Deze video toont een eenvoudige en betrouwbare strategie voor de bereiding van zuivere kweken van endotheelcellen van embryonale voorhersenen binnen 10-12 dagen en zal nuttig zijn voor onderzoek zich op vele aspecten van cerebrale angiogenese.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie en Cultuur van de endotheelcellen van de embryonale voorhersenen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Embryonale hersenen endotheelcellen kan dienen als een belangrijk instrument in de studie van angiogenese en neurovasculaire ontwikkeling en interacties. De twee vasculaire netwerken van de embryonale voorhersenen, pial en periventriculaire, zijn ruimtelijk onderscheidend en hebben een verschillende herkomst en groeipatronen. Endotheliale cellen van de pial en periventriculaire vasculaire netwerken hebben unieke genexpressie profielen en functies. Hier geven we een stap-voor-stap protocol voor isolatie, cultuur en verificatie van zuivere populaties van endotheelcellen uit de periventriculaire vasculaire netwerk (PVECs) van de embryonale voorhersenen (grote hersenen). In deze benadering wordt telencephalon zonder pial membraan verkregen uit embryonale dag 15 muizen gehakt, gedigereerd met collagenase / dispase en mechanisch gedispergeerd in een enkele celsuspensie. PVECs worden gezuiverd van celsuspensie met behulp van positieve selectie met anti-CD-31/PECAM-1 antilichaam geconjugeerd aan microbolletjes met behulp van een sterk magnetischscheidingsmethode. Gezuiverde cellen worden gekweekt op collageen 1 gecoate cultuur gerechten in endotheelcellen kweekmedium totdat ze samenvloeiing en verder gesubkweekt. PVECs verkregen met dit protocol tentoonstelling kasseien en spil gevormd fenotypes, zoals gevisualiseerd door fase-contrast licht microscopie en fluorescentie microscopie. Zuiverheid van PVEC culturen werd opgericht met endotheelcellen markers. In onze handen, deze methode betrouwbaar en consistent levert zuivere populaties van PVECs. Dit protocol zal profiteren studies gericht op het verkrijgen van mechanistische inzichten in voorhersenen angiogenese, het begrijpen PVEC interacties, en cross-gesprekken met neuronale celtypes en heeft enorm potentieel voor therapeutische angiogenese.
Inleiding
Angiogenese, neurogenese en neuronale migratie zijn kritieke gebeurtenissen in het centrale zenuwstelsel (CNS) ontwikkeling, herstel en regeneratie. Verschillende elegante studies hebben aangetoond dat endotheelcellen stimuleert neuronale proliferatie en vice versa door afgifte van oplosbare factoren en door direct contact. We vonden het merkwaardig dat in de meerderheid van deze studies 1-3, terwijl neuronale voorlopercellen / neurale stamcellen worden geïsoleerd uit de embryonale hersenen, worden ze gekweekt samen met endotheliale cellen van de volwassen hersenen, andere volwassen weefsel bronnen of endotheliale cellijnen. Dit kan gedeeltelijk te wijten ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereiding van reagentia en oplossingen
- Coating van 35 mm kweekschaal: collageen type 1 oplossing wordt geleverd als een waterige oplossing van 20 mM azijnzuur (-100 mg eiwit / flacon). Verdun een zodanige hoeveelheid van collageen oplossing om een werkende concentratie van 0,01% met behulp van steriele weefselkweek kwaliteit water. Coat gerechten met 1 ml collageenoplossing voor 3-4 uur bij kamertemperatuur (KT) of 37 ° C of overnacht bij 2-8 ° C. Verwijder overtollige oplossing uit de gecoate schaal en laat het een nacht drogen. Spoel de schotel met weefselkweek kwaliteit water of PBS voor het toevoegen van media. Gecoate gerechten kunnen worden opge....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De fenotypische karakterisatie van PVECs van dag 1-12 wordt getoond door fase-contrast lichtmicroscopie (figuur 2). De cellen die aan de schotel op dag 1 laten zien morfologie kenmerk van celdeling (Figuur 2A). Tussen de 5-8 dagen, PVECs overgang van kasseien op gevormde morfologie typisch voor endotheelcellen en meer verwant aan de in vivo toestand (figuren 2B en 2C) spindel. Per dag 12 de PVEC cultuur behaalt volledige samenvloeiing (.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
PVEC zijn meer fysiologisch relevante dan volwassen hersenen endotheelcellen en EC's uit ander weefsel bronnen voor onderzoek gericht op neurovasculaire interacties en ook therapeutisch potentieel. Voor PVEC voorbereiding, is het essentieel begin met dissectie snel werken om een goede levensvatbaarheid te bereiken, aangezien de dode cellen niet-specifiek kan binden aan CD31 microbolletjes. Bovendien, als eencellige suspensie niet bereikt voordat de magnetische etiket stap resulteert dit in problemen omdat celklont.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door een Nationale Alliantie voor onderzoek naar schizofrenie en depressie (NARSAD) Young Investigator Award en de National Institutes of Health verlenen R01NS073635 naar AV.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DNase I | Sigma | D-4527 | |
| Collagen, Type 1 solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| DPBS | Quality Biologicals | 114057-131 | |
| EDTA | Fisher Scientific | M4055 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| MS column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| CD31 microbeads | Miltenyi Biotech | 130-097-418 | |
| MACS separator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Bioscience | 352350 | |
| Antibiotic and antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| 35 mm Culture dish | BD Bioscience | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352097 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352098 | |
| ECCM kit | BD Bioscience | 355054 | Kit Includes Endotheelcel groeisupplement, EGF en Sojaboon trypsine-remmer |
| Endotheelcel groeisupplement (ECGS) | BD Bioscience | 354006 | |
| RBECGM | Cell Applications | R819-500 | |
| DMEM F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 305050-061 | |
| Weefselkweek kwaliteit water | Life Technologies | 15230162 | |
| 0,25% Trypsine | Life Technologies | 15050 | |
| Sojaboon trypsine-remmer | BD Bioscience | 5425 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Life Technologies | Q25021 | |
| CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0 | Life Technologies | C10608 | |
| Biotinyleerde Isolectin B4 antilichaam | Sigma | L2140 | |
| Anti-Von Willebrand factor | Sigma | F3520 | |
| Anti-CD31/PECAM-1 | BD Pharmingen | 550274 | |
| VECTASHIELD Hardset Montagemedium met DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Ketamine | Butler Schein Animal Health Supply | 44028 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 1009 | |
| Stereomicroscoop | Motic | SMZ-168 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Omgekeerde microscoop | Olympus CK-40 | CK-40 | |
| Fluorescente microscoop | Olympus FSX-100 | FSX-100 | |
| Fijne pincet | Roboz Surgical Instrument | 7 inox | |
| Fijne microtip schaar | Roboz Surgical Instrument | RS5611 |
Referenties
- Shen, Q., S, G., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
- Milner, R. A novel three-dimensional system to ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
