Intramyocardiale Cell Levering: Waarnemingen in Muizen Harten

Samenvatting

Intramyocardial cel levering in muriene modellen van cardiovasculaire ziekten, zoals hypertensie of myocardiaal infarct, wordt veel gebruikt om het therapeutisch potentieel van verschillende celtypes in regeneratieve studies testen. Daarom zal een gedetailleerde beschrijving en een duidelijke visualisatie van deze chirurgische procedure helpen om de beperkingen en voordelen van cardiovasculaire cel therapeutische analyses in kleine knaagdieren te definiëren.

Samenvatting

Eerdere studies toonden aan dat de cel levering bevordert de hartfunctie verbetering door afgifte van cytokinen en factoren die hartweefsel revascularisatie en overleving van cellen te verhogen. Bovendien aanvullende opmerkingen bleek dat stamcellen, zoals hart stamcellen, mesenchymale stamcellen en cardiospheres hebben de mogelijkheid om te integreren in het omliggende myocard door differentiëren in cardiomyocyten, gladde spiercellen en endotheelcellen.

Hier presenteren we de materialen en methoden betrouwbare levering noncontractile cellen in de linker ventriculaire wand van immunologisch muizen. De meest opvallende stappen van deze microchirurgische procedure te betrekken anesthesie en analgesie injectie, intratracheale intubatie, incisie aan de borst te openen en het hart en de levering van de cellen bloot door een steriele 30-gauge naald en een precisie microliter spuit.

Weefselverwerking bestaande uit hart oogsten, embedding snijden en histologische kleuring toonde aan dat intramyocardial celinjectie produceerde een kleine beschadiging het epicardiale gebied, en in de ventriculaire wand. Noncontractile cellen werden gehandhaafd in de myocardiale wand van immuungecompromitteerde muizen en werden omringd door een laag van fibrotisch weefsel, waarschijnlijk tegen cardiale druk en mechanische belasting.

Inleiding

Verschillende cel leveringsprotocollen zijn getest in muizen en ratten modellen van cardiovasculaire ziekten teneinde vertalen de efficiëntie, doeltreffendheid en veiligheid van deze experimentele procedure menselijke patiënten. In kleine knaagdier harten, intramyocardiale cel levering is de meest haalbare methode van cel levering ^1,2, terwijl in de rat hart antegrade ³ en ⁴ retrograde intracoronaire cel infusie kan ook worden gebruikt. Beide methoden hebben beperkingen en voordelen. Cel levering intracoronair heeft theoretische voordelen ten opzichte van directe intramusculaire injectie in de bevordering van de wereldwijde verspreiding cel ^3, maar het heeft ook het risico van het veroorzaken van coronaire embolie ^3,5. Beperkingen op intramyocardiale levering worden geassocieerd met mechanische schade, acute ontsteking, en myocardschade ^6,7. Bij de mens, zijn cellen voor cardiale reparatie door intramyocardiale injectie geleverd via een endocardiale of chirurgische epicardiaalbenaderen of door intracoronair arteriële route ^8. Injectie door transvasculaire routes is geschikt bij patiënten met acute infarct en gereperfundeerde myocard, maar is niet altijd mogelijk in het geval van totale afsluitingen of slechte doorstroming binnen de vaten van de getroffen gebied ^9. Directe injectie in de ventriculaire wand van transendocardial of transepicardial injectie technisch mogelijk afhankelijk van de patiënt gezondheidstoestand. Inderdaad is aangetoond dat deze techniek veilig ^10,11, hoewel voor transepicardial injectie open borstchirurgie noodzakelijk en transendocardial benaderingen een elektrofysiologische afbeelding voor elke patiënt moet plaatsen van levensvatbare ischemisch myocardium of littekens ⁹ differentiëren.

Belangrijk in celtherapie studies de keuze van de beste cel te transplanteren wordt nog onderzocht. Korte termijn analyses (4 weken) aan dat injectie van cardiale stamcellen gedefinieerd cardiospheres ^{12 of side population stamcellen uit beenmerg 13 geïnduceerde cardiale functioneel herstel in muizen 14 en rat 15 modellen van myocard infarct door het verminderen van litteken grootte en celdood. Allogene transplantatie van cardiospheres in een rat hartinfarct model zonder immunosuppressie werd veilig bevonden, bevorderd cardiale regeneratie, en een verbeterde hartfunctie door middel van stimulatie van endogene mechanismen reparatie 15. Lin-/c-kit + volwassen progenitorcellen in het hart bleken zelf-vernieuwing, clonogene en multipotent in vitro en in vivo, en bij injectie in een ischemische rattehart gereconstitueerde grote delen van de verwonde hartspier 16 en hadden mogelijkheid om geleidende en intermediair-en kleinbedrijf kransslagaders 17 vormen. Deze veelbelovende gegevens aangewakkerd fase I en II klinische studies bij de mens: injectie van autologe en allogene mesenchymale stamcellen (MSC) 18, cardiospheres 19Of c-Kit positieve cardiale stamcellen (CSC) 20 in ischemisch mensenharten elk werden voordelen van de hartfunctie in lange termijn studies. Toch uitgebreide lange termijn follow-up en een retrospectieve meta-analyse toonde aan dat stamceltherapie biedt aanzienlijke voordelen voor sommige patiënten, maar niet bij anderen met een bereik van onvoorspelbare uitkomsten 21. Het is mogelijk dat deze beperkingen het ontwerp van specifieke protocollen cel levering voor ieder individu en ziekte noodzakelijk.}

In muis en rat modellen, lange-termijn studies blijkt dat celinjectie geen verdere verbetering van de hartfunctie (12 maanden). Inderdaad, enten van menselijke embryonale stamcellen afgeleide cardiomyocyten (hESC-CM) werden grotendeels geïsoleerd van de host myocard door een laag van fibrotische weefsel ^22,23. Vergelijkbare resultaten zijn waargenomen na intramyocardiale transplantatie van skeletmyoblasten naar het hart van geïnfarceerde muizen ^24. Furthermore, de lange termijn kan van allogene MSC om te functioneren in het infarct hart bewaren is beperkt door overgang van een immunoprivileged tot een immunogeen staat na differentiatie ^25.

Rekening houdend met de uitdagingen en vooruitzichten hierboven geschetste, tonen we hier hoe cellen leveren door intramyocardiale injectie bij muizen. We zien dat de cellen zonder cardiomyocyte contractiele eigenschappen niet verbonden met de gastheer myocard en vormen een samenhangende massa met een dunne fibrotische barrière. Hoewel in sommige gevallen uitkomst voordelig kunnen zijn, kan de volgende analyse nuttig zijn om te begrijpen hoe cellen innesteling kunnen variabel zijn om functioneel verbonden myocard structuren genereren ook.

Protocol

Alle dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de internationale (Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement) en nationale (UK Home Office, Act 1986) regelgeving. De hierin beschreven procedures maken deel uit van ons plan van het werk volgens de Britse autoriteiten van afgifte en zijn niet uitgevoerd voor het doel van de opname.

1. Bereiding van Cellen

Dit protocol beschrijft de bereiding van een bepaalde cellijn (humane embryonale nier, HEK293 cellen) voor demonstratiedoeleinden. Cel-specifieke protocollen moeten worden gebruikt voor het kweken en uiteindelijk differentiëren pluripotent of volwassen stamcellen in specifieke cellijnen.

1. Groeien cellen in DMEM media (hoge glucose, 4.500 mg / L) met 1% natriumpyruvaat, 2 mM glutamine, 1% antibioticum Pen / Strep en 10% foetaal runderserum (FBS). Een 10 cm plaat moet normaliter worden gesplitst op 1:03 en media aangevuld vers om de twee dagen.
2. Behandel cellen mild met trypsin 1x en resuspendeer in DMEM medium volgens 1:1.
3. Tellen cellen in een hemocytometer kamer en laat 3 x 10 ⁶ cellen in een afzonderlijke buis.
4. Centrifugeer in een swing bucket rotor bij 100 g gedurende 5 minuten.
5. Verwijder het supernatant en was de cel pellet met steriele fosfaatbuffer 2x.
6. Resuspendeer in PBS 1x bij een concentratie van 10 ^6/50 ul voor injectie in de linker ventrikel van immunologisch muizen.

2. Prechirurgische Voorwaarden

1. Handhaaf immunologisch muizen (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD) met steriel voedsel pellets en water in een temperatuurgecontroleerde isolator (22 ° C, Tabel 1) voor elke operatie.
2. Voer chirurgie van immunologisch muizen onder een laminaire stroming kap. Reinig de werkruimte met 70% ethanol en autoclaaf chirurgische instrumenten (tang en schaar).
3. Schakel de verwarming pads voor de operatie en voor de terugvordering. Verwarming pads zijn belangrijkde vermindering van de temperatuur die tijdens en na de operatie blokkeren.
4. Plaats een schone en geautoclaveerd kooi op de herstel-verwarming pad.
5. Vervoer de muizen in hun oorspronkelijke kooien van de isolator naar de operatie kamer in een steriele zak geautoclaveerd.
6. Weeg de muis en naar het lichaamsgewicht inject subcutaan (sc) een oplossing met medetomidine en ketaminehydrochloride verdund in 0,9% steriele zoutoplossing voor de muis te verdoven, alsmede de spieren ontspannen (medetomidine 1 mg / kg; ketaminehydrochloride 75 mg / kg).
7. Verwijder de muis uit de kooi bij volledige narcose (binnen 1-2 minuten, geen teen-snuifje reflex na stimulatie)
8. Solliciteer ontharingscrème aan de linkerkant van de borst en de keel. Nadat een geschikte hoeveelheid tijd (ongeveer 2-5 minuten), veeg de losse haren met een met water vochtig doekje.
9. Plaats de muis op de operatie paneel in liggende positie. Vangezichtspunt van de chirurg de positie is verticaal, staart omlaag-head up.
10. Injecteren pijnstillende oplossing bij 0,1-0,2 ug / g verdund in steriele zoutoplossing (buprenorfine) in de achterste ledematen subcutaan en bedek het geschoren gebied met de aseptische oplossing povidonjood met behulp van een katoenen tip applicator.
11. Focus van de microscoop (2.5x objectief) op de keel gebied.

3. Chirurgische Voorwaarden

1. Met stompe schaar maak een middellijn ventrale incisie in de huid van ongeveer 0,5-1 cm lengte iets onder het ringkraakbeen. Scheid de huid bindweefsel naar de speekselklieren visualiseren.
2. Splits de speekselklieren op hun natuurlijke middellijn deling door gelijktijdig trekken elk deel zijwaarts met pincet en magnetische borst oprolmechanisme en de luchtpijp bloot.
3. Trek de tong voorzichtig naar de zijkant om het strottenhoofd bloot. Schuif de intubatie tube voorzichtig in de luchtpijp. De buis tip is zichtbaar door de weergegeven larynx en luchtpijp. Belangrijk, indien de buis in, maar niet duidelijk zichtbaar is in de slokdarm. Verwijderen en veranderen van de positie van de buis tip.
4. Sluit de buis naar de ventilatie machine. Stel het slagvolume bij 200 pl en 150 slag / min. Zet de ventilatie slangen op de operatie-paneel met een tape.
5. Met stompe schaar en pincet, maak een verticale staart aan het hoofd 1 - tot 1,5-cm lange incisie in de huid over de linker thorax gebied.
6. Maak de huid van het bindweefsel / spierlagen en de grote en kleine borstspieren zonder insnijdingen.
7. Voer thoracotomie tussen de derde en vierde ribben als volgt:
   1. Perforeren de intercostale spierlaag door te knijpen en krabben met kleine, ronde tang.
   2. Zodra de intercostale spierlaag is geperforeerd, plaatst de borst oprolmechanisme maximaal te openen de borstholte. De bovenste en middelste delen van de linker ventrikel (LV) met overliggende boezem (atrium) zijnnu zichtbaar.
8. Bereid een precisie spuit met cellen. De spuit moet in staat zijn tot een bedrag van volume van 10 ul leveren voor elke injectie. Wierp een 30 G naald aan het uiteinde van de spuit.
9. Bevestig met tape een klein plastic canule (van een Introcan-W 20 G) op de naald, waardoor blootgesteld slechts 1 mm inclusief de open uiteinde van de naald. Hierdoor wordt voorkomen dat de naald perforeren de gehele linker ventriculaire wand en het injecteren van de cellen in de linker ventrikel holte.
10. Met behulp van een 5x doelstelling visualiseren deze vergroting het linker ventrikel en injecteer de cellen in de linker ventriculaire wand in 5 verschillende locaties (elke injectie staat 10 ul in totaal 106 cellen geïnjecteerd). Als de injectie is geslaagd, wordt een wit gebied en de afwezigheid van grote terugslag van de cellen zichtbaar zijn (als de injectie niet succesvol was, zou het dier uit de functionele analyse worden uitgesloten).
11. Verwijder het oprolmechanisme. Sluit de thoraxwand by omsluiten de twee afzonderlijke ribben met twee steken van 6-0 zijden hechtdraad.
12. Hydrateren de borstspieren en de huid met een wattenstaafje gedrenkt in PBS 1x en voorzichtig zet de spieren terug in de oorspronkelijke positie met de tang.
13. Sluit de huid met 3-4 steken van 6-0 zijden hechtdraad. Hecht de keel incisie met 2-3 steken om de huid te sluiten.
14. Injecteer atipamezol (1 mg / kg eindconcentratie) aan de verdovende effecten terug.
15. Zodra de muis begint zelfstandig ademen, haal de buis van de luchtpijp en zet de muis op de rechterzijde. De muizen zullen aantrekken binnen minuten.
16. Wanneer de muis begint te draaien en lopen, plaats deze in de warme herstel kooi (kleine IVC kooi met gesloten gefilterd top) voor een uur.
17. Laat de dieren 's nachts in een gecontroleerde verwarmde doos (37 ° C).
18. Vul een schaaltje met water en pellet voedsel om herstel te ondersteunen tijdens de eerste 2 dagen na de operatie.

4. Na de ingreep Analyses

Tien harten geïnjecteerd met cellen en 10 controle niet geïnjecteerd harten zijn histologisch als volgt geanalyseerd:

1. Voer analyse van de geënte cellen 1 week na de injectie (Figuren 1 en 3).
   1. Na euthanasie door overdosis isofluraan, perfuseren de harten met 20 ml 4% paraformaldehyde (PFA) om het weefsel vast. Dehydrateer vaste weefsel in toenemende percentages ethanol (70-100%) en inbedden in paraffine blokken.
   2. Sectie van de harten in paraffine met een microtoom op 5 micrometer en vlek met hematoxyline en eosine voor morfologische analyse.
   3. Visualiseer bindweefsel door Masson Trichrome vlek.
   4. Analyseer de beelden onder een dia scanner microscoop (figuren 1A, 2A, 3A, 3B en 3C) en visualiseer het gehele hart in korte as bekijken met behulp van een digitale dia scanner microscoop (Figures 1B en 1C).
2. Na de bovenstaande analyse, deparaffinize het hartweefsel in xyleen, hydrateren door onderdompeling specimens afnemende percentages ethanol (100% water) en een werkwijze voor Scanning Electron Microscopy (SEM) als volgt:
   1. Incubeer gedeparaffineerd blokken met 1% looizuur in 0,1 M fosfaatbuffer gedurende 1 uur.
   2. Dehydrateer exemplaren in toenemende percentages ethanol (25-100%).
   3. Droge monsters met HMDS (hexamethyldisilazaan).
   4. Monteer de specimens op Stubbs met Acheson Zilveren Dag en smeer ze met goud-palladium.
   5. Bekijk monsters in een analytische scanning elektronenmicroscoop (Figuur 2B).

Resultaten

Geïnjecteerd HEK293 cellen, die onderscheiden van de hartcellen door hun verschillende morfologie (figuur 1) zijn, met een geplaveide vorm opzichte van de langwerpige cardiomyocyten (Figuur 1A). HEK293 cellen waren meer reactief naar hematoxylin kleurstof (blauw) vergeleken met hartspiercellen (roze kleur), waarschijnlijk vanwege hun toegenomen nucleaire inhoud (figuur 1A). Om verder te onderscheiden van de geïnjecteerde cellen van het gastheerweefsel werden HEK293 cell...

Discussie

In dit manuscript, hebben we laten zien hoe intramyocardiale injectie van cellen uit te voeren in muizen harten. Als bewijs van deze methode, hebben we gebruik gemaakt HEK293 cellen. Het is belangrijk te benadrukken dat HEK293 cellen niet worden gebruikt in een celtherapie studie en de vaststellingen van dit manuscript zijn niet geschikt voor directe vertaling van een therapeutische benadering. Het feit dat HEK293 cellen niet contractiele cellen en niet transdifferentiëren in andere celtypen richt de aandacht op technis...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Isolator	Pfi systems		Offerte nodig
Heating Pad	Vet Tech Solutions	HE006	Voor kleine dieren
Medetomidine	National Veterinary Service		Dierartsenrecept is noodzakelijk
Ketamine hydrochloride	National Veterinary Service		Dierartsenrecept is noodzakelijk
Atipamezole	National Veterinary Service		Dierartsenrecept is noodzakelijk
Haarverwijderingscrème	Commerciële winkels
Buprenorfine	NVS		Dierartsenrecept is noodzakelijk
Leica MZFLIII microscoop	Leica	Model S6E	Met draaibare arm stand TS0
Hamamatsu Nanozoomer digitale diascanner	Hamamatsu	RS-serie
Scanning Electron Microscope	Jeol	JSM-6610
Blunt schaar	FST	14084-09
Minivent	Harvard Apparatus	73-0043	Inclusief kleine Y-adapter (73-0027) en intubatiecannula (73-2844)
Pincet	FST	11052-10
Retractiesysteem	FST	18200-20	Kit voor dieren tot 200 g
30 G 12 mm; ½ inch	BBraun	A210	Fijn geel
Microliter spuit	ESSLAB	81201	Omvat ook een Hamilton herhaalde dispenser PB 600-1 Catalogusnummer 83700
6-0 Zijde draad	Ethicon	W1614T