VIGS-Mediated Forward Genetics Screening voor de identificatie van genen betrokken bij Nonhost Resistance

Samenvatting

Virus-geïnduceerde gene silencing is een nuttig hulpmiddel voor het identificeren van genen betrokken bij nonhost resistentie van planten. We demonstreren het gebruik van bacteriële pathogenen tot expressie GFPuv het identificeren gen zwijgen planten vatbaar voor nonhost pathogenen. Deze benadering is eenvoudig, snel en faciliteert grootschalige screening en soortgelijk protocol kan worden toegepast op het bestuderen van verschillende andere planten-microbe interacties.

Samenvatting

Nonhost ziekte resistentie van planten tegen bacteriële ziekteverwekkers wordt bestuurd door complexe verdedigingsmechanismen. Inzicht in dit mechanisme is van belang voor het ontwikkelen van duurzame ziekte-resistente planten tegen brede waaier van ziekteverwekkers. Virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) gebaseerde forward genetics screening is een nuttige aanpak voor de identificatie van het verdedigingsmechanisme van planten genen meegeven nonhost weerstand. Tobacco rattle virus (TRV) gebaseerde VIGS vector is de meest efficiënte VIGS vector to-date en is efficiënt gebruikt om endogene doelwitgenen zwijgen in Nicotiana benthamiana.

In dit manuscript, demonstreren we een forward genetics screening aanpak voor het tot zwijgen brengen van de individuele klonen uit een cDNA-bibliotheek in N. benthamiana en de beoordeling van de respons van gen tot zwijgen planten voor gecompromitteerde nonhost verzet tegen nonhost pathogenen, Pseudomonas syringae pv. tomaat T1, P. syringae pv. glycINEA, en X. campestris pv. vesicatoria. Deze bacteriële pathogenen zijn ontworpen om express GFPuv eiwitten en hun groene fluorescerende kolonies zichtbaar met het blote oog onder UV-licht in de nonhost pathogeen geënte planten als draaid doelgen is betrokken in het meegeven nonhost weerstand. Dit vergemakkelijkt betrouwbare en snellere identificatie van gen tot zwijgen planten vatbaar voor nonhost pathogenen. Verder kan veelbelovende kandidaat-gen gegevens worden gekend door sequencing de plant geninsert in TRV vector. Hier laten we de high throughput capaciteit van VIGS gemedieerde forward genetics genen betrokken bij nonhost weerstand identificeren. Ongeveer, kan 100 cDNA individueel tot zwijgen worden gebracht in ongeveer twee tot drie weken en hun relevantie in nonhost weerstand tegen verscheidene nonhost bacteriële pathogenen kan worden bestudeerd in een week daarna. In dit manuscript, sommen we de gedetailleerde stappen die betrokken zijn bij deze screening. VIGS-gemedieerde forward genetics screening aanpak kan worden uitgebreid niet alleen om de identificatie van genen die betrokken zijn bij nonhost verzet, maar ook aan het bestuderen van genen meegeven van verschillende biotische en abiotische stress tolerantie in verschillende plantensoorten.

Inleiding

Nonhost weerstand is de weerstand van alle plantensoorten tegen rassen van een bepaalde ziekteverwekker ^1,2. Dit zorgt voor breed spectrum en duurzame ziekte resistentie in planten ^2,3. Echter, het mechanisme, met name tegen bacteriële pathogenen, niet goed begrepen ^4. Screening voor mutanten of zwijgen planten die compromis nonhost weerstand, en hoge doorvoer transcriptprofilering voor de identificatie van differentieel tot expressie genen tijdens nonhost weerstand ^5-9 zijn twee belangrijke benaderingen eerder gebruikt voor het ontleden van bacteriële nonhost weerstand. Omdat nonhost weerstand wordt geregeld door een complex mechanisme (s) ⁴ met betrokkenheid van vele genen, een high throughput functionele genomics benadering voor genidentificatie is cruciaal voor een beter begrip van de nonhost weerstandsmechanisme (s).

Virus-geïnduceerde genuitschakeling (VIGS) is met succes gebruikt om endogene planten zwijgengenen in veel plantensoorten ^10,11. Nicotiana benthamiana is een van de meest geschikte planten voor VIGS ^10,12 en zijn ontwerp-genoom sequentie is nu verkrijgbaar ^13. Tobacco rattle virus (TRV) gebaseerde VIGS is op grote schaal gebruikt als reverse genetics hulpmiddel om genen die betrokken zijn bij nonhost weerstand ^2,4,14 karakteriseren. Dit VIGS vectoren en derivaten zijn nu beschikbaar via Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC, http://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/individ_cloned_gene_1.html ). VIGS is ook gebruikt als een forward genetics hulpmiddel voor het identificeren van genen betrokken bij planten immuniteit ^15-17, vooral nonhost weerstand ^6,18. Beoordelen van overgevoeligheidsreactie (HR)-gemedieerde celdood geïnduceerd door planten tegen een specifiek nonhost ziekteverwekker en de beoordeling van de ziekte geïnduceerde celdood zijn twee belangrijke tests voornamelijk gebruikt voor identifying gevoelige gen zwijgen planten. Echter, wordt HR celdood geïnduceerd alleen tegen type-II nonhost pathogenen en niet tegen het type-I nonhost ziekteverwekkers ^2. Vandaar, HR testen kunnen niet worden universeel gebruikt voor nonhost weerstand strategieën gebruikt door planten te identificeren, met name tegen de brede waaier van het type-I nonhost ziekteverwekkers. Ook, gedeeltelijk verlies van nonhost resistentie in een gen zwijgen installatie niet altijd tot ziekteverschijnselen ⁶ en derhalve ziekte puntentelling niet worden gebruikt voor het identificeren van planten compromitteren nonhost weerstand. In tegenstelling, de beoordeling van de groei van pathogenen in de nonhost gen zwijgen planten is een betere methode voor het bestuderen van het verlies van nonhost resistentie gen in planten zwijgen.

Vergeleken met conventionele groei assay ^6,19, een snellere methode om nonhost bacteriegroei het gen zwijgen planten kan de tijd die forward genetics screening verkorten. We eerder gemeld een werkwijze voor het observeren van bacteriënl pathogeen groei op bladeren met het blote oog onder ultraviolet (UV) licht met behulp van bacteriën uiten van groen fluorescerend eiwit (GFP) ^19. In dit manuscript demonstreren we de bruikbaarheid van GFPuv expressie nonhost bacteriële pathogenen voor gemakkelijke identificatie van gen tot zwijgen planten die worden gecompromitteerd nonhost resistentie. Deze methode is nauwkeurig voor de identificatie van gevoelige planten en vatbaar voor high throughput screening.

Protocol

1. Plant Groei en Target gen silencing

1. Plantengroei voorwaarden:
   1. Sow N. benthamiana zaden op bodem-minder potgrond, Metro-Mix 350 en ontkiemen de zaden in een kweekkamer. Elk ander bodem of aardeloos medium kan ook worden gebruikt in plaats van Metro-Mix.
   2. Transplant drie weken oude zaailingen in individuele potten en ze groeien in een broeikas bij 21 ± 2 ° C, samen met andere groeiomstandigheden zoals beschreven in eerdere literatuur ^12. Twee tot drie dagen na het uitplanten, kunnen planten worden gebruikt TRV inoculatie.
2. Groeiende TRV2 klonen:
   TRV is een tweedelig virus en zijn genoom bestaat uit RNA1 en RNA2. RNA1 codeert voor een RNA-afhankelijke RNA polymerase en een beweging eiwit ^20,21. RNA2 codeert voor een manteleiwit (CP) en twee niet-structurele proteïnen van het subgenome RNA's ^21. Zowel RNA1 en RNA2 zijn nodig voor de vorming van gerijpte virons deeltjes en hun verspreiding ^20,21. cDNA bibliotheek bouw in TRV2 vector is beschreven in eerdere literatuur ^22,23. Kort VIGS bibliotheek in deze studie werd geconstrueerd van het RNA geëxtraheerd uit bladweefsel blootgesteld aan verschillende biotische en abiotische elicitors.
   1. Neem Agrobacterium (stam GV2260) met de cDNA klonen in TRV2 vector (een 96-well plaat) van de vriezer. Ze geleidelijk ontdooien en na het kweken op kamertemperatuur komen, beënten afzonderlijke Agrobacterium kweek op Luria-Bertani (LB) agar plaat met rifampicine (10 ug / ml) en kanamycine (50 ug / ml) met een 96-pin replicator.
   2. Incubeer de platen bij 28 ° C gedurende twee dagen. We groeien meestal vier repliceren kolonies voor elke kloon, zodat adequaat Agrobacterium inoculum is beschikbaar voor prikken enting van twee fabrieken. Voer alle stappen onder steriele omstandigheden.
3. VIGS:
   1. GroeienAgrobacterium (GV2260) uitvoeren TRV1 bij 28 ° C in LB vloeibaar medium met bovengenoemde antibiotica. Oogst cellen door centrifugatie uit nacht gekweekt kweken, resuspendeer de inoculatie buffer (10 mM MES, pH 5,5, 200 pM acetosyringoon) en incubeer gedurende 3 uur bij kamertemperatuur op een schudinrichting bij 50 rpm.
   2. Oogst de cellen door centrifugeren en resuspendeer in 5 mM MES buffer (pH 5,5) en enten (OD ₆₀₀ = 0,3) in abaxiale kant van 3-4 N. benthamiana laat met behulp van een naaldloze injectiespuit. Gedetailleerde inoculatie procedure in voorafgaand literatuur ^24. Later, op de plaats van inoculatie TRV1 Inoculeer respectieve TRV2 kolonies door een prik de bladeren met een tandenstoker.
   3. Onderhouden van de planten met adequate voeding als krachtige groei is belangrijk voor een efficiënte VIGS ^12. Ongeveer twee weken na inoculatie van de transcripties van gerichte genen zal beginnen te verlagen en de planten zijn klaar voor pathogeen Inoculatie drie weken na de TRV inenting.

2. Voorbereiding van Nonhost Pathogen Culturen en Plant Enten

1. Details van pathogenen die in deze studie:
   Pseudomonas syringae pv. Tabaci, P. syringae pv. tomaat T1, P. syringae pv. glycinea en Xanthomonas campestris pv. vesicatoria worden in deze studie. Groeien P. syringae stammen in King's B (KB) vloeibaar medium aangevuld met rifampicine (10 ug / ml), kanamycine (50 ug / ml) bij 28 ° C gedurende 12 uur. Groeien X. campestris pv vesicatoria in vloeibaar LB-medium gedurende 16 uur.. Alle ziekteverwekkers haven een plasmide die GFPuv kunnen uitdrukken, zoals beschreven in de voorgaande literatuur ^19.
2. Voorbereiding van de pathogeen culturen voor planten inenting:
   1. Oogsten bacteriële cellen door centrifugeren en bevestigen de aanwezigheid van groene fluorescentie met behulp van lange wavelength UV-lamp in het donker. Twee keer was de cellen met steriel water en resuspendeer ze naar de gewenste concentratie met steriel water.
   2. Inoculeer de betreffende ziekteverwekker (s) op abaxiale zijde van doelgen zwijgen bladeren ^(5e tot ^8e) als puntjes (1,5 cm diameter). Verschillende nonhost pathogenen gelijktijdig getest voor hun groei in het doelgen zwijgen planten. Tegelijkertijd beënten gastheer pathogeen omdat dit kan worden gebruikt als een positieve controle voor weergave in planta bacteriegroei. Ook enten controle van vectoren (TRV :: 00) planten.

3. Observatie van in planta groei van bacteriële pathogenen

1. Expose de geïnoculeerde bladeren om een ​​lange golflengte UV-licht in het donker. Bacteriële kolonies worden als groen fluorescerend stippen in de abaxiale kant van het blad op de achtergrond, rode fluorescentie uitgezonden door bladoppervlak.
2. Observeren pathogeen groei2 dagen na inoculatie (dpi) tot 5 dpi. Alledaagse observatie gedurende deze periode nodig is.
3. Na het eerste scherm, korte lijst van de klonen waarvan silencing resulteert in de groei van een of meer nonhost ziekteverwekker (s).
4. Herhaal VIGS voor de geselecteerde klonen en opnieuw de respons van gen tot zwijgen planten om nonhost ziekteverwekker (s) te testen. Dit tweede niveau van screening wordt gedaan om de valse positieven behaald in het eerste scherm te verwijderen.

4. Bevestiging van Genomineerde Installaties voor Compromised Nonhost Resistance

1. Geluid van de cDNA-klonen geselecteerd uit het beeld zoals hierboven beschreven. Inoculeer de hele plant met nonhost pathogeen (s) door onderdompeling van de planten met desbetreffende pathogeen kweken met 0,01% (v / v) Silwet L-77 en het onderwerpen van de ondergedompelde planten vacuüm gedurende 3 - 5 minuten. Kwantificeer de bacteriegroei door gebruikelijke groei ^6,18,19 assay zoals hierna beschreven.
2. Bij 0 uur na inoculatie (hpi),3 dpi en 5 dpi, verzamel twee blad monsters van vijf biologische herhalingen voor elke nonhost ziekteverwekker (s) geënt bladeren met behulp van een blad punch (0,5 cm ^2). Maal het blad monsters, serieel verdund en plaat het sap op KB agar medium aangevuld met geschikte antibiotica en incubeer bij 28 ° C gedurende 2 dagen. Tel de kolonies met een kolonie teller en bereken de bacteriegroei in de bladeren, zoals beschreven in de voorgaande literatuur ^6.
3. Planten gevoelig voor nonhost ziekteverwekker (s) moet hoger aantal pathogeen groei ten opzichte van vector controle te tonen.

5. Sequencing de Invoegen en Identificatie van Target Gene

1. Voer kolonie PCR voor de geselecteerde kloon met attB1 en attB2 primers of met de primers aan weerszijden van de kloneringsplaats van de vector TRV2. Voer het PCR-product op de gel en controleren voor amplificatie van de enkele band.
2. Plantengen insert in de TRV2 vector kan worden gesequenced met behulp attBprimers of primers flankerende de kloneringsplaats.
3. Voer BLAST met de sequentie en de identificatie van gen gegevens.
4. Verkrijgen van volledige lengte gensequentie samen met de niet-vertaalde regio's (UTR).
5. Selecteer 300-400 bp fragmenten uit drie verschillende gebieden van de sequentie en klonen ze in TRV2 vector. Zelfstandig VIGS behulp van alle drie VIGS constructies uit te voeren en bevestig het compromis van nonhost verzet in alle drie de genen tot zwijgen planten.

Resultaten

Belangrijkste doel van deze studie is om een methode aan te tonen voor een eenvoudige en nauwkeurige identificatie van gen tot zwijgen N. benthamiana planten die worden aangetast voor nonhost weerstand. Er zijn vier belangrijke stappen in deze methode. Eerste stap is om individueel zwijgen groot aantal genen met behulp van TRV-VIGS. We hadden ongeveer 5.000 genen ^6,18 zwijgen over een periode van ongeveer 1,5 jaar gebruik van het protocol in figuur 1. Sommige genen tot zwijgen plante...

Discussie

Plant immuniteit beperkt de groei van nonhost ziekteverwekkers en dus weinig of geen groene fluorescentie wordt uitgezonden van vector-controle bladeren van de planten geënt met nonhost ziekte onder lange golflengte UV-licht (Figuur 3D). Wanneer een gen voor nonhost weerstand zwijgen, het gen tot zwijgen planten bevorderen de groei van nonhost pathogeen en groene fluorescentie wordt waargenomen (figuur 3E). Dit is het uitgangspunt bij de in dit manuscript beschreven werkwijze. Deze meth...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
96-well U-bottom plates	Becton Dickinson Labware (Franklin Lakes, NJ, USA)	35-3077
96-pin replicator stainless steel	Nalge Nunc International (Naperville, IL, USA)	250520
High Intensity UV Inspection Lamps, Model B-100ap	Thomas scientific (Swedesboro, NJ, USA)	6283K50	Manufacturer ID 95-0127-01
Stuart SC6 colony counter	Bibby Scientific Limited, Staffordshire, UK	SC6PLUS
Soil-less potting mixture, Metro-Mix 350	SUNGRO Horticulture Distribution, Inc., (Bellevue, WA, USA)
Primers: attB1 (GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT) attB2 (GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT)	Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA, USA)	Custom synthesized
MES, Monohydrate	VWR international (Radnor, PA, USA)	CAS No. 145224-94-8
Acetosyringone (Dimethoxy-4’-hydroxyacetofenon)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D134406
Vac-In-Stuff (Silwet L-77)	Lehle Seeds (Round Rock, TX, USA)	VIS-30