Isolatie en Cultuur van de endotheelcellen van de embryonale voorhersenen

Samenvatting

Deze video toont een eenvoudige en betrouwbare strategie voor de bereiding van zuivere kweken van endotheelcellen van embryonale voorhersenen binnen 10-12 dagen en zal nuttig zijn voor onderzoek zich op vele aspecten van cerebrale angiogenese.

Samenvatting

Embryonale hersenen endotheelcellen kan dienen als een belangrijk instrument in de studie van angiogenese en neurovasculaire ontwikkeling en interacties. De twee vasculaire netwerken van de embryonale voorhersenen, pial en periventriculaire, zijn ruimtelijk onderscheidend en hebben een verschillende herkomst en groeipatronen. Endotheliale cellen van de pial en periventriculaire vasculaire netwerken hebben unieke genexpressie profielen en functies. Hier geven we een stap-voor-stap protocol voor isolatie, cultuur en verificatie van zuivere populaties van endotheelcellen uit de periventriculaire vasculaire netwerk (PVECs) van de embryonale voorhersenen (grote hersenen). In deze benadering wordt telencephalon zonder pial membraan verkregen uit embryonale dag 15 muizen gehakt, gedigereerd met collagenase / dispase en mechanisch gedispergeerd in een enkele celsuspensie. PVECs worden gezuiverd van celsuspensie met behulp van positieve selectie met anti-CD-31/PECAM-1 antilichaam geconjugeerd aan microbolletjes met behulp van een sterk magnetischscheidingsmethode. Gezuiverde cellen worden gekweekt op collageen 1 gecoate cultuur gerechten in endotheelcellen kweekmedium totdat ze samenvloeiing en verder gesubkweekt. PVECs verkregen met dit protocol tentoonstelling kasseien en spil gevormd fenotypes, zoals gevisualiseerd door fase-contrast licht microscopie en fluorescentie microscopie. Zuiverheid van PVEC culturen werd opgericht met endotheelcellen markers. In onze handen, deze methode betrouwbaar en consistent levert zuivere populaties van PVECs. Dit protocol zal profiteren studies gericht op het verkrijgen van mechanistische inzichten in voorhersenen angiogenese, het begrijpen PVEC interacties, en cross-gesprekken met neuronale celtypes en heeft enorm potentieel voor therapeutische angiogenese.

Inleiding

Angiogenese, neurogenese en neuronale migratie zijn kritieke gebeurtenissen in het centrale zenuwstelsel (CNS) ontwikkeling, herstel en regeneratie. Verschillende elegante studies hebben aangetoond dat endotheelcellen stimuleert neuronale proliferatie en vice versa door afgifte van oplosbare factoren en door direct contact. We vonden het merkwaardig dat in de meerderheid van deze studies ^1-3, terwijl neuronale voorlopercellen / neurale stamcellen worden geïsoleerd uit de embryonale hersenen, worden ze gekweekt samen met endotheliale cellen van de volwassen hersenen, andere volwassen weefsel bronnen of endotheliale cellijnen. Dit kan gedeeltelijk te wijten zijn aan de technische moeilijkheden bij het isoleren en kweken van zuivere populaties van endotheelcellen van embryonale hersenen. Echter, angiogenese, neurogenese en neuronale migratie zijn gelijktijdige gebeurtenissen in ordes van grootte meer robuust in de embryonale hersenen dan in de normale volwassen hersenen. De periventriculaire vasculaire netwerk van de embryonic voorhersenen (grote hersenen) afkomstig uit een vat geplaatst in de basale ganglia primordium en ontwikkelt in de vorm van een ordelijke gradiënt van ventraal grote hersenen, rug van embryonale dag 11 (E11) ^4,5. Deze plexus van schepen van de periventriculaire vasculaire netwerk zijn te onderscheiden van pial schepen op basis van afkomst, anatomische locatie, groeipatronen en ontwikkelingsregulatie ^4,5. De richting van de voortplanting van de periventriculaire angiogenese verloop overeenkomt met de telencephalic dwarse neurogenetische verloop. Binnen de grote hersenen, de periventriculaire angiogenese gradiënt en het verloop van GABA neuronen migreren tangentiaal overlapt ruimtelijk en ^6. Met betrekking tot de timing, de angiogenese gradiënt is op voorhand van de neurogenetische gradiënt en GABA neuron gradiënt met ongeveer een dag. Zo periventriculaire endotheelcellen zijn in ruimte en tijd goed gepositioneerd om kritische aanwijzingen te verstrekken aan telencephalic neurogenese ondersteunen enneuronale migratie ^4,6. Daarom zou het gebruik van embryonale periventricular endotheelcellen in coculture experimenten met neuronale voorlopercellen en / of neuronen een gunstiger model voor het bestuderen neurovasculaire interacties en het ontwikkelen van nieuwe mogelijkheden voor de behandeling van neurodegeneratieve ziekte of ischemische / traumatisch hersenletsel te bieden.

We benadrukken het belang van het verwijderen van de pial membraan, niet alleen om epitheliale besmetting cel te beperken, maar ook om pial endotheelcellen die moleculair en functioneel verschillend van endotheelcellen van de periventriculaire vasculaire netwerk ^4,6 (genoemd PVECs te onderscheiden van pial EC's) zijn te scheiden . Hier beschrijven we de methode die we regelmatig gebruiken in ons laboratorium een ​​rijke en zuivere opbrengst van PVECs verkrijgen. Deze endotheelcellen zijn bereid uit embryonale voorhersenen geïsoleerd uit een getimede-zwangere muis. Zij kunnen worden uitgebreid gesubkweekt en neer bevroren succes voor toekomstig gebruik.

Protocol

1. Bereiding van reagentia en oplossingen

1. Coating van 35 mm kweekschaal: collageen type 1 oplossing wordt geleverd als een waterige oplossing van 20 mM azijnzuur (-100 mg eiwit / flacon). Verdun een zodanige hoeveelheid van collageen oplossing om een ​​werkende concentratie van 0,01% met behulp van steriele weefselkweek kwaliteit water. Coat gerechten met 1 ml collageenoplossing voor 3-4 uur bij kamertemperatuur (KT) of 37 ° C of overnacht bij 2-8 ° C. Verwijder overtollige oplossing uit de gecoate schaal en laat het een nacht drogen. Spoel de schotel met weefselkweek kwaliteit water of PBS voor het toevoegen van media. Gecoate gerechten kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende een maand.
2. Bereid compleet Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Vul het DMEM (500 ml) met 10% FBS en antibiotica-antimycotische oplossing (1x concentratie 1 ml/100 ml). Volledige DMEM kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende twee maanden.
3. Bereid een aliquot (50 ml) DMEM met DNase I (0,001 mg / ml) (hierna DMEM-DNase I).
4. Een volgende hoeveelheid (10 ml) DMEM met collagenase en dispase (1 mg / ml) (hierna DMEM-collagenase/dispase).
5. Bereid endotheelcellen kweekmedium (ECCM 500 ml), aangevuld met EGF (5 ug), ECGS (100 mg) en 5 ul van antibiotica-antimycotische oplossing. ECCM kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende twee maanden.
6. Voorverwarmen alle media voor gebruik.
7. Bereid Zuivering buffer: PBS, pH 7,2 met 0,5% BSA en 2 mM EDTA. Houd buffer koud (2-8 ° C).

2. Verwijdering van embryo's en Dissection van Telencephalon

Alle experimenten met proefdieren zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik commissies van McLean Hospital en voldoen aan de NIH richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.

1. Gebruik getimede zwangere CD1-muizen (embryonale dag 15). De dag van de vaginale plug ontdekking wordt beschouwd als embryonale dag 0 (E0). CD1 dammen produceren over het algemeen grote nesten, zo 10-12 embryos worden verwacht van een zwangere dam.
2. Voor hysterotomie verdoven zwangere muizen een intraperitoneale injectie van ketamine (100 mg / kg) / xylazine (5 mg / kg). Voor muizen ongeveer 20-30 g, levert 0,3 ml van een 10 ml / kg ketamine / xylazine anestheticum en waarborgen die pijn en ongemak is minimaal tijdens intraperitoneale injecties van verdoving. Gebruik de hand terughoudendheid voor de injecties.
3. Controleer diepe verdoving door teen knijpen. Verwijder embryo's uit diep verdoofde muizen. Onthoofden elk embryo onmiddellijk na verwijdering uit de moeder. Plaats de embryonale hoofden in steriele petrischaaltjes in ijskoud PBS.
4. Volg hysterectomie door directe euthanasie met verdoving overdosis (130 mg / kg pentobarbital, ip), een methode voor euthanasie, die in overeenstemming is met de AVMA Richtlijnen voor de euthanasie van dieren: 2013 Edition.
5. Onder een stereomicroscoop, verwijder de hersenen uit het hoofd met fijne microtip schaar en fijn pincet. Opmerking: Een hoge kwaliteit ontledenion is essentieel om succesvol te verwijderen de pial membraan van de embryonale hersenen. Dit wordt bereikt door de praktijk. Fijn pincet en microtip scharen zijn ook belangrijke instrumenten voor het verkrijgen van een goede dissectie.
6. Gebruik de tang om een ​​stevige grip op de hersenen en de microtip schaar naar afpellen de pial membraan. Verwijder het mesencephalon en metencephalon en isoleren het telencephalon. Transfer pial-vrij grote hersenen van alle embryo's naar een 35 mm cultuur schotel met 2 ml PBS in ijs.

3. Celisolatie

1. Hak het telencephalon in 1-2 mm fragmenten met een scalpel en verzamel weefsel in een 15 ml Falcon buis met 2 ml compleet DMEM.
2. Distantiëren weefsel grondig, maar voorzichtig met een pipet 1 ml tot klonten verdwijnen en een melkachtige suspensie wordt bereikt.
3. Centrifugeer gedissocieerde cellen bij 800-1000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
4. Verwijder voorzichtig het supernatant en resuspendeer pellet in DMEM-DNase I. voorzichtig distantiëren de cells opnieuw met 1 ml pipet en centrifugeer bij 800-1000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
5. Resuspendeer de pellet in warme compleet DMEM. Filter cellen door een steriele 70 um nylon gaas. Verzamel gefilterde cellen en in het ijs te houden.
6. Verzamel de cel-gedeelten van het gaas gehouden en verteren verder met DMEM-collagenase/dispase (2 ml) gedurende 1-2 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen 3x in DMEM-DNase I door centrifugatie bij 800-1000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Zwembad deze cellen met de gefilterde cellen in stap 3.5 verzameld. Was de totale cellen eenmaal met complete DMEM. Ga verder met het aantal cellen en magnetische etikettering stappen te bepalen. Opmerking: Het is belangrijk om een ​​enkele-celsuspensie voor magnetische kenmerken te verkrijgen.

4. Magnetische Labeling

1. Dit protocol geeft de magnetische kenmerken van 10 ⁷ cellen. Voor cel aantallen lager dan 10 ^7, gebruiken dezelfde reagens volume en voor mobiele nummers van meer dan 10 ^7, opschalen alle reagens volumes en het totale volumedienovereenkomstig (bijv. voor 2 x 10 ⁷ totaal cellen, gebruik twee keer het volume van alle aangegeven reagentia). Houd alle reagentia en cellen in ijs.
2. Bepaal het aantal cellen met een hemocytometer.
3. Centrifugeer celsuspensie bij 300 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Aspireren supernatans volledig.
4. Voeg 90 μl/10 ⁷ cellen zuivering buffer om de celpellet gevolgd door 10 ul CD31 microbolletjes. De Microbeads verstrekt door de fabrikant worden geconjugeerd anti-muis CD31 antilichaam monoklonale.
5. Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten in de koelkast. Opmerking: Hogere temperaturen en / of langere incubatietijd gedurende magnetische kenmerken kan leiden tot niet-specifieke binding.
6. Was de cellen door toevoeging van 1-2 ml/10 ⁷ cellen zuivering buffer en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 minuten. Verwijder de supernatant en resuspendeer cellen in 500 ui buffer zuivering. Ga verder met magnetische afscheiding of zuiveringsstap.

5. Puhet zuiveren

1. Plaats MS kolom in het magneetveld van MACS Separator.
2. Kolom spoelen met 500 ul van zuivering buffer.
3. Breng celsuspensie op de kolom. Plaats geschikt aantal cellen naar MS kolom als hoger aantal cellen in de kolom kunnen verstoppen. Let op: Elke kolom MS is geschikt voor een maximum aantal van 2 x 10 ⁷ cellen, voor een groter aantal cellen, gebruiken meer kolommen.
4. Verzamelen en gooi flow-through met ongelabelde cellen.
5. Waskolom met 500 ui buffer zuivering driemaal. Tijdens het wassen stappen, zorg ervoor dat de kolom reservoir leeg is voordat het toevoegen daaropvolgende zuivering buffer porties.
6. Verwijder kolom uit de MACS separator en plaats deze op een 15 ml Falcon buis.
7. Een plunjer wordt geleverd samen met de kolom MS. Pipetteer 1 ml van zuivering buffer op de kolom MS en onmiddellijk spoelen van de magnetisch gelabelde cellen door stevig indrukken van de zuiger in de kolom.
8. Plaat celIs op een 35 mm kweekschaal vooraf bekleed met collageen type 1 en groeien cellen ECCM in een incubator ingesteld op 37 ° C met 95% _O2 en 5% _CO2.
9. Verander het medium om de vier dagen. Gebruik PVECs voor experimenten of subcultuur na 10-12 dagen wanneer het gerecht is samenvloeiing.

6. Subcultuur van PV ECS

1. Verwijder de ECCM en spoel de monolaag van PVECS met 1-2 ml steriel PBS.
2. Voeg voorzichtig 1,5 ml 0,25% trypsine-EDTA-oplossing om de cel monolaag bedekken.
3. Breng het gerecht aan de incubator. Binnen 5-7 minuten, zullen cellen los van het oppervlak van de schotel.
4. Nadat de cellen losgemaakt, onmiddellijk een gelijk volume trypsine remmer toe en vermaal meerdere malen.
5. Breng de cellen naar een steriele 15 ml Falcon buis. Centrifugeer het buisje bij 500 xg gedurende 5 minuten.
6. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 ml voorverwarmd ECCM.
7. Zaad de cellen voor het uitbreiden van de cultuur, imveroudering of andere testen.

Resultaten

De fenotypische karakterisatie van PVECs van dag 1-12 wordt getoond door fase-contrast lichtmicroscopie (figuur 2). De cellen die aan de schotel op dag 1 laten zien morfologie kenmerk van celdeling (Figuur 2A). Tussen de 5-8 dagen, PVECs overgang van kasseien op gevormde morfologie typisch voor endotheelcellen en meer verwant aan de in vivo toestand (figuren 2B en 2C) spindel. Per dag 12 de PVEC cultuur behaalt volledige samenvloeiing (...

Discussie

PVEC zijn meer fysiologisch relevante dan volwassen hersenen endotheelcellen en EC's uit ander weefsel bronnen voor onderzoek gericht op neurovasculaire interacties en ook therapeutisch potentieel. Voor PVEC voorbereiding, is het essentieel begin met dissectie snel werken om een ​​goede levensvatbaarheid te bereiken, aangezien de dode cellen niet-specifiek kan binden aan CD31 microbolletjes. Bovendien, als eencellige suspensie niet bereikt voordat de magnetische etiket stap resulteert dit in problemen omdat celklont...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
DNase I	Sigma	D-4527
Collagen, Type 1 solution from rat tail	Sigma	C3867
DPBS	Quality Biologicals	114057-131
EDTA	Fisher Scientific	M4055
BSA	Sigma	A2058
MS column	Miltenyi Biotech	130-042-201
CD31 microbeads	Miltenyi Biotech	130-097-418
MACS separator	Miltenyi Biotech	130-042-102
MACS multi stand	Miltenyi Biotech	130-042-303
Cell strainer 70 µm	BD Bioscience	352350
Antibiotic and antimycotic solution	Sigma	A5955
FBS	Sigma	F4135
Collagenase/Dispase	Roche	10269638001
DMEM	Lonza	12-604F
35 mm Culture dish	BD Bioscience	353001
15 ml Falcon tube	BD Bioscience	352097
50 ml Falcon tube	BD Bioscience	352098
ECCM kit	BD Bioscience	355054	Kit Includes Endotheelcel groeisupplement, EGF en Sojaboon trypsine-remmer
Endotheelcel groeisupplement (ECGS)	BD Bioscience	354006
RBECGM	Cell Applications	R819-500
DMEM F12	Life Technologies	10565-018
GlutaMAX	Life Technologies	305050-061
Weefselkweek kwaliteit water	Life Technologies	15230162
0,25% Trypsine	Life Technologies	15050
Sojaboon trypsine-remmer	BD Bioscience	5425
Matrigel	BD Bioscience	354234
Qtracker 655 Cell Labeling Kit	Life Technologies	Q25021
CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0	Life Technologies	C10608
Biotinyleerde Isolectin B4 antilichaam	Sigma	L2140
Anti-Von Willebrand factor	Sigma	F3520
Anti-CD31/PECAM-1	BD Pharmingen	550274
VECTASHIELD Hardset Montagemedium met DAPI	Vector Laboratories	H-1500
Ketamine	Butler Schein Animal Health Supply	44028
Xylazine	Lloyd Laboratories	1009
Stereomicroscoop	Motic	SMZ-168
Hemocytometer	Fisher Scientific	267110
Omgekeerde microscoop	Olympus CK-40	CK-40
Fluorescente microscoop	Olympus FSX-100	FSX-100
Fijne pincet	Roboz Surgical Instrument	7 inox
Fijne microtip schaar	Roboz Surgical Instrument	RS5611