren is, moeten onderzoekers erop worden gewezen dat anesthesie van het dier vereist is voor een optimale melkverzameling.

Inleiding

Diermodellen inzicht in pathologie die niet kunnen worden verkregen door in vitro analyse. De meest effectieve resultaten oplevert, is het belangrijk om een ​​diermodel dat nauw samenhangt met de ziekte en soorten van gebruik. Bijvoorbeeld, de Reeves 'muntjak (wordt reevesi), een kleine Aziatische hert 1,2 en transgene muizen die de cervid prion eiwit (CerTgPrP) 3 zijn nuttig diermodellen voor soorten hertachtigen. Beide soorten zijn polyestrous, waardoor het hele jaar door fokken, en dus een consistente bron voor zwangerschap-gerelateerde weefsels en vloeistoffen aan specifieke mechanismen bestuderen in hertachtigen biologie. Studies van melk hebben een breed scala van toepassingen die eenvoudiger (en goedkoop) bereikt in diermodellen dan bij de mens. Onderzoekers konden melk en biest als een potentiële bron van 1) overdracht van infectieziekten te onderzoeken, 2) immunoglobulinen overgedragen van moeder op nakomelingen in de ontwikpment van passieve immuniteit 4 en 3) lactoferrine, een eiwit dat voorkomt in moedermelk betrokken bij passieve immuniteit dat de onderzoekers op dit moment proberen om commercieel te produceren 5.

Het verzamelen van een grote hoeveelheid melk van kleine dieren kunnen blijken te zijn een moeilijke taak worden. Rogers voorgestelde benadering om melk te verzamelen van ratten 6, die vervolgens werd gebruikt in muizen. DePeters en Hovey voorgesteld twee methoden voor melkinzameling een een handmatig gegenereerde onderdruk door een rubberen pipet bolbodem een ​​Pasteur pipet en een tweede waarbij de constructie van een melkstel, die vervolgens wordt bevestigd aan een vacuümbron (zoals als een kraan) voor muis melk 7 oogsten. Hier stellen we een eenvoudige, goedkope methode voor het verzamelen van melk van zowel muizen als Reeves 'muntjac herten, die alleen beschikbaar laboratorium apparatuur en technische basisvaardigheden vereist. Onze methode levert voldoende hoeveelheden melk voor diversetoepassingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Mouse Milking Protocol

De in dit protocol beschreven methoden werden goedgekeurd door IACUC.

1. Scheiding van de Dam van Offspring

  1. Selecteer de dam om gemolken te worden. Kies een dam met een nestje van 4 of meer pups die 8-12 dagen na het werpen te zorgen maximale ophalen van melk-hoewel collectie is mogelijk op elk tijdstip na de bevalling tot 21 dagen.
  2. Scheid de dam uit haar nest minstens 2 uur voor het melken.
    Opmerking: Indien een verlangen om meer dan een dam melk in een bepaalde periode, is het acceptabel om de gescheiden dammen in dezelfde kooi met voldoende voedsel en water te huisvesten.

2. Toediening van Oxytocine, Anesthesie en Eye Glijmiddel

  1. Dien 2 IE / kg van oxytocine intraperitoneaal (IP). Oxytocine is een hormoon dat de melk van lacterende vrouwen om de afgifte van melk stimuleren. Oxytocine kan worden verworven frOM een dierenarts.
  2. Dien een verdoving mengsel dat 80-100 mg / kg ketamine in combinatie met 5-10 mg / kg xylazine IP. Zo kan een 10 ml stock anesthesiemengsels worden voorbereid voor muizen gewicht van ongeveer 30 gram en zou omvatten 0,1 ml xylazine, 8,9 ml H2O en 1,0 ml ketamine. 0,25 ml totale verdoving een muis van deze omvang verdoven voor ongeveer 20-30 minuten, die voldoende tijd voor het ophalen van melk moeten verstrekken.
    Opmerkingen: Om vast te stellen dat het dier met succes is verdoofd, plaats voorzichtig haar op haar buik op een stevige ondergrond; ze mogen niet bewegen haar voeten of een poging om te stijgen naar haar voeten als ze volledig verdoofd. Bij een muis niet volledig verdoofd met de oorspronkelijke dosering, kan de onderzoeker een toedienen ¼ of ½ van de oorspronkelijke dosis van het anestheticum mengsel afhankelijk van de grootte van de muis en / of het niveau van sedatie dat de muis verworvenheden . Echter, dit kon ikncrease de kans op een negatieve reactie op anesthesie, en kan ook resulteren in de muis wordt dieper verdoofd en / of verdoofd voor een langere periode.
    Opmerking: Als melken meer dan een dam, is het noodzakelijk oxytocine en verdoving injecties door de korte halfwaardetijd van oxytocine en sedatie moment voor ketamine en xylazine spreiden.
  3. Breng een kleine hoeveelheid oogzalf om de hoek van elk oog en verspreid naar de ogen van de muis uitdroogt terwijl onder narcose.

3. Melk Collection

Het ophalen van melk is het meest eenvoudig uitgevoerd met twee onderzoekers: een onderzoeker aan de verdoofde muis vast te houden terwijl handmatig de uiting van de melk (aangeduid als R1), en een onderzoeker aan de melk (R2) te verzamelen. Deze methode kan ook worden uitgevoerd met een persoon, wanneer de muis wordt bevestigd op een plat oppervlak om schade te voorkomen.

  1. R2 moeten worden uitgerust met steriele alcohol prep pads, een P-200 pipEtman, een schone pipet tip voor elke muis, en een container aan de melk, zoals een 1,5 ml Eppendorf buis of een 1,2 ml cryovial (zie tabel van Materialen) houden.
  2. Zoals de oxytocine begint door te voeren, zal de melkafgifte zichtbaar in borstklieren gebied van de muis geworden (zie figuur 1A). R1: Haal een steriele alcohol prep pad en veeg de borstklier gebied van de muis om het gebied voorafgaand aan het melken schoon te maken. Handmatig kolven van de tepel met behulp van de duim en wijsvinger zachtjes masseren en knijp het borstweefsel in een opwaartse beweging tot een zichtbare kraal melk begint te vormen bij de basis van de speen.
  3. Druk op de P-200 pipetman plunjer naar zijn eerste stop om lucht te laten ontsnappen uit de pipet tip en voor te bereiden voor het ophalen van melk.
  4. Plaats de pipetpunt bovenaan de druppel melk en trek de melk in de pipetpunt door langzaam vrijgeven van de druk op de zuiger. Let er dan op de tip te dicht bij de speen of de huid aan te brengen (zieFiguur 1B). Het is niet nodig om de plunjer volledig vrij te geven als dit de melk zal trekken tot aan de bovenkant van de pipetpunt en het moeilijk maken om de vaak viskeuze melk verdrijven in de houdcontainer.
  5. Verdrijf de melk in de container met behulp van de duim om op de zuiger voorbij de eerste stop (zie figuur 1C). Om uitzetting van kleine volumes te vergemakkelijken, druk op de pipet tip tegen de zijkant van de buis, zodat er geen vloeistof verloren gaat.
  6. Blijf handmatig kolven uit elke speen, bewegen in klokwijzerrichting of tegen zodat ze geen spenen slaan. Het is zowel aanvaardbaar en nuttig om terug te komen en voortdurend uiten melk van dezelfde speen moet produceren meer melk dan de andere.

4. Verdoving Omkering in de Dam

  1. In de meeste gevallen is het gebruikelijk om de dam te gaan beginnen wakker tijdens het melken. Indien dit niet het geval is, zet de dam in een cage indirect onder een warmtebron, zoals een verwarmd circulerende deken, totdat ze begint te ontwaken.
    Opmerking: Omdat de dam begint wakker te worden, houden nauwkeurige observatie van haar activiteit totdat ze in staat is om te lopen over haar kooi in haar eentje.
  2. Zodra de dam beweegt over de kooi zonder strijd, zet haar terug in haar oorspronkelijke kooi met haar nestje. Geen nadelige gevolgen zijn geconstateerd met betrekking tot de pups 'vermogen om te voeden na het ophalen van melk.

2. Muntjac Milking Protocol

De in dit protocol beschreven methoden werden goedgekeurd door IACUC.

1. Scheiding van de Doe uit Offspring

  1. Selecteer de hinde te melken. Reeves 'muntjak hert algemeen bevallen van een fawn 2. Melk de hinde de dag na geboorte aan het reetje mogelijkheid om de toegang tot essentiële voedingsstoffen krijgen in colostrum 8 mogelijk te maken.
    Opmerking: De fawn verbergt meestal en niet opnieuw in de procedure; scheiding van de moeder-nakomelingen paar is niet noodzakelijk.

2. Toediening van Oxytocine, Anesthesie en Eye Glijmiddel

  1. Dien 10 IE / kg Oxytocine intramusculair (IM). Oxytocine is een hormoon dat inwerkt op de melkklieren van de zogende vrouwen om de teleurstelling van melk te stimuleren. Oxytocine kan worden verkregen van een dierenarts.
  2. Dien de BAM verdoving IM 11 met butorphanol 0,45 mg / kg, azaperon 0,25 mg / kg, medetomadine 0,07 mg / kg. Een dosis van het BAM verdoving mengsel zal een muntjak verdoven voor ongeveer 20-30 minuten, die meer dan voldoende tijd voor complete ophalen van melk voorziet. Een andere optie voor verdoving midazolam op 1-2 mg / kg, die een muntjac zal sederen ongeveer 10-15 minuten. Hoewel dit biedt voldoende tijd voor het ophalen van melk, wordt deze verdoving sneller gemetaboliseerd dan BAM en het dier kan proberen te ontsnappen aan het einde van de kortere periode.
    Opmerking: Minimale reactie op pijn, Kleine reflexen bij aanraken van de oren, gevolgd door het vermogen van R1 MJ houden zonder strijd blijkt dat het dier succesvol is verdoofd.
    Opmerking: Bij een muntjac niet volledig verdoofd met de oorspronkelijke dosering, kan de onderzoeker een toedienen ¼ of ½ van de oorspronkelijke dosis van het anestheticum mengsel afhankelijk van de grootte van het dier en / of het niveau van sedatie reeds is bereikt. Echter, kan dit de kans op een negatieve reactie op anesthesie verhogen en ook kan leiden tot muntjac wordt dieper verdoofd en / of verdoofd voor een langere periode.
  3. Breng een kleine hoeveelheid smeermiddel om de hoek van elk oog en uitbreiden tot de ogen van de muntjak's uitdroogt terwijl onder narcose.

3. Melk Collection

Het ophalen van melk is het meest eenvoudig uit te voeren met twee onderzoekers; een onderzoeker aan de verdoofde muntjak houden inde schoot tijdens het handmatig uiting van de melk (Bedoeld als R1), en een tweede onderzoeker aan het hoofd van de muntjak in een comfortabele en veilige positie te houden en om de melk (R2) te verzamelen.

  1. Afhankelijk van de verdoving gebruikt, moeten melken in hun hokken worden uitgevoerd ofwel 1) naar een veilige plaats voor hen moeten ze wakker worden tijdens de procedure (-midazolam veroorzaakte) in een-beddengoed gratis voorkamer 2) of om schoon te houden (BAM- geïnduceerde).
  2. R1 en R2 moeten worden uitgerust met-ethanol gedrenkt gaas en diverse 15 ml conische polypropyleenbuizen om de melk te houden.
  3. Zoals de oxytocine begint door te voeren, zal de melkafgifte zichtbaar in borstklieren gebied de muntjak geworden. R1: Sanitize gehandschoende handen en vingers, alsmede de gehele uier en elke individuele speen van het dier met de ethanol gedrenkt gaas. R2: Houd het hoofd van de muntjak in een veilige en comfortabele positie om het gemak van de ademhaling mogelijk maken en helpen voorkomen pens oprispingen. Houd de collectie buis cl OSE op de speen gemolken zonder aan te raken om mogelijke besmetting te voorkomen.
  4. Kolven van de ene speen met behulp van de duim en wijsvinger om knijp het borstweefsel in een opwaartse beweging totdat de speen wordt volgezogen met melk, en zachtjes rol de melk uit de speen en in de buis die R2 houdt (zie figuur 2 ).
  5. Opmerking: De melk komt uit in een stroom, dus is het belangrijk voor R2 de verzamelbuis geplaatst dat weinig tot geen melk zal worden verspild.
  6. Uier De muntjak is verdeeld in kwadranten. R1: Blijf kolven van elk kwadrant totdat de melk niet meer stroomt gemakkelijk. Als de melk niet kan worden uitgedrukt van de ene speen, uiten van alle andere spenen alvorens terug te keren naar de eerste. Het is zowel aanvaardbaar en nuttig om terug te komen en voortdurend uiten melk van dezelfde speen moet produceren meer melk dan de andere.

4. Verdoving Omkering in de Doe

t "> Het is gebruikelijk voor-midazolam geïnduceerde doe om te beginnen om wakker te worden tijdens het melken. In de meeste gevallen zal de hinde proberen te ontsnappen voordat alle melk is geuit. wordt Minor terughoudendheid gebruikt in een poging om de melk te verhogen opbrengst, maar de veiligheid en het comfort van zowel de onderzoekers en de hinde zijn even belangrijk.

  1. Dien atipamezol met 2,5 mg / mg medetomadine subcutaan voor een snelle ommekeer van BAM verdoofd doe.
    Opmerking: Met beide soorten verdoving, is het noodzakelijk om een ​​nauwkeurige observatie van de hinde handhaven totdat ze in staat is in haar eentje te lopen zonder te struikelen of vallen, en is in staat om te eten en te drinken zonder angst voor aspiratie of stikken. Geen nadelige gevolgen zijn geconstateerd met betrekking tot het vermogen van de fawn om verpleegkundige na het ophalen van melk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Muis

Uit onze experimenten hebben we vastgesteld dat het mogelijk is om ongeveer 100-400 pl melk ve laboratoriummuis, afhankelijk van verschillende variabelen verzamelen. Deze variabelen zijn 1) het bedrag van de tijd gereserveerd voor het verzamelen, 2) de dosis oxytocine toegediend, 3) hoeveel pups de dam is momenteel verpleging en 4) de hoeveelheid tijd na de bevalling. Onze studies hebben aangetoond dat de hoogste opbrengst wordt verkregen wanneer de dammen gescheiden va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Muis

Er zijn verschillende factoren om rekening te houden bij het verzamelen van melk van een muis, waaronder 1) het bedrag van de tijd gereserveerd voor het verzamelen, 2) de dosis oxytocine toegediend, 3) hoeveel pups de dam is momenteel verpleging en 4) het bedrag van de tijd die is verstreken sinds de bevalling op het moment van de collectie. Met behulp van eerdere studies als leidraad hebben we besloten om de voorwaarden voor de melkgift te optimaliseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Deze experimenten werden gefinancierd door de NIH-subsidie #RAI093634A. We willen onze grote dank betuigen aan Jenny Powers, DVM, PhD, voor haar hulp bij het melken van muntjaks.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Materialen—Muis
Ketamine (KetaVed 100 mg/ml) (dosis: 80-100 mg/kg)MWI/Vedco011075
Xylazine (TranquiVed 100 mg/ml) (dosis: 5-10 mg/kg)MWI/VedcoNADA 139236
OogvochtMWI/Apexa701013
Oxytocine (2 IU/kg)Vet One501013
Materialen—Muntjak
Midazolam (1-2 mg/kg)Amerisource Bergen Drug Corp924326Optioneel: de onderzoeker kan ofwel Midazolam alleen of de BAM-combinatie als verdoving gebruiken
Butorphanol tartraat (Torbugesic) (0,45 mg/kg)Fort Dodge Animal HealthNADA 135-780
Azaperone tartraat (0,25 mg/kg)ZooPharm
Medetomadine HCl (0,07 mg/kg)ZooPharm
Antipamezol hydrochloride (Antisedan) (dosis: 0,25 mg/kg)Orion CorporationNADA 141-033
Oxytocine (10 IU/kg)Vet One501013
Apparatuur—Muis
P-200 PipetmanGilsonF123601
200 μl pipette tipsLight LabsB-2004-SH
1 ml spuitenMWI005427
27 G naaldenMWI002031
Apparatuur—Muntjak
15 ml conische buisjesVWR21008-918
22 G naaldenMWI873
3 ml luer lock spuitenMWI001377

Referenties

  1. Dueling, S. Muntiacus reevesi. Animal Diversity Web. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Muntiacus_reevesi (2004).
  2. Pei, K., Taber, R., O'Gara, B., Wang, Y. Breeding cycle of the Formosan Reeves muntjac (Muntiacus reevesi micrurus) in northern Taiwan, Republic of China. Mammalia. 59 (2), 223-228 (1995).
  3. Browning, S. R. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J. Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
  4. Van de perre, P. Transfer of antibody via mother's milk. Vaccine. 21 (24), 3374-3376 (2003).
  5. Maden, C. Genetically modified mice produce human milk protein. BioNews. , (2009).
  6. Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab. Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
  7. Depeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
  8. Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: effects of litter size and lactation. 84 (1), 127-133 (1986).
  9. Hedrich, H. J., Bullock, G. R. The laboratory mouse. , 735-736 (2004).
  10. Nishimori, K., Young, L. J., Guo, Q., Wang, Z., Insel, T. R., Matzuk, M. M. Oxytocin is required for nursing but is not essential for parturition or reproductive behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (21), 11699-11704 (1996).
  11. Miller, B. F., Osborn, D. A., Lance, W. R., Howze, M. M., Warren, R. J., Miller, K. V. Butorphanol-azaperone-medetomidine for immobilization of captive white-tailed deer. 45 (2), 457-467 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Muizenmodeloxytocinetoedieninganesthesieprocedurehandmatige expressieP 200 pipettesteriele opvangbuisjesmassage van het borstweefselherstel van dierveiligheid

Gerelateerde artikelen