Fysiologische en anatomische technieken worden gedemonstreerd aan functie en structuur voor gezamenlijke proprioceptoren en spierspanning receptoren in schaaldieren wandelen ledematen te pakken.
Methodenartikel
Proprioceptie en Tension Receptoren in Crab Ledematen: Student Laboratorium Oefeningen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het primaire doel van deze procedures is voor onderwijs en onderzoek aan te tonen hoe de activiteit van levende primaire sensorische neuronen die verantwoordelijk zijn voor proprioceptie als ze detecteren gezamenlijke positie en beweging, en spierspanning te nemen. Elektrische activiteit van schaaldieren proprioceptoren en spanning receptoren wordt opgenomen door fundamentele neurofysiologische instrumentatie, en een omvormer wordt gebruikt voor het gelijktijdig meten van kracht die wordt gegenereerd door het stimuleren van een motorische zenuw. Daarnaast laten we zien hoe de neuronen vlek voor een snelle beoordeling van hun anatomische regeling of voor permanente bevestiging. Vlekken onthult anatomische organisatie die representatief is voor chordotonal organen in de meeste schaaldieren. Het vergelijken van de spanning zenuw reacties op de proprioceptieve reacties is een effectief leermiddel bij het bepalen hoe deze sensorische neuronen functioneel worden gedefinieerd en hoe de anatomie is gecorreleerd aan de functie. Drie kleuringstechniekenworden waardoor onderzoekers en docenten een werkwijze die ideaal is voor hun laboratorium kiezen.
Inleiding
Proprioceptie is de sensatie van ledematen positie en beweging dat gecoördineerd motorisch gedrag mogelijk maakt. Proprioceptoren bestaan uit stand (statisch) en beweging (kinetische) receptoren. Bij insecten en schaaldieren, chordotonal organen zijn de structuren die deze informatie verstrekken aan de CNS 1. Niet alle chordotonal organen omvatten een gezamenlijke, maar ze kunnen nog steeds gezamenlijke bewegingen te controleren door hun gehechtheid aan de apodemes (pees achtige structuren) die overspannen het gewricht en bewegen in samenwerking met de skeletspieren en gezamenlijke articulatie. Krab benen zes verbindingen, elk met een of twee chordotonal organen 2. Typisch een chordotonal orgel heeft 60-100 of meer sensorische neuronen ingebed in een elastische streng, neuronen die statische gezamenlijke positie, richting en snelheid van de beweging 3-6 signaleren. De inbreng van chordotonal organen voor elke verbinding en been wordt dan centraal verwerkt waardoor gecoördineerde bewegingen door het dier.
De krachten die beenspieren produceren tijdens isometrische en isotone contracties worden gedetecteerd door spanning receptoren geassocieerd met spiervezels en hun bijlagen aan apodemes7-9. In het schaaldier lopende poot protocollen die volgen geven we methodologie voor opnamen van primaire sensorische neuronen die proprioceptie controleren en de neuronen die reageren op krachten die ontstaan door spiervezels. Een techniek voor het activeren beenbewegingen en kwantificeren kracht generatie ook gepresenteerd als anatomische technieken die kunnen worden gebruikt om de rangschikking van deze perifere zenuwstelsel structuren te karakteriseren.
De onderstaande procedures aangetoond in staat structurele en functionele analyse van de neuronen die beide soorten receptoren opzichte van hun locatie op een chordotonal elastische draad en apodeme innerveren. Om dit te illustreren, gebruiken we de propodite-dactylopodite (PD) chordotonal orgel, het orgaan dat het meest distale segment van de krab been 3 overspant.Hoewel gedetailleerde elektrofysiologische studies begon in de jaren 1930 en worden nog steeds uitgevoerd vandaag, zijn sommige aspecten bekend is over de segmentale aansluitingen van proprioceptoren in de verschillende gewrichten en hun rol in de gecoördineerde controle van muscles10-16 geworden. Creëren van de structuur-functie relatie tussen de proprioceptieve organen, spieren en het zenuwstelsel zal verder helpen definiëren deze rollen. Bijvoorbeeld, het labelen van de somata en distale eindes van spanning neuronen ingebracht in de apodeme zullen hun locatie ten opzichte onthullen spiervezels 8,17-21.
We presenteren drie kleuringen voor schaaldier benen die kunnen worden gebruikt in onderzoek of academische laboratoria. Methyleenblauw kleuring biedt geschikte contrast voor spieren en zenuwen en wordt aanbevolen als een eenvoudige techniek voor studenten om de anatomie te leren. Labs die fluorescentie microscopie opstellingen hebben kunnen selectiever neuronale kleuring te bereiken door kort blootstellen van de zenuwTussen de vitale kleurstof 4-di-2-ASP. Het derde alternatief is CoCl2 opvulling, die vlekken en herstelt de neuronen, en geen fluorescentie beeldvorming vereisen. Hoewel het arbeids-en tijdsintensief, deze kleuring proces geeft een hoog contrast en specificiteit voor de zenuwen die zijn gevuld. Samen deze technieken kunnen worden gebruikt voor het vergelijken van verschillende chordotonal organen, niet alleen binnen een ledemaat of tussen ledematen, maar ook onder andere schaaldieren en insectensoorten 20-22. Blauwe krabben (C. sapidus) gebruikt in fysiologische opnames en voor anatomische vlekken zijn direct beschikbaar rondom de zuidelijke en zuidoostelijke grens van de Verenigde Staten. Deze soort dient als een vertegenwoordiger van de chordotonal en spanning zenuw regelingen in de meeste krabben. Laboratoria aan de westkust zal de voorkeur aan de veel grotere Dungeness krab (Cancer magister) te gebruiken voor deze experimenten.
Protocol
1. Dissectie en opnemen elektrische activiteit van de Propodite-dactylopodite (PD) Nerve
- Houd de krab over het schild van achter, en het vermijden van de klauwen, knijp het proximale deel van de meropodite met een tang. Het been zal autotomize om te voorkomen dat het dier dood te bloeden. Wees voorzichtig bij het hanteren van blauwe krabben als ze nogal agressief en zeer snel.
Figuur 1. Eerst lopen poot van een krab. De anatomische locatie van chordotonal organen (gearceerde gebieden) worden gesuperponeerd op dit schema. De dubbele pijlpunt geeft aan waar op de been voor de PD zenuw experimenten doorsnijden. Klik hier voor grotere afbeelding . - Maak een snede tussen de propodite en carpodite. Gooi de carpopodite en t hij (figuur 1) bevestigd meropodite.
- Snijd een groot raam in de cuticula op de gepigmenteerde (laterale) zijde van de propodite met een scalpel met een # 11 blade (figuur 2 en 3). Opmerking: niet diep ingesneden.
- Verwijder de schubbenlaag door onder schuiven van de scalpel en parallel aan de cuticula. Dit verbreekt de spiervezels aan de cuticula.
- Gebruikmaking van dezelfde techniek snijden een kleiner venster op de pigmentloze (mediale) zijde van de propodite, maar laat de condylus (het gewricht of scharnier tussen segmenten) gehechtheid intact.
Figuur 2. Knip langs de stippellijn op de propodite. Klik hier voor grotere afbeelding .
n "src =" / files/ftp_upload/51050/51050fig3.jpg "width =" 500px "/>
Figuur 3. Expose de zenuw in het venster (de pijlen een overzicht van de zenuw bundel). Klik hier voor grotere afbeelding . - Bereid een Sylgard omzoomde schotel met krab zoutoplossing om de voorbereiding vast te pinnen. Opmerking: Zie tabel 1 voor soortspecifieke zoutoplossing recepten.
- Zoek de PD orgel door voorzichtig sonderen met de brand gepolijst glas naalden. De elastische streng verspreid over het gewricht heeft een zilveren uiterlijk.
- Verwijder spiervezels dat de weergave van het orgel verduisteren van beide zijden van de pees. Wees zeer voorzichtig de PD orgaan of haar zenuwen niet te verwonden.
- Zodra dit is bereikt, stevig plaats de voorbereiding op de schaal met de pigment zijde (lateraal) naar boven (figuur 4).
Figuur 4. Exposed PD orgel en zenuwen. Klik hier voor grotere afbeelding . - Volg de PD orgel zenuw in de propodite zo ver proximaal mogelijk om vrij te maken van een lange lengte van de zenuw (1,5 cm) voor opname doeleinden. Dit gaat het beste, terwijl de PD zenuw is nog steeds verbonden aan de belangrijkste poot zenuw.
- Na het scheiden van de PD zenuw van de belangrijkste poot zenuw met behulp van glas naalden, verbreken de PD zenuw proximaal met de iris schaar. Opmerking: niet uitrekken of trek op de zenuw tijdens de dissectie.
- Verplaats de dactylopodite aan een uitgebreide en volledig gebogen stand. Kennis te nemen over waar de extreme flexie en extensie posities zijn en een half-way point voor later gebruik.
- Plaats een aardingskabel in het zoute bad.
- Zet de electrophysiology opnemen hardware / software. Opmerking: Onze setup heeft eerder 23 beschreven.
- Plaats de microscoop zodat het uitzicht op de microscoop podium. Zodra de prep schotel op het podium is geplaatst, moet u de positie van de hoge intensiteit hulplicht bundel best visualiseren de voorbereiding aan te passen.
- Plaats de micromanipulator zodat de bijgevoegde zuig elektrodesamenstel gemakkelijke toegang tot het zoutbad en voorbereiding heeft. De zuig-elektrode is geconstrueerd zoals in een online video 24.
- Om neurale activiteit detecteren, trek het afgesneden uiteinde van de PD zenuw in de zuig-elektrode.
- Verplaats de dactyl hele uitgebreide en gebogen posities voor meerdere cycli met behulp van een glazen sonde of houten pluggen.
- Volgende observeren activiteit wanneer de dactyl is vastgezet in het verlengde, gebogen, en mid positie.
2. Opnemen elektrische activiteit van de TensionNerve terwijl Monitoring troepenmacht
- Bepaal de laterale en mediale zijde van het been. De mediale zijde heeft een zachte structuur die kan worden gevoeld door knijpen zachtjes in de meropodite regio met een vingernagel.
- Plaats deze zachte nagelriemen naar boven in de schotel. De Excitor motorische zenuw die de opener spier innerveert innerveert ook de brancard spier in het carpopodite.
- Om de opener spier stimuleert de brancard motorische zenuw in de carpodite regio geïsoleerd en gestimuleerd met een zuig-elektrode. Het proximale gedeelte van het been verwijderd door doorsnijden de meropodite met een schaar.
- Verwijderen van een deel van de cuticula van de carpus gebied aan de binnenzijde (mediale zijde, figuur 5A).
- Snijd de apodeme van de bender spieren en verwijder de spier voorzichtig niet om de belangrijkste been zenuw trekken uit het been holte (Figuur 5B, C let op de pijlen waar Bender apodeme wordt gescheiden). De belangrijkste poot zenuw en een behanch de brancard spier kan dan worden waargenomen (Figuur 5D).
- Vind de zenuw vertakking van de belangrijkste zenuw bundel naar de brancard spier (figuur 5E, bij pijl). Kan dit dicht bij de spier worden gesneden en getrokken in een zuig-elektrode te stimuleren (figuren 5F en G, pijl toont de tak).
- Plagen uit een deel van de zenuw die uitsteekt naar de opener zonder te knellen de zenuw. Doorsnijden de brancard / opener motorische zenuw.
- Trek de motorische zenuw in de zuig-elektrode en vervolgens te stimuleren het.
- Om de opener spieren en spanning zenuw bloot verwijder de dichter spieren en het ventrale gebied van de propodite. Snijd de dichter spier met een scalpel met een # 11 mes in de propodite (Figuur 6). Opmerking: niet diep ingesneden in het proximale gebied, omdat het de opener motorische zenuwen kunnen beschadigen.
Figuur 5. Dissection stappen voor het blootstellen van de motor neuron voor het stimuleren van de opener spier. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 6. Snijd de cuticula op de ventrale helft van de propodite aan de dichter spieren zodat het kan worden verwijderd bloot. Klik hier voor grotere afbeelding . - Wisselen de zoutoplossing met verse gekoelde zoutoplossing gedurende de dissectie proces om de neuronen in leven te houden. Voor verdere dissectie, plaatst de voorbereiding gerecht onder een dissectie microscoop en gebruik maken van glasvezel-verlichting.
- Snijd de dichter pees voorzichtig uit de gehechtheid aande dactyl behulp puntig middelgrote schaar.
- Wees zeer voorzichtig de takken niet te storen aan de opener spier van de belangrijkste poot zenuw die duidelijk zichtbaar moet zijn.
- Verwijder en gooi de dichter spier en pees.
- Maak een gat in de dactyl met een dissectie pin. Dit gat wordt later gebruikt om de metalen pin op de spanning (kracht) transducer haak, maar het is noodzakelijk om het in dit stadium van de procedure.
- Zoek de zenuw tak die projecten aan de opener spier en apodeme in het distale deel van de opener spier. Sonde de zenuw voorzichtig met het vuur gepolijst glas tool.
- Let op de spanning zenuw die voortvloeit uit het distale uiteinde van de apodeme en opbrengst aan de motorische zenuw bundel.
- Om neurale activiteit detecteren, vul een zuig-elektrode met krab zoutoplossing en trek het afgesneden uiteinde van de opener spanning zenuw in de elektrode. Zorg ervoor dat de zuig-elektrode past strak op de zenuw.
- Onderzoeken voor de neural correlaat van passieve spanning op de opener apodeme. Tijdens het opnemen van elektrische activiteit van de spanning zenuw, draai de dactyl snel in een uitgebreide joint (dwz het uitrekken van de opener spier).
- Vervolgens testen actieve kracht ontwikkeling in relatie tot stimulatiefrequentie.
- Stevig bevestig een metalen haak zodat het uiteinde van de haak gaat door een klein gaatje in de dactyl.
- . Sluit het andere uiteinde van de metalen haak aan de krachtopnemer Opmerking: Zorg dat de transducer op een hoek van 90 ° elke keer zodat de pen loodrecht op de transducer voor maximale detectie van de gegenereerde kracht.
- Trek de haak en dactyl zodat het ongeveer een 45 ° hoek van de opener gewricht.
- Nu stimuleren de motorische zenuw bij 100 Hz voor 250 msec en meet de kracht en het afvuren frequentie van de spanning zenuw.
- Leg het gewricht in een volledig uitgestrekte positie zodat de opener spiervezels zijn slap.
- Stimulate de motorische zenuw bij 100 Hz voor 250 msec en meet de kracht en het afvuren frequentie van de spanning zenuw.
- Bend / flex het gewricht zodat het volledig is gebogen (~ 90 °). In deze stand de spiervezels van de opener volledig gestrekt. Er kunnen gemeten door de transducer door het passieve gedeelte van de spier.
- Stimuleren van de motorische zenuw bij 100 Hz voor 250 msec en meet de kracht en het afvuren frequentie van de spanning zenuw.
- Na het meten van een kracht te verlopen in een aantal verschillende frequenties: 20, 40, 60, 80 en 100 Hz 8-10 seconden in elk gewricht positie.
- Meet de respons met een snelle spanning release. Schik de voorbereiding, zodat de haak aan de krachtopnemer gemakkelijk uit kan worden geschoven van het gat in de dactyl.
- Bend / flex het gewricht zodat het volledig is gebogen (~ 90 °). Nu het stimuleren van de motorische zenuw bij 100 Hz met een continue stimulatie van 5 sec.
- Na de eerste Second of minder, zoals spanning heeft opgebouwd op de opener spier, duw de pin uit het gat in de dactyl.
- Onderzoek de spanning zenuw opname voor en na de vrijgave van de pin die de dactyl.
- Modulerende effecten van neuro-actieve stoffen zoals octopamine, serotonine en proctolin, die de uitgang van de spanning neuronen te veranderen, kan worden bepaald door deze moleculen de baden media via blootgestelde opener spier en herhalen van de experimenten.
- Gebruik een pipet en druppelen 1-2 ml over de voorbereiding.
3. Kleuring perifere zenuwstelsel Structuren in Crustacean Wandelen Benen
- Methyleenblauw techniek
- Verdun een deel methyleenblauw chloride voorraad-oplossing (0,25%) met twee delen gedestilleerd water.
- Voeg dit mengsel vijf delen gebufferde zoutoplossing. Grondig irrigeren het gebied van belang.
- Ontleden een been volgens het protocol in sectie 1. Incubeer de prebereiding in de methyleenblauwoplossing bij 12-13 ° C.
- Onderzoek de voorbereiding elke 10-15 minuten met de microscoop ontleden met behulp van lage intensiteit verlichting om de voortgang van de kleuring te volgen. In sommige gevallen kleuring zal in een uur worden voltooid, in andere gevallen kan het 's nachts te nemen.
- 4-di-2-ASP techniek
- Fluorescerende kleurstoffen kunnen worden gebruikt om back-vul de PD neuron of rechtstreeks vlek de voorbereiding van het bad. Maar een geschikte microscoop met mogelijkheden om de fluorescerende vlek te zien is vereist.
- Ontleden een been volgens een protocol in sectie 1.
- Incubeer de bereiding van een 10 uM concentratie van 4-di-2-ASP-oplossing en laat het preparaat in de koelkast gedurende 15 minuten. Gebruik net genoeg oplossing voor de voorbereiding te dekken.
- Fotografeer de voorbereidingen snel en te voorkomen dat over de blootstelling aan de kwik licht. Deze fluorescerende kleurstof verdwijnt relatief snel weg.
- Kobaltchloride techniek
- Expose de PD zenuw volgens het protocol in paragraaf 1 en houdt het ondergedompeld in een koude zoutoplossing.
- Maak een vaseline goed aan de CoCl2 houden. Als een CoCl2 gemorst in het zoute bad de hele voorbereiding zal vlekken zwart, en de voorbereiding moet worden weggegooid.
- Slip een klein sneetje van een polystyreen plaat, een plastic platform, en speld het op zo'n manier dat het niet weg zal drijven of wordt ondergedompeld in het zoutbad (figuur 7).
Figuur 7. Polystyreen plaat met pinnen om zijn plaats te houden in de schotel. Klik hier voor grotere afbeelding . - Eject vaseline uit een fijne injectienaald bevestigd aan een wegwerpspuit,maak dan een barrière (een cirkel kan goed werken), dat moet ongeveer 1-1,5 mm hoog, met uitzondering van een ondiepe "V" op het middelpunt waar de zenuw wordt gedrapeerd over, op de top van de slip van polystyreen.
- Voeg een plasje zout aan weerszijden van de dam bij de "V". Zorg ervoor niet te rekken of knijpen de zenuw, til de zenuw voorzichtig uit de schotel en plaats deze in het zoute plas in de vaseline ook.
- Werk snel, zodat het gedeelte van de zenuw niet uitdroogt, zorgvuldig uitwerpen vaseline om de blootgestelde zenuw dekken. Test nu de barrière met een zoutoplossing en zorg ervoor dat deze niet lekt.
- Dep weg zoutoplossing aan de binnenkant van de barrière en zien of het vult wanneer het bad zout is hoog rond de muur van vaseline om zeker te zijn dat de twee partijen zijn van elkaar geïsoleerd (figuur 8).
ng> Figuur 8. Vaseline goed met zout en PD zenuw verspreid over de put. De PD zenuw is nog niet geknipt. Klik hier voor grotere afbeelding . - Lont weg van de zoutoplossing in de put met behulp van een stukje weefsel papier. Voorkom dat het papier wikkel het zenuw.
- Maak een nieuwe plas met behulp van een paar kleine druppels gedestilleerd water, en knip dan de zenuw einde. Wees zeer voorzichtig de zenuw niet te trekken door de barrière bij het maken van de snede. De osmotische shock van het gedestilleerd water zal "ballon" de axonen.
- Binnen 30 seconden toe te voegen een kleine druppel CoCl2 aan het water, genieten van deze oplossing, en vervolgens voeg genoeg CoCl2 om een plas te vormen via deze verkorte gedeelte van de zenuw (Figuur 9). De voorbereidingen zijn best bewaarde gekoeld bij 13 ° C gedurende 12-24 uur.
tp_upload/51050/51050fig9.jpg "width =" 500px "/>
Figuur 9. De cut PD zenuw wordt blootgesteld aan CoCl2. De cut zenuw opzwelt in aanwezigheid van water dat door de axonen in het neuron cellichamen vergemakkelijkt en versnelt de beweging van kleurstofmoleculen. Klik hier voor grotere afbeelding . - Verwijder de bevochtiging plassen. Dep weg de kobalt oplossing met een tissue en was de restanten van kobalt weg met een aantal wijzigingen van een zoutoplossing.
- Breng de geïsoleerde voorbereiding op een kleine glazen petrischaal met ongeveer 10 ml van krab zoutoplossing. De neuronen worden gewassen en de volgende stappen worden uitgevoerd in situ. Geschikt metalen gereedschappen niet worden gebruikt om het preparaat na deze stap (moet speciale software die niet worden gebruikt op een later tijdstip fysiologie gebruikt) verwerken.
- Voeg 1-2 druppels ammoniumsulfide (NH4) 2S de zoutoplossing. Cap de (NH 4) 2 S fles en plaats terug in de kap. Let op de reactie in de voorbereiding onder een dissectie microscoop
- In 1-2 min, dient-kobalt gevuld neuronen en hun processen beginnen te verschijnen, omdat ze zwarte vlekken op.
- Na 5-10 minuten, vervang de ontwikkeling oplossing met verse zoutoplossing.
- Zorg ervoor dat de ontwikkeling oplossing die u in de gootsteen hebben gegoten wordt gevolgd door stromend water voor een paar minuten of in een fles afval met een deksel.
- Giet de zoutoplossing en bevestig de zenuw voorbereiding op ongeveer 15 minuten met twee wijzigingen van Bouin's fixatief oplossing. Voor grotere weefsels zoals de opener spier (spanning neuronen vlekken), verhoging van de duur van de fixatie tot 30 minuten.
- Dehydrateer in een reeks oplopend van ethanolconcentratie vanaf 70% (dat wil zeggen 70%, 80%, 90%, 100%). Ongeveer 10 min bij elke concentratie is voldoende voorkleine weefsels.
- Na ongeveer 10-15 minuten in twee wijzigingen van 100% ethanol, schakelt u het weefsel door ethanol te vervangen door 100% methylsalicylaat. De voorbereiding zal permanent blijven in deze oplossing voor herhaalde weergave. Met de tijd zal de gevulde cellen duidelijker worden omdat het omliggende weefsel duidelijker zal worden. Intensivering methoden kunnen worden gebruikt om te helpen vervagen in de tijd 25.
- Gebruik dezelfde procedure om de spanning zenuw vullen met CoCl2. Echter, meerdere keren veranderen ethanol oplossing in elke ethanol dehydratatiestap en incubeer de voorbereiding binnenkant alcohol voor ongeveer 20 min voor elke stap grondig uitdrogen van de spieren en laat ze goed duidelijk.
Resultaten
Wanneer de PD orgel wordt uitgerekt door volledig uitbreiding van het gewricht, activiteit in de PD zenuw is robuust tijdens de beweging, zoals aangegeven voor de eerste seconde in Figuur 10. Sommige activiteit blijft, terwijl het nog steeds wordt gehouden in de open positie. Deze activiteit komt van de statische positie gevoelige neuronen (tweede helft van de in figuur 10 opname). Beweging roept een reactie tijdens verplaatsing, en het afvuren is vooral aanwezig bij strekking van de chordotonal streng (Figuur 11).
Verdere analyse van de pieken kan gemakkelijk worden benaderd door het sorteren van de relatieve amplitudes. Dit is een benadering van verschillende populaties van sensorische neuronen wordt aangeworven met posities of soorten bewegingen 5 demonstreren. Typische amplitudes variëren 0,25-1,5 mV, maar deze waarden afhankelijk van de weerstand (dwz dichtheid) van de zuig-elektrode afdichting. Frequentie van spikes in thij diverse grootte bereiken kunnen ook grafisch worden weergegeven voor analyse.
Krachten die door de opener spier ten opzichte van de stimulatiefrequentie kan worden vergeleken door superpositie van de aangelegde spanning-tijd sporen op elkaar (figuren 13A en B). Dit kan ook worden uitgevoerd voor elk gewricht Voor elk gegeven stimulatiefrequentie. Activiteit van de zenuw spanning kan vervolgens worden gecorreleerd met de hoeveelheid relatieve kracht gegenereerd om elke stimulatiefrequentie en voor elke verbinding positie. Zoals in de PD zenuw, verschillende piek amplitudes worden gezien in reactie op contractie van de opener spier (figuur 13C).
Anatomische opstelling van neuronen in de lopende poot wordt duidelijk waargenomen met methyleenblauw kleuring (Figuur 14). Let op de elastische chordotonal streng en spanning neuron dat dicht bij de apodeme. Verschillende somata met verschillende diameters eend specifieke locaties zijn ook zichtbaar in deze figuur. De gehele verloop van de spanning zenuw en brancard motorische zenuwen worden in Figuur 15. Individuele neuronen van de PD zenuw getoond met een hoger contrast met 4-di-2-ASP (Figuur 16) en CoCl2 (Figuur 17) backfill technieken. Bij een hoge vergrotingsfactor de sensorische eindes te zien binnenkant van de ondersteunende scolopales (figuren 16B) 21,22,26.
Figuur 10. Verplaats en houd bij 0 °. De dynamische neuronen zijn robuust in afvuren tijdens de beweging en spikes van statische gevoelige neuronen zijn aanwezig, terwijl het gewricht wordt opengehouden. Klik hier voor grotere afbeelding </ A>.
Figuur 11. Rapid geopend en sluiten van volledig gebogen om uitgebreide (90-0 °) positie. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 12. Extracellulaire spikes opgenomen van de PD zenuw. Het gewricht is volledig uitgeschoven en dan snel verplaatst naar een ½ gebogen positie en hield toen stil. Let op de activiteit tijdens de beweging en een verminderde activiteit bij statisch. Klik hier om een grotere ima bekijkenge.
Figuur 13. De relatieve krachten die zijn ontwikkeld met het gewricht volledig gebogen en gestimuleerd op de verschillende frequenties. (A) Spanning-tijd sporen van de krachtopnemer worden getoond met elk stimulatie frequentie. (B) De sporen in paneel A worden gesuperponeerd in verschillende kleuren voor gemak van vergelijking. (C) Spanning-tijd sporen van elektrische activiteit geregistreerd vanaf de spanning zenuw bij de motorische zenuw gestimuleerd werd bij 80 Hz. Opmerking regelmatig patroon van de stimulusartefacten ten opzichte van de neurale activiteit. Let ook op de verschillende amplitudes van de neurale reacties. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 14. Methyleenblauw vlek van de lopende poot voorbereiding. Individuele SOMA worden getoond met hun zintuiglijke eindes uitsteekt in de elastische draad. Dicht bij de apodeme een spanning neuron wordt getoond. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 15. De spanning zenuw die voortvloeien uit het distale einde (rode pijlen) en de toetreding tot de motorische zenuw (groene pijl). Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 16. (A) Een back-vulling van de PD zenuw in Cancer magister met 4-Di-2-ASP. (B) Hogere vergroting van sensorische eindes. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 17. Neuronen die waren gevuld met CoCl2 en verwerkt (A). Getraceerd overzicht van de gebrandschilderde voorbereiding getoond (B). Klik hier voor grotere afbeelding .
| Zoutoplossing | g / L |
| NaCl | 27.29 |
| KCl | 0.81 |
| MgSO4 • 7H 2 O | 4,81 |
| CaCl2 • 2H 2 O | 1,85 |
| Na 2 SO 4 • 10H 2 O | 0.97 |
| Dextrose (D-glucose) | 1.982 |
| HEPES zuur | 0.476 |
| HEPES zout | 2.08 |
| Breng de pH 8.1 met NaOH of HCl |
Tabel 1. Recepten voor krab zoutoplossing.
Discussie
Het doel van deze reeks experimenten is 1) de fundamentele beginselen van extracellulaire registraties leren en vertonen van een herkenbare proprioceptieve orgel en spanning zenuw en 2) om het belang van anatomische mapping benadrukken in relatie tot fysiologische functie van bepaalde sensorische systemen. Deze experimentele benadering en de gebruikte diermodellen zijn goedkoop en relatief eenvoudig uit te voeren in neurofysiologie onderwijslaboratoria.
De neuronen van chordotonal organen van twee specifieke functionele types, degenen die reageren op beweging en degenen die reageren op statische posities. Single cell opnamen van verschillende chordotonal organen, ongeacht welke verbinding wordt onderzocht, hebben aangetoond dat dit het geval is 3,5. Inderdaad, chordotonal organen in verband met de antennaal gewrichten van kreeften onthullen dezelfde twee zintuiglijke soorten en basisanatomie 27. In aanvulling op dat er twee soorten neuronen (beweging en positiop), de neuronen delen dezelfde anatomische regeling op hun respectieve elastische strengen. De grote somata zich proximaal aan de streng meestal behoren tot de dynamische beweging gevoelige neuronen. Neuronen die statische posities signaal kleine somata en zijn distaal gelegen. Deze cellen zijn stimulerende werking. De PD joint bevat slechts een enkele chordotonal orgel terwijl er twee chordotonal organen in het carpaal-propodus (CP) en Merus-carpus (MC) gewrichten.
De dissectie om proprioceptieve structuren bloot te leggen in blauwe krabben (C. sapidus) voor elektrofysiologische opname vereist een strategie die het mogelijk maakt gezamenlijke bewegingen plaatsvinden in de natuurlijke positie tijdens het opnemen van sensorische neuronen. De spanning zenuw voor de opener spier in het lopende poot, is een zeer fijne zenuw bestaat uit verschillende neuronen. Tenzij zorg wordt besteed, de spanning zenuw en de motorische zenuw innerveren de spier te stimuleren, kunnen tijdens deze dissectie worden beschadigd. Vooroptimale opnamen de zuigkracht elektroden moeten worden afgestemd op de grootte van de zenuw. Opnamen zijn gemakkelijk toegankelijk in een student laboratorium met behulp van een 30-40x vergroting dissectiemicroscoop en low-end micromanipulators.
Toekomstige experimenten die interessant zou zijn om na te streven met de gezamenlijke chordotonal organen zou zijn om de structurele en fysiologische profielen tijdens been regeneratie in verschillende soorten onderzoeken in verschillende stadia van de levenscyclus als een vervolg op een eerste studie die Cancer magister 19,26 gebruikt . Vragen die nog moeten worden aangepakt zijn: 1) heeft de distributie en de organisatie van kunstmatige neuronen zijn afhankelijk van de leeftijd van het dier wanneer het regenereren van een ledemaat, 2) zijn de axonale projecties aan de CNS (buikzenuwkoord) in een regenererende ledematen functioneel of toch niet neem de tijd en het gezamenlijk gebruik van functionele verbindingen tot stand, en 3) wat er gebeurt met de afgehakte axonen proximaal van de autotomie vliegtuig toen de ledematen is autotomized? 28
Schaaldieren voldoen aan milieuomstandigheden en de omringende temperatuur, maar het is onduidelijk hoe deze coördinatie te handhaven binnen een neuraal circuit neuronen veranderen hun activiteit in reactie op temperatuurveranderingen. Een langzame tempo van verandering kan het dier laten wat tijd voor acclimatisatie, terwijl een snelle verandering kan not29, 30. Fysiologische veranderingen in de pH of osmolariteit te wijten aan het metabolisme, gedrag 31, of milieueffecten kunnen soortgelijke uitdagingen presenteren aan neurale circuits die betrokken zijn bij proprioceptie. Deze schaaldier preparaten zijn ideaal voor het aanpakken van dergelijke problemen, omdat hun functie goed gekarakteriseerd op een enkele cel niveau.
In dit protocol hebben we de fysiologische betekenis van spanning neuronen in het toezicht kracht die door de opener spier aangetoond. Deze spanning receptoren kunnen hun locatie binnen de apodeme worden opgespoord met behulp van kleuringen. Dezeneuronen, zoals bij zoogdieren, sporen kracht op verschillende niveaus en aanwerving van extra neuronen als de kracht toeneemt. De frequentie activiteit is gerelateerd aan de stimulatiefrequentie van de motor neuron tot verzadiging in ontvangst bereikt. Met behulp van een quick release protocol met de gebogen dactylus gewricht, spanning activiteit verdwijnt snel, maar keert dan terug bij het herwinnen van spanning in een volledig uitgeschoven gewricht. Dit is een klassieke experimentele procedure om de kracht gemeten spanning receptoren illustreren. Verschillende neuromodulators kan worden toegepast op de bereiding te zien hoe het effect van de ontwikkeling van kracht en neuronale respons. Een van de belangrijke aspecten is hoe de neurale reacties worden verwerkt en geïntegreerd in het centrale zenuwstelsel en hun invloed op de activiteit van de motorische neuronen. De technieken die we hebben laten zien zodat men om te beginnen om meer informatie over de spanning (zintuiglijke) zenuw-motorneuron circuit functie, dwz signaal in een intacte been om het ganglion en weer terug te pakkende spier.
De kleuringen aangetoond zijn de sleutel tot het begrijpen van de fysiologie van sensorische neuronen die proprioceptieve organen innerveren. Anatomische opstelling van de neuronen op basis van functie en de grootte van de soma vergelijkbaar zijn in de verschillende organen in de chordotonal krabbenpoten. Het is niet bekend of vergelijkbare neuronale regelingen ook worden gevonden in andere schaaldieren soorten of insecten. De combinatie van fysiologische opnames van enkele cellen en in kaart brengen van de locatie biedt directe structuur-functie relaties. De lange termijn bewaring van de anatomische regeling met CoCl2 kleuring en fixatie kan men herhaaldelijk maatregelen maken en beoordelen van de structurele regeling.
Proprioceptie en spanning ontvangst van skeletspieren zijn zintuiglijke modaliteiten die gecoördineerde gedragingen en reacties op externe en interne omgeving voor gelede dieren in een verscheidenheid van de skeletspieren configuraties. De spier receptor orgel in de buik van de rivierkreeft is een andere goed gedocumenteerde voorbereiding (zie de Crawdad Project; http://www.crawdad.cornell.edu/ ) voor onderwijsdoeleinden van proprioceptie met slechts twee neuronen per abdominale hemi-segment 23 . In staat zijn om op te nemen van enkele neuronen tot sensorische zenuwbanen geeft nadere bijzonderheden die helpen bij het begrijpen van de basisprincipes van de zintuiglijke receptie. Deze relatief eenvoudige schaaldier preparaten toelaten dat een fundamentele aspecten van proprioceptie en spanning controle pakken, met de potentie om de neurale circuits die centrale integratie van proprioceptieve en andere sensorische input 9-12, 32, 33 mogelijk te bepalen.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
De auteurs zijn dankbaar voor de artistieke bijdragen van Hyewon Cooper.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Sylgard | Dow Corning | 182 siliconen set | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| HEPES zuur | Sigma | 3375 | Vrij zuur, kristallijn |
| HEPES basis | Sigma | ||
| D-Glucose | Sigma | G7021 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma | M2643 | |
| Na2SO4•10H2O | Sigma | 246980 | |
| Bouin’s oplossing fixatief | Sigma | HT10-1-32 | Let op: Gevaarlijk materiaal (Speciale verzendkosten vereist) |
| CoCl2 | Sigma | Let op: Gevaarlijk materiaal. Volg de juiste verwijdering volgens lokale en federale regelgeving. | |
| Methyleenblauwchloride | Matheson Co., Inc | Basic Blue 9, C.I. 52015 | |
| 4-Di-2-ASP | Molecular Probes | 4-(4-diethylaminostyryl)-N-methylpyridiniumjodide | |
| Bleekmiddel | Sigma-Aldrich | Naar chloorzilverdraad | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | Om de pH aan te passen |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | Om de pH aan te passen |
| Materialen | |||
| Dissectie-instrumenten | World Precision Instruments | assortiment | |
| Intracellulaire elektrode sonde | |||
| Faraday kooi | |||
| Insectenpins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
| Dissectiemicroscoop (100X) | |||
| Vezeloptische lamp | |||
| Kleine verstelbare spiegel | Om het lichtbundel naar de voorbereiding te richten. | ||
| Glazen elektroden | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Doos van 200, zuigelektroden |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Kan worden bevestigd voor basis of op een metalen staaf |
| Verhoogde voorbereiding standaard | |||
| Zilverdraad (10/1.000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
| Computer | Elk bedrijf | ||
| AC/DC differentiële versterker | A-M Systems | Model 3000 | |
| PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
| Krachttransducer | AD Instruments | 0-50g | MLTF050/ST |
| Head stage | AD Instruments | Komt met AC/DC versterker | |
| LabChart7 | AD Instruments | ||
| Elektrische leidingen | Elk bedrijf | ||
| Glas gereedschap | Maak zelf | Voor het manipuleren van zenuwen | |
| Kabel en connectoren | Elk bedrijf | ||
| Pipetten met bulben | Fisher Scientific | 13-711-7 | Doos van 500 |
| Bekers | Elk bedrijf | ||
| Was of modelleerklei | Elk bedrijf of lokale winkels | ||
| Stimulator | Grass Instruments | SD9 of S88 | |
| Kunststof tip voor zuigelektrode | Locale hardware winkel (Watt’s merk) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Snijden in kleine stukken. Uit een vlam trekken en de punt terugsnijden tot de juiste grootte |
Referenties
- Whitear, M. Chordotonal organs in Crustacea. Nature. 187, 522-523 (1038).
- Alexandrowicz, J. S. The comparative anatomy of leg propriocetors in some decapod Crustacea. J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 52 (3), 605-634 (1972).
- Hartman, H. B., Boettiger, E. G. The functional organization of the propys-dactylus organ in Cancer irroratus Say. Comp. Biochem. Physiol. 22, 651-663 (1967).
- Cooper, R. L., Hartman, H. B. Responses of the bender apodeme tension receptors in the Dungeness crab, Cancer magister. Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 109 (2), 479-486 (1994).
- Cooper, R. L. Mapping proprioceptive neurons on chordotonal organs in the crab, Cancer magister. Crustaceana. 81 (4), 447-475 (2008).
- Burke, W. An organ for proprioception and vibration sense in Carcinus maenas. J. Exp. Biol. 31, 127-138 (1953).
- Hill, A. V. First and Last Experiments in Muscle Mechanics. , Cambridge University Press. Cambridge, U.K. (1970).
- Stuart, D. G., Mosher, C. C., Gerlach, R. L., Reinking, R. M. Mechanical arrangement and transducing properties of Golgi tendon organs. Exp. Brain Res. 14 (3), 274-292 (1972).
- Macmillan, D. L., Dando, M. R. Tension receptors on the apodemes of muscles in the walking legs of the crab, Cancer magister. Mar. Behav. Physiol. 1 (1-4), 185-208 (1972).
- Bévengut, M., Simmers, A. J., Clarac, F. Central neuronal projections and neuromuscular organization of the basal region of the shore crab leg. J. Comp. Neurol. 221 (2), 185-198 (1983).
- El Manira, A., Cattaert, D., Clarac, F. Monosynaptic connections mediate resistance reflex in crayfish (Procambarus clarkii) legs. J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 337-349 (1991).
- Le Bon-Jego, M., Cattaert, D. Inhibitory component of the resistance reflex in the locomotor network of the crayfish. J. Neurophysiol. 88 (5), 2575-2588 (2002).
- Ray, D. L., Clarac, F., Cattaert, D. Functional analysis of the sensory motor pathway of resistance reflex in crayfish. I. Multisensory coding and motor neuron monosynaptic responses. J. Neurophysiol. 78 (6), 3133-3143 (1997).
- Wiersma, C. A. G. Vergleichende Untersuchungenüber das periphere Nerve-muskelsystem von Crustaceen (Comparative studies on the peripheral nerve-muscle system of crustaceans). J. Comp. Physiol. 19, 349-385 (1933).
- Wiersma, C. A. G. Movement receptors in decapod crustacea. J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 38 (01), 01-143 (1959).
- Hartman, H. B. Tension receptors on the closer muscle apodeme in the walking legs of the blue crab Callinectes sapidus. J. Comp. Physiol. A. 157 (3), 355-362 (1985).
- Holsinger, R. The effect of regional phenotypic differences of Procambarus clarkii opener muscle on sarcomere length, fiber diameter, and force development MSc thesis [dissertation]. , University of Kentucky. (2013).
- Parsons, D. W. The morphology and ultrastructure of tension receptors in the walking legs of the crab, Carcinus maenas. Cell Tissue Res. 211 (1), 139-149 (1980).
- Parsons, D. W. Responses and central interactions of tension receptors in the leg muscle of Carcinus. Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 72 (2), 391-399 (1982).
- Tryba, A. K., Hartman, H. B. Dynamic responses of series force receptors innervating the opener muscle apodeme in the blue crab, Callinectes sapidus. J. Comp. Physiol. A. 180 (3), 215-221 (1997).
- Whitear, M. The fine structure of crustacean proprioceptors. I. The chordotonal organs in the legs of the shore crab, Carcinus meanas. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 245 (725), 291-325 (1962).
- Whitear, M. The fine structure of crustacean proprioceptors. II. The thoracico-coxal organs in Carcinus, Pagurus and Astacus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 248 (752), 437-456 (1965).
- Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. Muscle Receptor Organs in the Crayfish Abdomen: A Student Laboratory Exercise in Proprioception. J. Vis. Exp. (45), e2323(2010).
- Baierlein, B., Thurow, A. L., Atwood, H. L., Cooper, R. L. Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises. J. Vis. Exp. (47), e2322(2011).
- Delaney, K., Gelperin, A. Cerebral interneurons controlling fictive feeding in Limaxmaximus; I. Anatomy and criteria for re-identification. J. Comp. Physiol. A. 166, 297-310 (1990).
- Hartman, H. B., Cooper, R. L. Regeneration and molting effects on a proprioceptor organ in the Dungeness crab, Cancer magister. J. Neurobiol. 25 (5), 461-471 (1994).
- Hartman, H. B., Austin, W. D. Proprioceptor organs in the antennae of Decapoda Crustacea. J. Comp. Physiol. 81 (2), 187-202 (1972).
- Cooper, R. L. Development of sensory processes during limb regeneration in adult crayfish. J. Exp. Biol. 201 (Pt 11), 1745-1752 (1998).
- Chung, Y. -S., Cooper, R. M., Graff, J., Cooper, R. L. The acute and chronic effect of low temperature on survival, heart rate and neural function in crayfish (Procambarus clarkii) and prawn (Macrobrachium rosenbergii) species. Open J. Mol. Int. Physiol. 2 (3), 75-86 (2012).
- Blundon, J. A. Effects of temperature and thermal history on neuromuscular properties of two crustacean species. J. Comp. Physiol. B. 158 (6), 689-696 (1989).
- Cooper, R. M., Schapker, H., Adami, H., Cooper, R. L. Heart and ventilatory measures in crayfish during copulation. Open J. Mol. Int. Physiol. 1 (3), 36-42 (2011).
- Bierbower, S. M., Cooper, R. L. The mechanistic action of carbon dioxide on a neural circuit and NMJ communication. Journal of Experimental Zoology. , (2013).
- Bierbower, S. M., Shuranova, Z. P., Viele, K., Cooper, R. L. Sensory systems and environmental change on behavior during social interactions. Brain Behav. 3 (1), 4-13 (2013).
Herprints en machtigingen
