Voorbereiding van Hydroxy-PAAM Hydrogelen voor Ontkoppeling van de Effecten van Mechanotransductie Cues

Samenvatting

We presenteren een nieuw polyacrylamide hydrogel, genaamd hydroxy-PAAM, die een directe binding van ECM eiwitten mogelijk maakt met minimale kosten of deskundigheid. De combinatie van hydroxy-PAAM hydrogels met microcontactprinten vergemakkelijkt onafhankelijke controle van de vele signalen van de natuurlijke cel micro-omgeving voor het bestuderen van cellulaire mechanostransduction.

Samenvatting

Het is nu algemeen bekend dat vele cellulaire functies worden gereguleerd door interacties van cellen met fysisch-chemische en mechanische signalen van hun extracellulaire matrix (ECM)-omgeving. Eukaryotische cellen voortdurend voelen de lokale micro-omgeving door bovengrondse mechanosensors fysieke veranderingen van ECM in biochemische signalen transduceren, en integreren deze signalen om specifieke veranderingen in genexpressie. Interessant fysicochemische en mechanische parameters van de ECM kan paar met elkaar lot van de cel reguleren. Daarom is een sleutel tot het begrijpen mechanotransduction is om de relatieve bijdrage van ECM signalen op cellulaire functies los te koppelen.

Hier presenteren we een gedetailleerd experimenteel protocol om snel en eenvoudig te genereren biologisch relevante hydrogels voor de onafhankelijke afstelling van mechanotransduction signalen in vitro. We chemisch gemodificeerde polyacrylamide hydrogels (PAAM) om hun intrinsiek niet-pat te overwinnenive eigenschappen door het opnemen van hydroxyl-gefunctionaliseerde monomeren acrylamide tijdens de polymerisatie. We verkregen een nieuwe PAAM hydrogel, genaamd hydroxy-PAAM die immobilisatie van elke gewenste aard van ECM eiwitten toestaat. De combinatie van hydroxy-PAAM hydrogelen met microcontactprinten stelt onafhankelijk regelen van de morfologie van afzonderlijke cellen, de matrix stijfheid, de aard en de dichtheid van ECM eiwitten. Wij bieden een eenvoudige en snelle methode die kan worden ingesteld in elk biologie lab om te studeren in vitro cel mechanotransduction processen. Wij valideren deze roman tweedimensionale platform door het uitvoeren van experimenten op endotheelcellen die een mechanische koppeling tussen ECM stijfheid en de kern aan te tonen.

Inleiding

Veel aspecten van de lokale cellulaire micro-omgeving (bijvoorbeeld stijfheid, poriegrootte, aard van eiwitten of cel-ligand density) een coördinaat set van regulerende signalen die cellulaire processen zoals motiliteit, celproliferatie, differentiatie en genexpressie. Modificaties van de fysicochemische eigenschappen van het extracellulaire milieu kan worden waargenomen door cellen en veroorzaken verschillende fysiologische gevolgen, zoals vervorming van cellulaire polarisatie, migratie en differentiatie. Het blijft echter onduidelijk hoe cellen vertalen ECM veranderingen in cellulaire biochemische signalen. Het is derhalve van groot belang te ontwerpen gecontroleerde in vitro micro-omgevingen die de interacties tussen cellen en hun micromilieu kan reproduceren voor het bestuderen mechanotransduction trajecten. Om dit probleem aan te pakken, hebben we onlangs een nieuwe methode ^1, genaamd hydroxy-PAAM hydrogels, om eenvoudig genereren twee-dimensional zachte matrices die toelaten om zelfstandig te beheersen belangrijke mechanotransduction aanwijzingen: matrix stijfheid, cel geometrie en opsluiting, de aard van de eiwitten en cel-ligand dichtheid.

ECM stuurt cellulaire processen via hellingen in morphogens (chemotaxis), lijm-eiwitten (haptotaxis) en stijfheid (durotaxis). In de afgelopen decennia, geavanceerde in vitro platformen werden ontwikkeld om deze extracellulaire signalen te isoleren om te plagen uit hoe cellen zijn in staat om biochemische en biofysische eigenschappen te vertalen naar fysiologische processen ^2-5. Elektronenbundel ^{6, 7} fotolithografie, fotochemische immobilisatie ⁸ of plasma geassisteerde technieken ⁹ zijn ontwikkeld om de groei van levende cellen op micropatterned substraten sturen. Hoewel deze technieken belangrijke resultaten hebben opgeleverd, de meeste van hen geen onderscheid tussen de individuele invloed van verschillende signalen op mobiele gedrag toestaanen ze technische faciliteiten die paar laboratoria kunnen veroorloven, verlangen. Onder deze technieken, microcontactprinten (μCP), heeft zich ontpopt als een robuuste en toegankelijke methode om cel-lijm micro-eilanden ¹⁰ te creëren. Meer recent zijn omvangrijke inspanningen ^11-14 werden geleverd om μCP ontwikkelen op hydrogels met instelbare starheid om de brede waaier van rigiditeiten waargenomen in levende weefsels te reproduceren. Onder deze werken, heeft polyacrylamide (PAAM) populair ¹⁵ geworden en is nu al een van de meest gebruikte polymeren gebaseerde matrices voor mobiele biomechanica assays.

PAAM oppervlakken worden vaak gefunctionaliseerd met de heterobifunctionele verknoper N-sulfosuccinimidyl-6-[4'-azido-2'-nitrophenylamido] (sulfo-SANPAH) en ECM eiwitten zijn gekoppeld aan het oppervlak door UV activering van de sulfo-SANPAH nitrofenyl azide groepen ^16. Een andere techniek bestaat uit het koppelen hydrazine eiwitten die zwaar zijn geoxideerdmet perjodaat ^17. Hynd en medewerkers introduceerde een techniek voor patroonvorming biomimetische hydrogel oppervlakken eiwitten en peptiden die fotopolymerisatie in aanwezigheid van een acroyl streptavidine monomeer ¹⁸ vereist. Meer recent Tseng et al. Hebben een nieuwe methode micropatterning ¹⁹ gebaseerd op diepe UV blootstelling van PAAM via een optische kwartsmasker die vereist geactiveerde PA gels incuberen met 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) gerapporteerd en N-hydroxysuccinimide (NHS) wateroplossingen vóór het eiwit voegen. Ondanks het vermogen van deze technieken die homogene en reproduceerbare eiwitten micropatterns creëren meeste lijden belangrijke beperkingen: lange synthesewerkwijzen (bijvoorbeeld dialyse, vriesdrogen, etc), dure chemische verbindingen (bijvoorbeeld, hyaluronzuur, sulfo-SANPAH) of diepe UV bestraling. Bovendien zijn deze technieken niet onafhankelijk modulatie substraat stijfheid, micropattern toestaangeometrie, ECM eiwit natuur, en cel-ligand dichtheid.

Rekening houdend met deze beperkingen, hebben we een nieuwe en eenvoudige-acrylamide gebaseerde aanpak die immobilisatie van een verscheidenheid van eiwitten en biomoleculen op zachte hydrogels maakt en maakt onafhankelijk afstemmen van mechanotransduction signalen om hun rol in cellulaire functies ontcijferen ontwikkeld. In plaats van het behandelen van PAAM hydrogels met agressieve chemische stoffen, introduceren we een commerciële acrylamide monomeer met hydroxylgroepen tijdens PAAM polymerisatie. Deze eenvoudige handeling overwint de intrinsieke anti-klevende eigenschap van PAAM hydrogels, zonder enige andere technische eisen.

De aanwezigheid van hydroxylgroepen leidt tot een hoge affiniteit van hydroxy-PAAM hydrogels voor eiwitten en biomoleculen die waterstofbinding interacties vormen. In combinatie met μCP, hydroxy-PAAM hydrogels maken een snelle generatie van tweedimensionale cultuur platform met een onafhankelijke controleop matrix stijfheid, type ECM eiwitten, cel-ligand dichtheid en kleverigheid beperkt, die beoogd een krachtig platform voor het bestuderen mechanotransduction zijn.

Het doel van dit protocol is om de nodige informatie voor het eenvoudig maken van hydroxy-PAAM hydrogels zonder enige expertise in materiaalkunde bieden. Het uiteindelijke doel is om een ​​middel te bieden voor onderzoekers om fysiologisch relevante vragen op cellulair en weefselniveau die kunnen leiden tot een beter begrip van mechanotransduction routes betrokken bij pathofysiologische mechanismen te vragen.

Protocol

1 Activeren van de Oppervlakte van de dekglaasjes

1. Plaats glas ronde dekglaasjes (25 mm diameter) in een petrischaal en uitstrijkje 0,1 M NaOH-oplossing op het voor 5 minuten (zuurkast aanbevolen).
2. Verwijder de NaOH-oplossing en dekglaasjes volledig onder te dompelen met steriele DDH ₂ O voor 20 min, terwijl zachtjes rocken op een rockende plaat in een steriele cultuur kap.
3. Drain steriele DDH ₂ O en herhaal de stap 1.2.
4. Verwijder de dekglaasjes met steriele pincet en plaats ze in een nieuwe petrischaal met de geactiveerde boven.
5. Droog dekglaasjes onder een gestage stroom van hoogzuiver stikstofgas.
6. In een steriele cultuur kap, smeer een dunne laag 3 (trimethoxysilyl) propyl acrylaat (92%) van de geactiveerde kant van het dekglaasje gedurende 1 uur.
7. Veelvuldig wassen dekglaasjes met 3 wasbeurten van steriele DDH ₂ O en dompel ze in steriele DDH ₂ O in een nieuwe petrischaal.
8. Tik op de petrischaalmet Parafilm en plaats het op een rocker plaat onder zacht schudden gedurende 10 minuten.
9. Verwijder de dekglaasjes van DDH ₂ O met een steriele pincet met fijne tips en plaats ze in een nieuwe petrischaal met de geactiveerde boven.
10. Bewaar bij kamertemperatuur op een droge plaats met aluminiumfolie om stof van het vasthouden aan de dekglaasjes voorkomen.

2 Voorbereiding van Hydroxy-PAAM Hydrogelen

1. Bereid een gewicht van 65 mg N-hydroxyethyl acrylamide (HEA) in een 1,5 ml Eppendorf buis. Het is belangrijk om een ​​nieuwe HEA te bereiden.
2. Voeg 1 ml van 50 mM HEPES buffer HEA en meng met een vortexer tot een totale HEA oplossen.
3. Voeg 400 ul van 40% w / w in HEPES acrylamide-oplossing en het vereiste volume van 2% w / w in HEPES bis-acrylamide-oplossing (zie tabel 1) op de gewenste hydrogel stijfheid bereikt. Aanpassen met 50 mM HEPES tot een eindvolume van 5 ml.
4. Meng de oplossing met behulp van een vortexer en ontgast hetin een vacuümkamer gedurende 20 min om de zuurstofconcentratie in de oplossing, die hydroxy-PAAM polymerisatie voorkomt.
5. Onder een steriele kap Filtreer de oplossing ontgast met een 0,2 micrometer poriegrootte om te steriliseren.
6. Activeren ronde glazen dekglaasjes (22 mm diameter) in een UV / ozon reiniger gedurende 7 min.
7. Bereid 100 ul van 10% ammoniumpersulfaat (APS)-oplossing, dat is 10 mg APS in 100 ul DDH ₂ O. Het is belangrijk om een ​​nieuwe APS te bereiden.
8. Voeg 2,5 gl tetramethyleendiamine (TEMED) en 25 gl APS oplossing van het gesteriliseerde hydroxy-PAAM oplossing (stap 2.5) om de polymerisatie te initiëren. Meng de oplossing door 3 opeenvolgende pipettings zonder introductie van bellen, onder steriele omstandigheden.
9. Onder een steriele kap, plaats een 25 ul druppel van het hydroxy-PAAM oplossing op een 25 mm dekglaasje (verkrijgbaar bij stap 1.9) en onmiddellijk plaats een 22 mm glass dekglaasje (bereid in stap 2.5) bovenop de druppel de hydroxy-PAAM oplossing knijpen. Centreer de 22 mm glas dekglaasje met een steriele pincet en glad uit eventuele luchtbellen.
10. Laat hydroxy-PAAM hydrogels polymeriseren bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Inverteer handmatig de resterende hydroxy-PAAM oplossing in de Eppendorf buis tot de voltooiing van de polymerisatie volgen.
11. Volledig dompel dekglaasjes met steriele DDH ₂ O en 22 mm dekglaasjes zorgvuldig gescheiden door invoering van de rand van een scheermes tussen de 22 mm dekglaasjes en hydroxy-PAAM hydrogel laag.
12. Wassen hydroxy-PAAM hydrogels met steriele PBS (3 uitwisseling van PBS) en laat de gel volledig ondergedompeld in steriele PBS om hydratatie te behouden.
13. WINKEL hydroxy-PAAM hydrogels in steriele PBS bij 4 ° C gedurende maximaal 3 dagen.

3 Polydimethylsiloxaan (PDMS) Microstamp Fabrication

OPMERKING: De fabricage van een silicium meester wordt voorafgaand aan sta vereistrt het PDMS microstamp fabricage. Dit microfabrication van een silicium meester kan worden gedaan door lithografische technieken, die gespecialiseerde apparatuur en training vereist. Samenwerkingen met een nanofabricage faciliteit worden aangemoedigd om het silicium meester fabriceren. U kunt ook contact opnemen met een bedrijf dat op maat gemaakte microstructured silicium masters fabriceert op de vraag. Het is belangrijk op te merken dat de fabricage van het silicium meester hoeft slechts eenmaal te worden gedaan. Inderdaad, microgestructureerde silicium masters onbeperkt worden gebruikt elastomere stempels produceren.

1. Mix PDMS en het hardingsmiddel in een verhouding 10: 1 in een plastic beker en meng met een pipet voor 10 minuten.
2. Ontgas de PDMS mengsel onder vacuüm om luchtbellen die tijdens de stap 3.1 gevormd verwijderen.
3. Plaats de microstructuur silicium meester in een petrischaal en wierp een 10-mm dikke laag ontgast PDMS mengsel op het zonder de vorming van luchtbellen.
4. Genees de PDMS 2 uur bij 60 ° C in eenoven.
5. In een stofvrije omgeving, peel-off van de PDMS laag en accijnzen 1 cm ² microstamps met een scalpel.
6. Behulp van een tang, plaats PDMS microstamps patroon-up in een petrischaal.

4 Micropatterning Hydroxy-PAAM Hydrogelen

1. Plaats PDMS microstamps in een ethanol / water (50/50)-oplossing en ultrasone trillingen gedurende 15 minuten.
2. Droog de stempels een stikstofstroom stroming en plaats ze-patroon in een UV / ozon cleaner (λ <200 nm) gedurende 7 minuten.
3. Onder een steriele kap, plaats een 150-ul druppel gewenste eiwitoplossing (bijvoorbeeld 100 ug / ml laminine in PBS of 25 ug / ml fibronectine in PBS) op het microgestructureerde oppervlak van 1 ^cm2 PDMS stempel.
4. Optioneel: Wijzig de concentratie van de eiwitoplossing om de cel-ligand dichtheid moduleren.
5. Spreid de eiwitoplossing over het stempel oppervlak door het bewegen met een steriele punt van een pipet naar elke hoek vande stempel.
6. Laat de eiwitoplossing geadsorbeerd aan het PDMS stempel voor 60 minuten onder een steriele kap. Schakel lampen aan eiwit schade te voorkomen.
7. Onder een steriele kap, overdragen hydroxy-PAAM gecoate dekglaasjes (beschikbaar vanaf stap 2.13) in een petrischaal.
8. Verwijder overtollig PBS uit het oppervlak van hydroxy-PAAM substraten met een lage stikstofstroom onder steriele omstandigheden. Stop de procedure zodra geen bewijs van stilstaand water op het gel oppervlak waargenomen. De gel dient niet grondig worden gedroogd in dit stadium.
9. Droog zorgvuldig de gestructureerde oppervlak van het PDMS stempel met een gestage stroom van hoogzuiver stikstofgas.
10. Pak de met eiwit beklede stempel met dressing weefsel pincet en plaats het gestructureerde oppervlak in contact met het gedroogde hydrogel oppervlak. Toepassen korte drukpunten met de punt van pincet op de bovenkant van de PDMS stempel om een ​​goed contact tussen stempel microfeatures en hydrogel oppervlak te verkrijgen.
11. Laat de PDMS stempel op The hydrogel oppervlak gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
12. Verwijder voorzichtig PDMS postzegels uit hydroxy-PAAM hydrogels met dressing weefsel tang en volg de stap 4.1 op de stempel te reinigen.
13. Was grondig de gestempelde hydroxy-PAAM hydrogels door 3 uitwisseling van PBS (pH = 7,4) in steriele omstandigheden gedurende 10 minuten per uitwisseling.
14. Optioneel: Extra micropatterns van andere ECM eiwitten kunnen aan de hydroxy-PAAM oppervlak worden toegevoegd door de volgende stappen 4,5-4,11.
15. Passiveren onbedrukte zones met een steriele oplossing van BSA bij 5 mg / ml in PBS gedurende een nacht bij 4 ° C onder zacht schudden op een schommelende plaat.
16. Was uitgebreid door 3 uitwisseling van PBS (pH = 7,4) in steriele omstandigheden gedurende 10 minuten per uitwisseling. In dit stadium kan gestempeld hydroxy-PAAM hydrogels worden bewaard bij 4 ° C maximaal een week.

5. Cell Afzetting op micropatterned hydroxy-PAAM Hydrogelen

1. Incubeer dekglaasjes in celmedium gedurende 30-45 min vóór plateren cells.
2. Was hechtende cellen gekweekt in een 75 ^cm2 kolf met steriele PBS bij 37 ° C en verwijder met 3 ml trypsine-EDTA of Accutase gedurende 10 minuten.
3. Breng de gewenste hoeveelheid voorverwarmde compleet groeimedium geschikt is voor uw cellijn in de kolf die de vrijstaande cellen en centrifuge de celsuspensie gedurende 3 min bij 650 x g.
4. Verwijder het supernatant met een micropipet en resuspendeer de cellen in compleet kweekmedium 15-20,000 cellen / ml.
5. Voeg 4 ml van de celoplossing een micropatterned dekglaasje (verkregen uit stap 5.1) en plaats het cel bedekte dekglaasje in een incubator bij 37 ° C en 5% vochtigheid gedurende 1-2 uur.
6. Zuig zachtjes losse cellen en vervang kweekmedium. Bijgesloten cellen naar de incubator laten verspreiden volledig (3-6 uur, afhankelijk van het celtype).

Resultaten

Figuur 1A toont de co-polymerisatie van acrylamide (AAm) en bisacrylamide (bis-AAm) met N-hydroxyethylacrylamide (HEA) monomeren die een primair hydroxyl gevormd door willekeurig radicaalpolymerisatie- een hydrofiele netwerk van polyacrylamide met ingebedde hydroxylgroepen (hydroxy-PAAM) . In dit protocol moet een gewicht 65 mg HEA worden verdund in een volume van 1 ml HEPES. Wetende dat de dichtheid van HEA is ongeveer gelijk aan een, gaan we ervan uit dat we een werkvolume van 1.065 pi (HEA + HEPES) t...

Discussie

Veel in vitro waarnemingen in de moderne celbiologie uitgevoerd op harde dekglaasjes, vaak bekleed met een dunne laag van ECM eiwitten of synthetische peptiden die de RGD-sequentie. Echter, zulke fundamentele cultuur substraten niet recapituleren de hele fysisch-chemische complexiteit van de ECM en dus niet voorzien van een nauwkeurig model voor het bestuderen van cellulaire processen mechanotransduction. Om dit probleem aan te pakken, stellen we een eenvoudig alternatief voor tweedimensionale hydrogels functio...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
UV/Ozone Photoreactor	Ultra-Violet Producten	Model PR-100
Wiegelplaat	IKAcWerke	Model KS 130 Basic
Vortexer	Scientific Industries	Model Vortex Genie2
Vakuum degassing kamer	Applied Vacuum Engineering	DP- 8-KIT
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793-1EA
Roestvrijstalen pincet met fijne punt	Sigma-Aldrich	Z225304-1EA
Kledingweefsel pincet	Sigma-Aldrich	F4392-1EA
Petrischalen in polystyreen	Sigma-Aldrich	P5731-500EA
Aluminiumfolie, dikte 0,5 mm	Sigma-Aldrich	266574-3.4G
Isopore membraanfilter (0,2 µm poriegrootte)	Millipore	GTTP Filtercode
Ronde glazen deksel (22 mm diameter)	Neuvitro	GG-22
Ronde glazen deksel (25 mm diameter)	Neuvitro	GG-25
Micropipet met variabel volume	Sigma-Aldrich	Z114820
Eiwitpikocentrifugebuizen	Sigma-Aldrich	Z666505-100EA
Meshandgrepen	Sigma-Aldrich	S2896-1EA
Mesbladen	Sigma-Aldrich	S2771-100EA
Celcultuurkolven (75 cm2)	Sigma-Aldrich	CLS430641
Ultrasoon badbak, massief (roestvrij staal)	Sigma-Aldrich	Z613983-1EA
Polydimethylsiloxaan	Dow Corning	Sylgard 184 siliconen elastomeer kit
Acrylamid (poeder)	Sigma-Aldrich	A3553
N,N’-Methyleenbis(acrylamid)	Sigma-Aldrich	146072
N-Hydroxyethylacrylamid	Sigma-Aldrich	697931
N,N,N’,N’-Tetramethylethyleendiamine	Sigma-Aldrich	T9281
Ammonium PerSulfaat (APS)	Sigma-Aldrich	A3678
3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylaat	Sigma-Aldrich	1805
Human Plasma Fibronectine	Millipore	FC010
Laminine van EHS	Sigma-Aldrich	L2020
Natriumhydroxyde	Sigma-Aldrich	221465-25G
Dubbel gedistilleerd water (ddH2O)
Endotheelcel groeimedium	Cells Applications	211K-500
Human Umbilical Vein Endotheel Cellen (HUVEC)	Invitrogen	C-003-5C
Accutase	PAA laboratoria	L11-007
HEPES bufferoplossing 1 M in H2O	Sigma-Aldrich	83264-500ML-F
Antibiotica-antimycotica	PAA laboratoria	P11-002
Fosfaat Buffer Saline oplossing	PAA laboratoria	H15-002
Alexa Fluor 488 Phaloidin	Molecular Probes	A12379
Anti-vinculine antilichaam geproduceerd in muis	Sigma-Aldrich	V9131
Geit anti-muis antilichaam-tetramethylrhodamine	Molecular Probes	T-2762
Anti-Fibronectine (konijn)	Sigma-Aldrich	F3648
Streptavidine	Sigma-Aldrich	41469
Anti-Laminine antilichaam (konijn)	Sigma-Aldrich	L9393
Anti-konijn IgG-FITC	Sigma-Aldrich	F7512
Trypsine-EDTA oplossing	Sigma-Aldrich	T3924-100ML
Absoluut ethanol	Sigma-Aldrich	459844-2.5L