We beschrijven hier een eenvoudige fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) werkwijze voor de lokalisatie van virussen en bacteriën in insecten en plantenweefsels. Dit protocol kan worden verlengd voor de visualisatie van mRNA in ganse berg en preparaten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) is een naam gegeven aan verschillende technieken gebruikt voor het visualiseren gen transcripten in eukaryotische cellen en kunnen verder worden gemodificeerd om andere componenten in de cel, zoals infectie met virussen en bacteriën te visualiseren. Ruimtelijke lokalisatie en visualisatie van virussen en bacteriën tijdens het infectieproces is een essentiële stap die expressie profiling experimenten zoals microarrays en RNAseq complementair reactie op verschillende stimuli. Inzicht in de tijdruimtelijke infecties met deze middelen een aanvulling op biologische experimenten gericht op het begrijpen van hun interactie met cellulaire componenten. Verscheidene technieken voor het visualiseren virussen en bacteriën zoals reportergen systemen of immunohistochemische werkwijzen zijn tijdrovend en sommige zijn beperkt tot met modelorganismen en vaak complexe methoden. FISH dat RNA of DNA soorten richt in de cel is een relatief eenvoudige en snelle method voor het bestuderen spatiotemporele lokalisatie van genen en voor diagnostische doeleinden. Deze werkwijze is robuust en relatief eenvoudig te implementeren wanneer de protocollen gebruiken korte hybridiseren, commercieel aangekocht probes, die niet duur zijn. Dit is bijzonder robuust wanneer monstervoorbereiding, fixatie, hybridisatie, en microscopische visualisatie niet complexe stappen omvatten. Hier beschrijven we een protocol voor de lokalisatie van bacteriën en virussen in insecten en plantaardige weefsels. De methode is gebaseerd op eenvoudige bewerkingen, fixatie, en hybridisatie van insecten hele mounts en ontleed organen of handgemaakte installatiedelen, met 20 basenparen korte DNA-probes geconjugeerd met fluorescente kleurstoffen op hun 5 'of 3' eindigt. Dit protocol is met succes toegepast op een aantal insecten en plantenweefsels, en kan worden gebruikt om expressie van mRNA of andere RNA of DNA soorten in de cel te analyseren.
Inleiding
Bij onderzoek naar de interactie tussen plant virussen en andere pathogenen met hun aangetaste plant gastheren, is het belangrijk om de pathogenen en hun nucleïnezuren in situ te visualiseren, ongeacht of deze tot negatieve effecten op de gastheer. Dit is zeer belangrijk bij het bestuderen pathogeen verkeer in en tussen plantencellen. In situ lokalisatie van genproducten van het pathogeen is een essentiële stap die andere benaderingen voor het bestuderen van de pathogeniciteit proces aanvult. Veel plantenpathogenen, vooral virussen worden overgebracht door insecten, met complexe en intieme interacties met hun vectoren. Lokalisatie van deze virussen in hun vectoren is belangrijk voor het bestuderen van het pad voor transmissie, en de mogelijke interactieplaatsen in de vector. De overdracht van sommige insecten gevectoriseerd plantenvirussen wordt geholpen door endosymbiotic bacteriën die binnen deze insecten wonen. Om beter te bestuderen van de overdracht van deze plantenvirussen by hun vectoren, is het ook essentieel om de endosymbiotic bacteriën te visualiseren in het algemeen, en die betrokken bij virusoverdracht, in het bijzonder. Colocalization van het virus en endosymbiotic bacteriën dus gewenst voor dat mogelijke relaties tussen deze organismen in hun insectengastheer. Afgezien van virusoverdracht, endosymbiotic bacteriën beïnvloeden de verschillende aspecten van de biologie van insecten, waardoor ruimtelijke lokalisatie van deze bacteriën in insecten is van groot belang en het belang.
Yellow leaf curl virus tomaat (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae) is de belangrijkste virale ziekte complex van gecultiveerde tomaat wereldwijd 1-4. TYLCV is een-floëem beperkte virus en wordt uitsluitend gevectoriseerd door de witte vlieg Bemisia tabaci 5,6. Een model dat de translocatie van begomoviruses in hun witte vlieg vectoren is voorgesteld 6-9. Twee specifieke barrières actief gekruist during dit circulative transmissie: de middendarm / hemolymfe en hemolymph / speekselklier barrières. Deze transmissie proces wordt verondersteld te worden gemedieerd door onbekende receptoren die de viruscapside herkennen. TYLCV wordt gedacht aan B. te steken tabaci midgut 6,10, en wordt geabsorbeerd door de primaire speekselklier 6 voordat het wordt geïnjecteerd in de plant. In de wittevlieg hemolymph, TYLCV interageert met een GroEL eiwit geproduceerd door het insect secundaire endosymbiotic bacterie Hamiltonella. Deze interactie zorgt voor veilig transport van TYLCV in de hemolymfe, en beschermt tegen aanvallen van het insect immuunsysteem 11. Hamiltonella en Portiera, de primaire endosymbiont wittevlieg, zijn ondergebracht in bacteriocytes, insectencellen gevonden in de hemolymfe en huis endosymbiotic bacteriën. B. 11 tabaci havens extra endosymbiotic bacteriën zoals Rickettsia, Arsenophonus, Wolbachia, en Fritschea, die kunnen worden gelokaliseerd binnen of buiten de bacteriocytes en hebben verschillende effecten op het insect biologie 12.
Verschillende rapporten hebben geprobeerd de lokalisatie van TYLCV in planten en witte vliegen studie door tijdrovende en dure protocollen zoals Transmissie Elektronen Microscopie (TEM), antilichamen en RNA in situ op microscopische dikke gedeelte 10,13, een recente studie beschreef de lokalisatie van plantenvirussen in hun installaties en vector hosts met behulp van een eenvoudig protocol 14. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor de lokalisatie van TYLCV in B. tabaci ontleed midguts en speekselklieren, en in secties bereid uit TYLCV-geïnfecteerde planten. We de lokalisatie van Portiera de primaire endosymbiont B. beschrijven verder tabaci, en de secundaire endosymbionten Hamitonella, Rickettsia en Arsenophonus. Dit protocol is gebaseerd op het gebruik van korte DNA-sondes, datfluorescent gelabeld aan hun 5 'uiteinde, en specifiek hybridiseren aan complementaire sequenties in virale of bacteriële gensequenties. Het monster verwerking is relatief eenvoudig en het verkregen signaal is zeer specifiek. De beschreven protocol kan worden gebruikt om virussen, bacteriën en andere pathogenen lokaliseren in hun planten, dieren en insecten gastheren, en kan verder worden gebruikt om mRNA te lokaliseren in een bepaald weefsel.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Algemeen witte vlieg, Plant en Virus Voorbereidingen voor FISH analyse
- B en Q achterste biotype wittevlieg op katoen zaailingen (Gossypium hirsutum L. cv. Acala) en binnenkant insectendichte kooien en kweekkamer onder standaard condities van 25 ± 2 ° C, 60% relatieve vochtigheid te behouden en een 14-uur licht / 10-uur donker fotoperiode.
- Voer PCR om infectie te testen met behulp van endosymbionts endosymbiont-specifieke primers zoals eerder beschreven 15-19.
- Kopen zaailingen van de tomaat (Solanum esculentum cv. Biefstuk) vanuit een commercieel kinderdagverblijf of planten tomatenzaad.
- Behouden onder dezelfde kweekomstandigheden hierboven beschreven totdat de planten bereikt de vier true-bladstadium, leeftijd meest geschikte voor-wittevlieg gemedieerde enting van TYLCV 15 (zie punt 4.1 hieronder).
2. Insect lossen, Fixatie, Probe Design, hybridisatie, en visualisatie voor Endosymbiont FISH
- Verzamel 10 volwassen wittevlieg door aspiratie van katoenplanten, of kies 10 3 e of 4 e instar nimfen van katoen bladeren.
- Onmiddellijk onder in Carnoy's fixeermiddel (chloroform-ethanol-ijsazijn, 06:03:01, vol / vol) in Eppendorf buisjes. Fix voor 2 uur 's nachts (bij voorkeur' s nachts).
- Volledig verwijderen van de fixerende en ontkleuren in 6% H 2 O 2 in ethanol gedurende 2 uur.
- Bewaar de monsters in absolute ethanol gedurende enkele dagen tot enkele weken bij kamertemperatuur of doorgaan naar de volgende stap.
- Ontwerp probes complementair omgekeerde DNA primers gebaseerd op het 16S ribosomale RNA-genen van elke bacterie. Voor het ontwerpen van de probes rekening de houden dezelfde overwegingen voor het ontwerpen van PCR-primers. Gebruik de oligonucleotideprobes BTP1 5'-Cy5-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3 ', 5'-Cy3 Rb1-TCCACGTCGCCGTCTTGC-3', 5'-Cy3 BTH-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3 'en 5'-Cy3 Ars2-TCATGACCACAACCTCCAAA-3 'voor specifieke targeting van Portiera, Rickettsia, Hamilonella en Arsenophonus, respectievelijk.
- Hybridiseren monsters nacht in het donker in hybridisatiebuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,9 M NaCl, 0,01% [gewicht / volume] natriumdodecylsulfaat, 30% [vol / vol] formamide) bevattende 10 pmol fluorescente probe per ml . Combineer meer dan een probe met verschillende fluorescente kleurstoffen indien nodig. Gebruik niet-geïnfecteerd wittevlieg met de beoogde bacterie en no-sonde monsters als negatieve controles.
- Monteer de monsters geheel, op een microscoop glijbaan, in hybridisatie buffer bevatte met een vloeistof blocker, dek af met een dekglas, afdichting met nagellak, en weergave onder een fluorescentie of confocale microscoop.
3. Wittevlieg Organ Dissection, Fixatie, hybridisatie, en visualisatie voor TYLCV FISH
- Verzamel volwassen wittevlieg ononderbroken gehouden zijn op TYLCV-geïnfecteerde tomatenplanten door aspiratie en anesthetize door blootstelling aan tissue geïmpregneerd met aceton. Expose wittevlieg alleen voor 1-2 min als te lange blootstelling aan aceton wittevlieg weefsels kan repareren. Gebruik nonviruliferous wittevlieg gehouden zijn op niet-geïnfecteerde tomatenplanten en geen sonde steekproeven voor controles om specifieke hybridisatie te bevestigen.
- Mount wittevlieg op depressie objectglaasjes voor orgel dissectie met een stereo-microscoop.
- Trek de insect hoofd van de prothorax en ontleden speekselklieren in 1x PBS aangevuld met 1% toluidineblauw vlek voor een betere visualisatie, vanwege hun kleine omvang. Laat absorptie van de vlek voor 2-3 minuten.
- Trek het insect uit elkaar op de kruising tussen de borstkas en de buik om te observeren en te verdrijven uit de middendarm. Verdrijf de inhoud van de buik door duwen met een tang op de buik tip.
- Verwijder voorzichtig de PBS-en toluïdineblauw uit succesvolle dissecties en voorzichtig toe te voegen 300 ul van Carnoy's fixatief om de organen te repareren gedurende 5 minuten.
- Eendd fixeermiddel ve zijde van de depressieve goed en niet van boven tot ongecontroleerde beweging van de ontlede organen voorkomen. Eenmaal op het fixeermiddel, de organen hechten aan het glas en gedurende het proces dat ze niet bewegen.
- Verwijder fixatief en voeg 500 ul hybridisatiebuffer gesupplementeerd met 10 pmol van de fluorescente DNA probe Cy5-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 ', die complementair is aan een sequentie in TYLCV manteleiwitgen.
- Hybridiseren overnacht bij kamertemperatuur in het donker door het incuberen van de dia met het monster in een kleine vochtige kamer bestaat uit kleine plastic doos met natte handdoek papier op de bodem.
- Na de hybridisatie, halen de organen met een fijne dissectie gereedschap en snel te verplaatsen naar een nieuwe microscoop dia met 30 pi van nieuwe hybridisatie buffer aangevuld met DAPI (0,1 mg / ml in 1x PBS) en bevatte met vloeibare blocker.
- Bedek de exemplaren met een dekglas, verzegelen with nagellak en bekijken onder een fluorescentie of confocale microscoop.
4. Plant Handling, Hand-snijden, Fixatie, en hybridisatie voor TYLCV FISH
- Inoculeren tomatenzaailingen met TYLCV behulp viruliferous-wittevlieg gemedieerde inenting. Het virus kan worden gedetecteerd met de FISH werkwijze symptomless planten een week na inoculatie. Typische symptomen van de ziekte zichtbaar zijn drie weken na de inenting. Gebruik niet-geïnfecteerde tomatenplanten en geen sonde steekproeven voor controles om specifieke hybridisatie te bevestigen.
- Gebruik een scherp histologische scheermesje voor het bereiden van met de hand gesneden 2-4 cm lang langs-of dwarsdoorsneden van tomaat stengels en bladeren.
- In Eppendorf buizen, bevestig de secties in Carnoy's fixeermiddel voor 2 uur tot overnacht bij kamertemperatuur.
- Verwijder fixatief en bewaren van de secties in absolute ethanol gedurende enkele dagen tot enkele weken bij kamertemperatuur of doorgaan naar de volgende stap.
- Was de sectiesdrie keer, 1 min. elk in hybridisatiebuffer.
- Hybridiseren de secties met 500 ui hybridisatiebuffer gesupplementeerd met 10 pmol van de fluorescente probe oligonucleotide 5'-Cy3-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 'die complementair is aan een sequentie in TYLCV manteleiwitgen.
- Was de secties driemaal, 1 min. elk in hybridisatiebuffer.
- Mount secties geheel in hybridisatie buffer aangevuld met DAPI (0,1 mg / ml in 1x PBS) en bevatte met vloeibare blocker, dek af met een dekglaasje, afdichting met nagellak en bekijken onder een fluorescentie of confocale microscoop.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De bestudeerd in dit manuscript systeem wordt getoond in figuur 1 en omvat een geïnfecteerde plant met TYLCV, een volwassene en een nimf van de witte vlieg B. tabaci, en de interne anatomie van de witte vlieg die het pad voor TYLCV translocatie in het insect. Figuur 2 toont dubbele FISH in een volwassen wittevlieg voor de primaire symbiont Portiera en de secundaire symbiont Arsenophonus. Figuur 3 toont dubbele FISH voor Portiera en
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De hier beschreven voor de lokalisatie van een plantenvirus in de waardplant en insecten vector en endosymbiotic bacteriën in hun specifieke witte vlieg gastheer protocol kan worden aangepast voor de lokalisatie van andere virussen in planten en zelfs in dierlijke weefsels. Bovendien kan het protocol worden gebruikt endosymbiotic en pathogene bacteriën en andere micro-organismen in plantaardige en dierlijke systemen lokaliseren. De beschreven werkwijzen steunen op eenvoudige concept van hybridisatie tussen een korte, fl...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Onderzoek in de Ghanim lab werd ondersteund door onderzoek te verlenen geen. 908-42.12/2006 van de Duits-Israëlische Foundation (GIF), verlenen geen. IS-4062-07 uit de Verenigde Staten en Israël Binationale Fonds voor Landbouwkundig Onderzoek en Ontwikkeling (BARD), en onderzoek te verlenen geen. 884/07 van Israel Science Foundation (ISF) naar MG
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Fluorescently labeled Probes | Metabion | 20 bp HPLC purified | Sequence designed by customer |
| Toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | Molecular Biology Grade |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
| Liquid Blocker | Ted Pella Inc. | 22309 |
Referenties
- Czosnek, H., Laterrot, H. A worldwide survey of Tomato yellow leaf curl viruses. Arch. Virol. 142, 1391-1406 (1997).
- Ling, K. S., Simmons, A. M., Hassell, R. L., Keinath, A. P., Polston, J. E. First report of Tomato Yellow Leaf Curl Virus in South Carolina. Plant Dis. 90, 379 (2006).
- Polston, J. E., McGovern, R. J., Brown, L. G. Introduction of Tomato yellow leaf curl virus in Florida and implications for the spread of this and other geminiviruses of tomato. Plant Dis. 83, 984-988 (1999).
- Polston, J. E., Rosebrock, T. R., Sherwood, T., Creswell, T., Shoemaker, P. J. Appearance of Tomato yellow leaf curl virus in North Carolina. Plant Dis. 86, 73 (2002).
- Frohlich, D. R., Torres-Jerez, I., Bedford, I. D., Markham, P. G., Brown, J. K. A phylogeographical analysis of the Bemisia tabaci species complex based on mitochondrial DNA markers. Mol. Ecol. 8, 1683-1691 (2002).
- Ghanim, M., Morin, S., Czosnek, H. Rate of Tomato yellow leaf curl virus translocation in the circulative transmission pathway of its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Phytopathology. 91, 188-196 (2001).
- Ghanim, M., Rosell, R. C., Campbell, L. R., Czosnek, H., Brown, J. K., Ullman, D. E. Digestive salivary and reproductive organs of Bemisia tabaci (Gennadius) Hemiptera: Aleyrodidae) B type. J. Morphol. 248, 22-40 (2001).
- Hunter, W. B., Hiebert, E., Webb, S. E., Tsai, J. K., Polston, J. E. Location of geminiviruses in the whitefly Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae). Plant Dis. 82, 1147-1151 (1998).
- Rosell, R. C., Torres-Jerez, I., Brown, J. K. Temporal pathway of geminivirus in whitefly extracts, saliva, hemolymph and honeydew. Phytopathology. 89, 239-246 (1999).
- Czosnek, H., Ghanim, M., Ghanim, M. The circulative pathway of begomoviruses in the whitefly vector Bemisia tabaci—insights from studies with Tomato yellow leaf curl virus. Ann. Appl. Biol. 140, 215-231 (2002).
- Gottlieb, Y., et al. The transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virusby the whitefly Bemisiatabaciis correlated with the presence of aspecificsymbiotic bacterium species. J. Virol. 84, 9310-9317 (2010).
- Brumin, M., Levy, M., Ghanim, M. Transovarial transmission of Rickettsia spp. and organ-specific infection of the whitefly Bemisia tabaci. Appl. Environ. Microbiol. 78, 5565-5574 (2012).
- Ghanim, M., Medina, V. Localization of Tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector Bemisia tabaci. In Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease, Management, Molecular Biology, Breeding for Resistance. Czosnek, H. , Springer. New York. 175-187 (2007).
- Ghanim, M., Brumin, M., Popovski, S. A simple, rapid and inexpensive method for localization of Tomato yellow leaf curl virus and Potato leafroll virus in plant and insect vectors. J. Virol. Methods. 159, 311-314 (2009).
- Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. J. Virol. 86, 13241-13252 (2012).
- Nirgianaki, A., et al. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47, 93-101 (2003).
- Baumann, P. Biology of bacteriocyte-associated endosymbionts of plant sap-sucking insects. Ann. Rev. Microbiol. 59, 155-189 (2005).
- Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (Homoptera) Aleyrodidae). App. Environ. Microbiol. 72, 3646-3652 (2006).
- Li, Z. X., Lin, H. Z., Guo, X. P. Prevalence of Wolbachia infection in Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 54, 467-471 (2007).
- Skaljac, M., Zanic, K., Hrncic, S., Radonjic, S., Perovic, T., Ghanim, M. Diversity and localization of bacterial symbionts in three whitefly species (Hemiptera: Aleyrodidae) from the east coast of the Adriatic. Bull. Entomol. Res. 103, 48-59 (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
