Monitoring Veranderingen in Membrane Polariteit, Membraan Integriteit, en intracellulaire Ion concentraties in Streptococcus pneumoniae Het gebruik van fluorescente kleurstoffen

Samenvatting

Unlike die gezien eukaryoten, er een gebrek aan studies die details membraan depolarisatie en ionenconcentratie veranderingen in bacteriën, vooral als hun kleine formaat maakt conventionele meetmethoden moeilijk. Hier hebben we detail protocollen voor toezicht op dergelijke gebeurtenissen in de grote Gram-positieve ziekteverwekker Streptococcus pneumoniae met behulp van fluorescentie technieken.

Samenvatting

Membraan depolarisatie en ionfluxen zijn gebeurtenissen die uitgebreid bestudeerd in biologische systemen vanwege hun vermogen om diepgaande impact cellulaire functies, waaronder energetica en signaaltransmissie. Hoewel fluorescentie-en elektrofysiologische werkwijzen, inclusief verbruik elektrode en patch-klemming, zijn goed ontwikkeld voor het meten van deze gebeurtenissen in eukaryotische cellen, methode voor het meten soortgelijke gebeurtenissen in microörganismen gebleken moeilijker te ontwikkelen gezien hun kleine grootte in combinatie met complexe buitenoppervlak bacteriën afscherming het membraan. Tijdens onze studies van de dood-initiatie in Streptococcus pneumoniae (pneumokok), wilden we de rol van het membraan gebeurtenissen, waaronder veranderingen in polariteit, integriteit, en intracellulaire ionenconcentraties helderen. Het zoeken van de literatuur, vonden we dat heel weinig studies bestaan. Andere onderzoekers hadden radio-isotoop opname of evenwicht te ion griep meten bewaaktxes en membraanpotentiaal en een beperkt aantal studies, vooral bij Gram-negatieve organismen, had enig succes gezien met behulp carbocyanine of oxonol fluorescente kleurstoffen aan membraanpotentiaal meten, of het laden van bacteriën met cel-permeant acetoxymethyl (AM) ester versies van ion-gevoelige fluorescente indicator kleurstoffen. We daarom vastgesteld en de geoptimaliseerde protocollen voor het meten van membraanpotentiaal, breuk, en ion-transport in de Gram-positieve organisme S. pneumoniae. We ontwikkelden protocollen met de bis-oxonolkleurstof DiBAC ₄ (3) en de mobiele impermeant kleurstof propidiumjodide membraan depolarisatie en scheuren te meten, respectievelijk, alsook werkwijzen optimaal laden pneumokokken met de AM esters van de kleurstoffen ratiometrische Fura-2, PBFI en BCECF veranderingen in intracellulaire concentratie van ^{Ca2 +,} K ⁺ en H ^+, respectievelijk detecteren, met fluorescentie-detectie plaatlezer. Deze protocollen zijn het eerste in hun soort voor de pneumokoken de meerderheid van deze kleurstoffen niet zijn gebruikt in een andere bacteriële species. Hoewel onze protocollen geoptimaliseerd voor S. pneumoniae, wij geloven dat deze aanpak moet een uitstekend uitgangspunt voor soortgelijke studies in andere bacteriesoorten vormen.

Inleiding

Ons laboratorium heeft een eiwit-lipide complex van moedermelk genoemd GEHUCHT (voor humaan alfa-lactalbumine gemaakt dodelijk tumorcellen) die apoptose induceert in tumorcellen geïdentificeerd, maar kan ook een verscheidenheid van bacteriële species ^1,2 doden. De soorten die bleken bijzonder gevoelig te zijn die de luchtwegen richten, met Streptococcus pneumoniae (pneumokok de) tonen de grootste gevoeligheid en een apoptose-achtige fenotype dood ^2,3. Membraan depolarisatie en specifieke ionentransport gebeurtenissen zijn goed beschreven en cruciale gebeurtenissen gedurende geprogrammeerde celdood in eukaryote cellen, vooral in de mitochondriën, waar radioactieve TPP ⁺ ionen en fluorescente kleurstoffen zoals JC-1 en TMRE zijn gebruikt om depolarisatie van de mitochondriale membraan ³ tonen ^-5. Dus zochten we om meer te leren over het effect van gehucht op deze membraan-gerelateerde functies in de pneumokok als we onze inspanningen gericht opontwikkelen van een beter begrip van de mechanische componenten van de apoptose-achtig fenotype in bacteriën, met grote mogelijkheden voor het identificeren van nieuwe antibacteriële therapie of vaccinkandidaten in het proces.

Bij het ​​streven naar de vaststelling van protocols voor onze mechanistische studies, ontdekten we dat in tegenstelling tot de goed beschreven methodiek in eukaryote systemen, zijn er zeer weinig gepubliceerde studies detaillering elektrofysiologie en ionen transport mechanismen van de bacteriële membraan ^6,7. Dit wordt voornamelijk toegeschreven aan de kleinere omvang van micro-organismen en hun oppervlak architectuur, met name de aanwezigheid van celwand, dat beperkt de toegankelijkheid van het membraan voor gebruik van conventionele methoden zoals eukaryotische patchklemmen, hoewel sommige studies met grote protoplasten uitgevoerd met wisselend succes ^8,9. Naarmate het werk met deze gigantische protoplasten is niet een ideaal of zelfs praktische methode voor de meeste soorten bacteriën, omdat het de mens nodig heeftipulated bacteriën in een onnatuurlijke en abiotische toestand, de beperkte studies van bacteriële membraan polariteit die zijn uitgevoerd zijn voornamelijk werkzaam flowcytometrie en gebruik van cyanine en oxonol fluorescente kleurstoffen ^10-16.

In plaats van flowcytometrie, die individuele fluorescentie metingen verzamelt ve bacterie op een enkel tijdstip, kozen we een fluorescentiedetectie plaatlezer om fluorescentie-intensiteit van bacteriële suspensies detecteren in een 96-putjes tijd. Zo konden we een populatie van bacteriën op verschillende tijdstippen met veel grotere eenvoud en gemak, en continu de fluorescentie kinetiek van de gehele bevolking voor langere tijd, hetgeen moeilijk te bereiken met flowcytometrie. Na het testen van een grote verscheidenheid van potentiële gevoelige fluorescente kleurstoffen (waaronder de genoemde voor gebruik met de mitochondria), bereikten wij de beste technische en praktische succes met debis-oxonolkleurstof DiBAC genoemd ₄ (3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethineoxonol) veranderingen in polariteit controleren.

We vonden ook waardevol gelijktijdig verstoringen in de integriteit van het membraan te controleren met propidium jodide (PI). Deze kleurstof fluoresceert bij binding aan nucleïnezuur, maar is alleen in staat om dat te doen als de integriteit van de bacteriële membraan wordt aangetast, waardoor het de populaire component gebruikt om dode cellen te detecteren in levende-dode kleuring assays. Naast PI SYTOX groen en TO-PRO-1 fluorescerende kleurstoffen die qua actie en zijn eerder voor bacteriën in enkele studies met flowcytometrie detectiemethoden ^17. We kozen ervoor om PI te gebruiken vanwege de golflengte die ons toeliet om de fluorescentie monitoren gelijktijdig met DiBAC in een bepaald monster.

In onze studies hebben we GEHUCHT, alsmede andere verwante eiwit-lipide complex met bactericide activiteit waargenomenbekend als Eloa, geïnduceerde depolarisatie en breuk van het bacteriële membraan, zoals aangegeven door een toename in de fluorescentie van beide kleurstoffen bij behandeling van pneumokokken ^3,18,26. Voor beide complexen waargenomen dat de fluorescentie-intensiteit van DiBAC ₄ (3) verhoogd vóór de toename in intensiteit van PI, wat aangeeft dat depolarisatie zich vóór scheuren en is daarom een specifieke gebeurtenis veroorzaakt door onze bactericide eiwit-lipide-complexen van belang. Dit onderscheid is belangrijk te maken, als breuk van het membraan kan zelf leiden tot niet-specifieke depolarisatie. Meten en analyseren van zowel DiBAC ₄ (3) en PI fluorescentie kinetiek gelijktijdig konden we de relatie tussen de twee membraanlagen gebeurtenissen, wat een extra voordeel van fluorometrie plaats van doorstroomcytometrie onderzocht.

Om bacteriële ionenflux bewaken, is er een aantal eerdere succes met het gebruik van radio-isotopen, waaronder het meten van de opname van45 Ca ^{2 +} in de pneumokok ^19,20, die we ook hebben gebruikt in onze recente studies ^{18, 21.} Het werken met deze radioactieve ionen heeft een aantal nadelen. Ze kunnen duur, tijdrovend en rommelig, en kan ook het individu bloot uitvoeren van het experiment te schaden, afhankelijk van de isotoop van belang. Bovendien is het moeilijk om snelle veranderingen tijdig te signaleren. Zo hebben we gedraaid naar een andere manier van meten die acetoxymethyl (AM) ester versies van ionen-gevoelige fluorescente indicator kleurstoffen werken. Op zichzelf is de indicatorkleurstof opgeladen en niet gemakkelijk door het membraan, maar met de toevoeging van de lipofiele estergroep, kan nu ongeladen moleculen door het membraan van de bacterie. Bij binnenkomst in de inrichting, de bacteriële esterasen splitsen de estergroep, vrij blijft de kleurstof in de cel en opnieuw geladen, zijn vermogen om de cel te verlaten aanzienlijk vertragen en waardoor de kleurstof to ophopen in de tijd. Echter, het gebruik van deze kleurstoffen ester is slechts in enkele bacteriesoorten beschreven veranderingen in intracellulaire Ca ^{2 + 22-24} en H ^{+ 16} sporen met verschillende methoden laden, detectie, en succes.

Met een verlangen om veranderingen in intracellulaire Ca ^{2 +} monitoren en ook K ⁺ en H ⁺ niveaus in S. pneumoniae na behandeling met HAMLET en andere verbindingen, we succesvol aangemaakt protocollen om efficiënt te laden fluorescerende indicator kleurstoffen in bacteriële cellen. Effectieve laden in bacteriën vereist zowel probenecide dat kleurstofretentie stijgt met anion-transporteurs en PowerLoad, een eigen verbinding van Life Technologies dat laden efficiëntie verhoogt blokkeren. Fura-2/AM (detecteren van Ca ^{2 +),} PBFI / AM (detecteren van K ^+), en BCECF / AM (detecteren van H ⁺⁾ werden met succes in zowel niet-ingekapselde en ingekapselde pneumokokken st geladenregens waarmee meting van de resulterende fluorescentie patronen na toevoeging van ionoforen zoals ionomycine ^{(Ca2 +} ontkoppelaar), valinomycine (K ⁺ ontkoppelaar) en CCCP (H ⁺ ontkoppelaar) met fluorescentie detectie plaatlezer ^{18, 21.}

Protocol

1. Voorbereiden van bacterieculturen

1. Groeiende kweek voor gebruik in proeven
   1. In een 37 ° C verwarmen blok, ontdooien van een bevroren voorraad-flesje van S. pneumoniae en zijn inhoud aan 9 ml verse, voorverwarmde Todd-Hewitt bouillon met 0,5% gistextract (THY) voor een totaal volume van 10 ml in een glazen kweekbuis.
   2. Incubeer statisch bij 37 ° C totdat de kweek mid-log fase (Abs ≈ _{600 nm} 0,5-0,6) bereikt.

2. Detecteren membraandepolarisatie en Rupture

1. Voorbereiden van reagentia
   1. Bereid een 50 uM voorraad van DiBAC ₄ (3) in 100% DMSO, en een 2 mg / ml voorraad van PI in DDH ₂ O. De DiBAC ₄ (3) bestand is stabiel bij -20 ° C gedurende ten minste 6 maanden. De PI stock is stabiel bij 4 ° C gedurende ten minste 6 maanden.
   2. Wikkel voorraden in folie ter bescherming tegen het licht.
2. Het ladenbacterie
   1. Pellet de bacteriële cellen uit stap 1.2.2 door centrifugeren bij 2400 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en tweemaal spoelen door het verwijderen van het supernatant, resuspenderen de pellet in 10 ml 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), gecentrifugeerd en opnieuw bij 2400 xg gedurende 10 minuten.
   2. Verwijder de supernatant en resuspendeer pellet in PBS tot het oorspronkelijke volume. Dit zal ongeveer 10 ⁸ kolonievormende eenheden bacteriën per ml. Verwijderen 1 ml (genoeg voor 5 monsters) van de gewassen cellen en plaats in een microcentrifugebuis.
   3. Om deze cellen, voeg 25 ul van een 1 M-filter gesteriliseerde voorraadoplossing van glucose (bereid in DDH ₂ O en gefiltreerd door een 0,45 um filter) voor een uiteindelijke concentratie van 25 mM glucose, en incuberen in een 37 ° C verwarmingsblok vijftien minuten. OPMERKING: Dit levert energie voor alle ATP-afhankelijke membraan kanalen en cellulaire componenten. De noodzaak van deze stap kan variëren afhankelijk van het experiment.
   4. Voeg 5 ul van de 50 pM DiBAC ₄ (3) voorraad en 10 ul van de 2 mg / ml PI voorraad. Dit verschaft een eindconcentratie van 250 nM en 20 ug / ml. Meng goed door en neer te pipetteren meerdere malen. Voeg 200 ul van de celsuspensie aan elk monster putje van een heldere 96-well plaat.
3. Detecteren van fluorescentie
   1. Plaats plaat in een voorverwarmde (37 ° C) fluorescentiedetectie plaat lezer.
   2. Waarborgen dat de juiste filters zijn in de plaats voor DiBAC ₄ (3) (490 nm excitatie, 516 nm emissie) en PI (535 nm excitatie, 617 nm emissie) detectie.
   3. Om rekening te houden (en gelijktijdig monitoren) verevening van DiBAC ₄ (3) over het membraan, stelt de lezer om de fluorescentie metingen elke min voor ongeveer 30-40 minuten, of tot de meting stabiliseert, dit dient als een "voorbehandeling" lezen.
   4. Uitwerpen bord en voeg de experimentele middel van keuze en IMMEDiately plaatst de plaat terug in de lezer te blijven volgen DiBAC ₄ (3) en PI fluorescentie voor de gewenste tijdsduur. Als de behandeling van verschillende monsters tegelijk, met een meerkanaalspipet nuttig kan zijn om de agent tegelijk toe te voegen aan alle putjes.
   5. De lezingen exporteren naar een data-analyse programma zoals Microsoft Excel. Plot fluorescentie in de tijd om membraandepolarisatie en scheuren te evalueren. Toenemende fluorescentie van DiBAC en PI geeft aan dat depolarisatie en scheuren worden voorkomen.

3. Het detecteren van veranderingen in intracellulaire Ca ^{2 +} of K ⁺ concentraties

1. Voorbereiden van reagentia en beladingsbuffer
   1. Bereid de volgende reagentia: 5 mM voorraadoplossing van de ion-gevoelige fluorescente kleurstof (Fura-2/AM of PBFI / AM, voeg de juiste hoeveelheid DMSO een buisje met 50 ug van de kleurstof), "100x" probenecide (voeg 1 ml PBS om een ​​77 mg injectieflacon). De gesolubiliseerdekleurstoffen kunnen bij -20 ° C na bevriezen en stabiel in oplossing gedurende 3 maanden, terwijl het probenecide stabiel in oplossing bij -20 ° C gedurende 6 maanden.
   2. Bereid 1 ml 2x laadbuffer als volgt: In de bodem van een 15 ml plastic conische buis, afzien 20 gl 100x PowerLoad concentraat (stabiel bij 2-8 ° C gedurende 6 maanden), gevolgd door 2 pi van het 5 mM ion -gevoelige kleurstof direct in de PowerLoad. Vortex kort te mengen. Voeg 960 ul van PBS gevolgd door 20 ui 100x probenecide. Vortex het mengsel nog een laatste keer. Wikkel in folie ter bescherming tegen licht.
2. Het laden van de bacteriën met kleurstof
   1. Pellet en was de mid-log fase bacteriecultuur zoals beschreven in 2.2.1. Verwijder de supernatant en resuspendeer pellet in 5 ml PBS om een ​​"2x" celsuspensie te maken.
   2. Voeg 1 ml van de celsuspensie 2x de 2x laadbuffer. Dit voorziet in een eindvolume van 2 ml en definitieve concentraties van 1x PowerLoad, 5 uM fluorescerende kleurstof, en 1x probenecide. LET OP: Deze schorsing biedt voldoende volume voor 10 monsters omdat elk monster goed voor de meting 200 ul zal bevatten.
   3. Incubeer in een 37 ° C waterbad gedurende 75 min, beschermd tegen licht. OPMERKING: De kleurstof wordt in de bacteriële cellen opgeladen bij afwezigheid van glycolytische substraten en in aanwezigheid van probenecide om efflux van kleurstof minimaliseren.
   4. WASH 1: Pellet de cellen door centrifugeren bij 2400 xg gedurende 10 minuten, verwijder supernatant en resuspendeer in 2 ml PBS met 1x probenecide. WASH 2, 3: Herhaal stap 3.2.4 2x. Incubeer bij 37 ° C gedurende nog 30 minuten. Hierdoor kan de tijd voor bacteriële esterasen tot de AM ester groep weg van de geïnternaliseerde fluorescerende kleurstoffen hydrolyseren.
   5. WASH 4: Pellet de cellen door centrifugeren bij 2400 xg gedurende 10 minuten, verwijder supernatant en resuspendeer in 2 ml PBS met 1x probenecide. OPMERKING: Afhankelijk van de experiment, kan glucose hier worden toegevoegd terug om nieuwe energie op de bacteriën.
3. Detecteren van fluorescentie
   1. Voorverwarmen de fluorescentie detectie plaat-lezer plaataflezer tot 37 ° C.
   2. Voor elk gewenst monster, voeg 200 ul van de beladen cellen (uit stap 3.2.8) aan de putjes van een 96-wells plaat. (Voer de volgende stappen uit om de voltooiing van een goed / monster per keer).
   3. Om een ​​baseline lezen voor een goed, laat de plaat in de fluorescentie detectie plaat-lezer om de fluorescentie te meten (340 nm excitatie / 510 nm emissie voor "Waarde 1" en 380 nm excitatie / 510 nm emissie voor "Waarde 2") op te stellen elke seconde gedurende een min.
   4. Eject bord, voeg de behandeling van de keuze om dat goed (in een klein volume van ongeveer 5 pl), snel pipet op en neer een paar keer om te mengen, en onmiddellijk terug te plaatsen in de fluorescentie detectie plaat-lezer om elke seconde te lezen voor de gewenste tijdsduur. (Indien de inprojectoren verbonden met de plaat reader beschikbaar, deze kunnen ook worden gebruikt om naadloos voeg de gewenste behandeling, waardoor de noodzaak om de lees Stopt de plaat).
   5. De lezingen exporteren naar een data-analyse programma zoals Microsoft Excel. Bereken de verhouding van de fluorescentie waarden voor elk tijdpunt door deling Waarde 1 door Value 2 en plot de verhouding waarden in een grafiek.

4. Het detecteren van veranderingen in intracellulaire pH

1. Voorbereiden van reagentia en kalibratie buffers
   1. Bereid de volgende reagentia: 5 mM voorraad BCECF / AM (. Voeg de juiste hoeveelheid DMSO een buisje met 50 ug van de kleurstof Deze voorraad is stabiel bij -20 ° C gedurende 3 maanden), 100x probenecide (1 ml PBS een 77 mg injectieflacon). 1 mM stock bereiding van nigericine in ethanol (nodig om de intracellulaire pH (pH evenwicht _i) van de cellen om de pH van de omringende buffer Deze voorraad is stafel bij -20 ° C gedurende 6 maanden);. 0,5 mM voorraad van Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) in DMSO (protonophore aan het proton drijfkracht ontkoppelen Deze voorraad is stabiel bij -20 ° C gedurende 6 maanden)
   2. Bereid 10 ml van de volgende hoge kaliumgehalte buffers: 135 mm KH ₂ PO _4/20 mM NaOH (eenbasisch) en 110 mm K ₂ HPO _4/20 mM NaOH (dibasisch). Filter steriliseren met behulp van een 0,45 pm filter. (Deze buffers kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C tot gebruik).
   3. Meng de hoge kaliumbuffers met de noodzakelijke verhoudingen hoog kaliumgehalte buffers met ten minste 5-6 pH variërend 6,5-8,0.
   4. Bereid 1 ml 2x laadbuffer als volgt: In de bodem van een 15 ml plastic conische buis, afzien 40 pl 100x PowerLoad, gevolgd door 20 pi van de 5 mM ion-gevoelige kleurstof direct in de PowerLoad. Vortex kort te mengen. Voeg 900 ul van PBS gevolgd door 40 ui 100x probenecide. Vortex het mengsel nog een laatste keer. Wikkel in folie ter bescherming tegen licht.
2. Het laden van de bacteriën met kleurstof
   1. Pellet en was de 8 ml van de mid-log fase bacteriecultuur zoals beschreven in 2.2.1. Verwijder supernatant, resuspendeer pellet in 2 ml PBS om een ​​"4x" celsuspensie maken.
   2. Voeg 1 ml van de celsuspensie 4x de 2x laadbuffer. Dit voorziet in een eindvolume van 2 ml en eindconcentraties 2x cellen 2x PowerLoad, 50 uM fluorescerende kleurstof en 2x probenecide.
   3. Incubeer in een 30 ° C waterbad gedurende 40 min, beschermd tegen licht. OPMERKING: De kleurstof wordt in de bacteriële cellen bij de lagere temperatuur van 30 ° C en bij afwezigheid van glycolytische substraten efflux van kleurstof minimaliseren geladen.
   4. WASH 1: Pellet de cellen door centrifugeren bij 2400 xg gedurende 10 minuten, verwijder supernatant om zich te ontdoen van overtollige kleurstof, en resuspendeer in 4 ml PBS met 2x probenecide eennd 1 mM glucose (om de bacteriën reenergize). WASH 2, 3: Herhaal stap 4.2.7 tweemaal met uiteindelijke resuspensie in 4 ml PBS (een eindconcentratie van 1x cellen) met 2x probenecid en 10 mM glucose.
   5. Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Hierdoor kunnen de cellen volledig energie en voldoende tijd voor bacteriële esterasen tot de AM ester groep weg van de geïnternaliseerde BCECF klieven.
3. Vaststelling achtergrond fluorescentie en in vivo kalibratiecurve
   1. Voorverwarmen de fluorescentie detectie plaat-lezer plaataflezer tot 37 ° C.
   2. Om achtergrondfluorescentie bepalen, filter-steriliseer ongeveer 500 pl van het geladen en geactiveerd bacteriesuspensie (uit stap 4.2.7) om de bacteriën te verwijderen en voeg 200 ul van filtraat naar de put van de 96-well plaat.
   3. Plaats plaat in de fluorescentie detectie plaat-lezer om de fluorescentie te meten (490 nm excitatie / 530 nm emissie voor"Waarde 1" en 440 nm excitatie / 530 nm emissie voor "Waarde 2") gedurende 1 minuut. Deze achtergrond fluorescentie moet worden afgetrokken voordat de berekening van de ratio's voor zowel de ijklijn, en de experimentele monsters.
   4. Om een in-vivo ijkcurve te bepalen, wassen 500 pi fracties van de geladen en energiek cellen uit stap 4.2.7 eens en resuspendeer in hoog kaliumgehalte buffers bij verschillende pH-waarden (variërend 6,5-8,0).
   5. Voeg 20 uM nigericine de monsters aan de intracellulaire pH van de cellen equilibreren om de pH van de omringende buffer en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Voeg 200 ul van bacteriën / pH buffercombinaties op de putjes van een 96-wells plaat.
   6. Plaats plaat in de fluorescentie detectie plaat-lezer om de fluorescentie voor een paar minuten te meten aan een gestage leesvoer voor iedere goed vast te stellen. De lezingen exporteren naar een data-analyse programma zoals Microsoft Excel.
   7. Na aftrek van de background fluorescentie waarden, het berekenen van de verhouding van de fluorescentie waarden door te delen Waarde 1 bij Waarde 2. Teken de verhouding waarden voor elke pH-buffer om de kalibratiecurve samen te creëren. (Een ijkcurve worden gegenereerd voor elke nieuwe partij geladen cellen, de hoeveelheid fluorescerende kleurstof die in de bacteriën wordt geladen elke keer kan variëren).
4. Meten van veranderingen in intracellulaire pH
   1. Voor elk gewenst monster, voeg 200 ul van de geladen en geactiveerde cellen (uit stap 4.2.7) aan de putjes van een 96-wells plaat.
   2. Plaats de plaat in fluorescentiedetectie plaat lezer en meet de fluorescentie van de monsters iedere 5 seconden gedurende 5 minuten.
   3. Verwijder de plaat en voeg 10 uM CCCP om een ​​putje (dient als positieve controle voor het verminderen van intracellulaire pH) en de experimentele agent (s) van belang de andere putjes. Hun effecten nauwkeurig te vergelijken in de tijd, voeg de CCCP en agenten van de keuze op hetzelfde moment met behulp amultichannel pipet.
   4. Onmiddellijk terug de plaat aan de plaat-lezer en blijven meten fluorescentie elke 5 sec gedurende 10 minuten. Als extra controle uitwerpen de plaat en voeg 20 uM nigericine alle monsters de pH _i van de bacteriën evenwicht om de pH van de omringende buffer en lees gedurende 5 minuten.
   5. Na aftrekken van de achtergrond fluorescentie waarden berekent de verhouding van fluorescentie van elk monster. Interpoleren de pH _i voor elke lezing van de ijkcurve.

Resultaten

Voor alle experimenten, er is een monster en stel aanwezig in elk putje omstandigheden. Dus elke tracing vertegenwoordigt de fluorescentie intensiteit van een volledige populatie van bacteriën in de tijd. De resultaten moeten gemakkelijk interpreteerbaar zijn, met een duidelijk onderscheid tussen de fluorescentie van de behandelde monsters en de onbehandelde controles. De kinetiek en intensiteit van een waargenomen verandering in fluorescentie kan informaties mogelijk mechanisme en omvang van de gebeurtenis wor...

Discussie

Ondanks de beperking dat formaat weer voor elektrofysiologie behulp van klassieke methoden om veranderingen in de polariteit en integriteit van het membraan en veranderingen in ion concentraties in bacteriën te detecteren, hebben we een manier om deze gebeurtenissen S. meten beschreven pneumoniae met fluorescerende kleurstoffen. De protocollen zijn de eerste in hun soort beschreven voor de pneumococcus en een van de weinige beschreven bacteriële soorten in het algemeen. Met behulp van een fluorescentie...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Todd-Hewitt bouillon	Bacto, BD Diagnostics	249240
Gistextract	Bacto, BD Diagnostics	212750
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS; pH 7.2)	Invitrogen (GIBCO)
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879	DMSO
DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituurzuur) trimethine oxonol)	Molecular Probes	B-438
Propidiumjodide	Sigma-Aldrich	P4170	Maak op in gedeïoniseerd water
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich
PowerLoad	Molecular Probes	P10020	100x concentraat
Probenecid	Molecular Probes	P36400	Maak 100x stockoplossing door 1 ml PBS toe te voegen aan één 77 mg flacon
Fura-2/AM	Molecular Probes	F1221	Speciale verpakking (50 µg aliquots)
PBFI/AM	Molecular Probes	P1267	Speciale verpakking (50 µg aliquots)
Nigericine	Sigma-Aldrich	N7143
KH2PO4	JT Baker	3246-01	monobasic
NaOH	JT Baker	5565-01
K2HPO4	JT Baker	4012-01	dibasic
BCECF/AM	Molecular Probes	B1170	Speciale verpakking (50 µg aliquots)
CCCP	Sigma-Aldrich		Protonofoor dat een instroom van H+ in het cytoplasma veroorzaakt, waardoor het elektrische potentiaal en de H+ gradiënt worden verstoord.
Kweekbuis	VWR	53283-802	Past op de Spectronic spectrofotometer; borosilicaatglas
Spectrofotometer	Thermo Scientific		Spectronic 20D+
15 ml plastic kegelbuis	Corning	430790
Doorzichtige 96-wells polystyreen microtiterplaat	Fisher Scientific	12-565-501
Plate reader	BioTek	Synergy 2 Multi-Mode
Gen5 software	BioTek	Gen5™ Software